Egfr基因检测探针及其制备方法和试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术，特别是涉及EGFR基因检测探针及其制备方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 肺癌是目前的研究热点，但检测热点主要集中在EGFR基因突变位点的检测，其在 小分子TKI靶向治疗方面有潜在价值。但对于一些大分子单克隆抗体药物，如西妥昔单抗 等，FISH检测EGFR拷贝数变化更具有参考价值。现在的临床研究也发现对于EGFR突变和 EGFR扩增是一个部分重叠又独立的两个靶标，评价EGFR扩增能够有效预测患者的总生存， 在临床用药方面也具有积极意义。
[0003] 焚光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization FISH)是20世纪80年代末 期在原有的放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这 项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、 人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。FISH的基本原理是用已知的标 记核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可 被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以 探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位 杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因 此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。
[0004] 杂交所用的探针大致可以分类三类：1)染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫 星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强， 易于检测；2)全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上 极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得;3) 特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。
[0005] 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记 DNA探针，杂交之后用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和 素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp左右的片段。而直接 标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针 时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，临床使用方便。
[0006] 而目前对于EGFR基因 FISH方法检测，还缺少特异性高的检测试剂盒。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一是提供一种EGFR基因检测探针及其制备方法，所制备的探针可 用于检测EGFR基因状态，即检测EGFR基因的指拷贝数变化，具有很好的特异性。
[0008] 实现上述目的的技术方案如下。
[0009] -种EGFR基因检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0010] (1)选取 BAC 克隆为 RP11-74806、RP11-164G7、RP11-781C22、RP11-17J15 中至少一 种，或选取 BAC 克隆为 〇1)-2086?7、1^11-38165、〇1)-2343815中的至少一种；
[0011] (2)对克隆分别提取质粒，得到质粒DNA，定量；
[0012] (3)用荧光素标记质粒DNA，不同来源的质粒DNA所标记的荧光素相同，即得。
[0013] 在其中一个实施例中，所述BAC克隆为RP11-74806、RP11-164G7、RP11-781C22和 RP1H7J15。
[0014] 在其中一个实施例中，所述BAC克隆为CTD-2086F7、RP11-381G5和CTD-2343B15。
[0015] 在其中一个实施例中，标记荧光素选择本领域已知的荧光染料，优选地，荧光素为 Alexa Flu〇l.?488、FITC、Alexa Flu〇r?555、Rhodamine、Texas Red、pacific blue?、 DEAC〇
[0016] 在其中一个实施例中，基因探针的标记可以采用现有技术中的方法将相应荧光素 标记至双链核酸上，所述方法包括但不限于：随机引物法、切口平移等，标记基因探针可以 使用市售的缺口平移标记试剂盒和/或随机引物标记试剂盒，优选abbott和/或Roche公司 的Nick Translation Kit。本发明步骤(3)优选采用随机引物法、切口平移法对质粒DNA进 行荧光素标记。
[0017] 本发明的另一目的是提供一种EGFR基因检测试剂盒。
[0018] 实现该目的技术方案如下。
[0019] -种EGFR基因检测试剂盒，包括有上述EGFR基因检测探针。
[0020] 在其中一个实施例中，包括有用于内控的7号染色体鉴别探针(CSP7)探针，该鉴别 探针与EGFR基因检测探针标记的荧光素的颜色不相同。
[0021] 在其中一个实施例中，还包括有用于封闭重复序列的COT Human DNA，和DAPI复染 剂。
[0022]本发明具有以下有益效果：
[0023] 1 .本发明通过筛选到最优的EGFR基因检测探针及其组合，采用F I SH (Fluorescence In-Situ Hybridization)方法对EGFR基因拷贝数检测，信号计数行准确、 快速，且结果的重复性好;补充了临床中EGFR突变检测的不足，有利于筛选更多受益于靶向 药物的患者，提高肺癌患者生存率和总生存期。
[0024] 2.通过本发明所述的EGFR试剂盒，从基因水平了解EGFR状态改变，多种信号类型 表现出实体组织的肿瘤细胞遗传多样性，可以实现在肿瘤生物学、细胞遗传学等领域的应 用，有助综合评价各分子标志物，辅助肺癌临床靶向治疗用药及治疗方案选择。
【附图说明】
[0025] 图1为是实施例1中检测探针序列的示意图。
[0026] 图2是实施例1中人外周血培养细胞片FISH检测结果图。
[0027] 图3为实施例3中EGFR基因检测基因扩增表现形式图。
[0028]图4为实施例4中肺癌组织样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为2R2G，EGFR 基因未发生扩增。
[0029]图5为实施例4中肺癌组织样本FISH检测结果图，其中，检测信号类型为6-12R2G， EGFR基因扩增。
【具体实施方式】
[0030] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不 同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本 发明的公开内容的理解更加透彻全面。
[0031] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等 人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所 述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售 产品。
[0032]除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域 的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实 施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语"和/或"包括一个或多个相关的所列 项目的任意的和所有的组合。
[0033] 实施例1 EGFR基因检测探针的制备
[0034] 本实施所述EGFR检测探针的制备方法，包括以下步骤：
[0035] 挑选包含目的基因 EGFR及两端序列的克隆，如图1所示。
[0036] GSPEGFR包括两组，分别包括探针组1:第一探针、第二探针、第三探针和第四探针； 探针组2:第一探针、第二探针和第三探针，具体如下表，其购买于InvitrogenRPl 1BAC及CTD BAC克隆库。以下分两组检测探针分别制备。
[0037] EGFR chr7:55,086,725-55,275,031,188,307bp
[0038] 第一组
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