双歧杆菌的实时荧光pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物工程领域，具体地说，是关于一种食品中双歧杆菌的实时荧光PCR 检测方法。
【背景技术】
[0002] 双歧杆菌是一类存在于人体中非常重要的益生菌群，是人体健康的重要指标之 一，于1899年首先在母乳喂养的健康婴儿粪便中发现并分离出来的专性厌氧菌。研究证实 双歧杆菌具有平衡肠道菌群、降胆固醇、延缓衰老及抗肿瘤等生理功能。目前，有关双歧杆 菌的微生态制剂的研究已成为一大热点，并广泛应用于食品、保健和医疗等领域。
[0003] GB 4789.34-2012食品安全国家标准规定了双歧杆菌的检验鉴定标准，该标准利 用传统培养基进行细菌形态和生化鉴定，并结合气相色谱法测定双歧杆菌的有机酸代谢产 物，但此方法耗时耗力，难以在实际检测中推广，不能充分满足对含有双歧杆菌食品中双歧 杆菌溯源和符合性的执法检验和整治监管的需要。因此有必要建立一种准确客观的检测双 歧杆菌的新方法。
【发明内容】
[0004] 本发明首要目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，以克服现有技 术所存在的上述缺点和不足。本发明的第二个目的在于提供一种检测试剂盒，以及检测试 剂盒的应用。本发明的第三个目的在于提供一种双歧杆菌的实时荧光PCR的引物对和探针。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 作为本发明的第一个方面，一种双歧杆菌的实时荧光PCR检测方法，该方法包括以 下步骤：
[0007] 步骤一：以双歧杆菌标准菌株的DNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，获得PCR扩增 产物；
[0008] 步骤二:检测扩增产物的荧光信号；
[0009] 其中，用于PCR扩增的反应体系中含有扩增双歧杆菌的特异性引物对和双歧杆菌 的特异性探针，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所 示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0010] 根据本发明，所述PCR扩增的条件如下：
[0011]反应体系为：2X HR qPCR Master Mix 12.5yL，引物各 1.25yL，探针 0.625yL， ddH2〇 7.375yL，DNA模板2yL;
[0012]反应的条件为：95°(3,511^11;95°(3，1〇8 58°(3,458,45个循环。
[0013]作为本发明的第二个方面，一种双歧杆菌的检测试剂盒，含有以下试剂：
[0014] (a)扩增双歧杆菌的特异性引物对；
[0015] (b)双歧杆菌的特异性探针；
[0016] 其中，所述扩增双歧杆菌的特异性引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID N0.2所 示，所述双歧杆菌的特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017] 根据本发明，所述检测试剂盒还包括：
[0018] (c)标准参照物。
[0019] 本发明的检测试剂盒可用于检测食品中添加的双歧杆菌。
[0020] 作为本发明的第三个方面，所述特异性引物对的序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.2所示，所述特异性探针的序列如SEQ ID NO.3所示。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 1、可快速、简便地检测食品中是否存在双歧杆菌；
[0023] 2、其特异性好，且灵敏度高，特别适用于各类益生菌发酵乳、婴幼儿配方奶粉等食 品中是否按标识添加双歧杆菌的检测。
【附图说明】
[0024]图1为实时荧光PCR引物特异性试验扩增曲线图。
[0025] 图2为实时荧光PCR灵敏度试验扩增曲线图。
[0026] 图3为实时荧光PCR检出限试验扩增曲线图。
[0027] 图4(A)和图4(B)为25个标示含双歧杆菌食品的实时荧光PCR扩增曲线图。
【具体实施方式】
[0028] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本 发明而非用于限定本发明的范围。本发明的实验材料和仪器如下：
[0029] (1)标签标识含有双歧杆菌酸奶、发酵乳、婴幼儿配方奶粉和食品均为市售产品。
[0030] (2)8株双歧杆菌标准菌株。其中：动物双歧杆菌BB-12由上海市质量监督检验技术 研究院提供；乳双歧杆菌HN019、乳双歧杆菌Bi-07由丹尼克斯公司提供；青春双歧杆菌 CICC6070、婴儿双歧杆菌CICC6069、长双歧杆菌CICC6186、短双歧杆菌CICC6079和两歧双歧 杆菌CICC6071购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
[0031] (3)嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等13株乳酸菌，与双歧杆菌具有同 源性，以及大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌这三种可能存在于食品中的治病菌。所述 13株近源乳酸菌和3种食源性致病菌的来源详见表3。
[0032] (4)TianGen DP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒购自天根生物有限公司 (TIANGEN BI0TECH(BEIJING)C0.，LTD，Beijing，China)。
[0033] (6)引物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成(Huirui Biotechnology Co.， LTD，Shanghai，China)〇
[0034] (7)HR qPCR Master Mix(货号：SJ_2101B)试剂购自上海辉睿生物科技有限公司 (Huirui Biotechnology Co.,LTD,Shanghai ,China)〇
[0035] (8)试验相关仪器：紫外分光光度计Nanovue Plus(GE Healthcare，United Kingdom);实时荧光PCR仪ABI Viia7(Applied Biosystems Inc.，USA);实时荧光PCR仪ABI 7300(Applied Biosystems Inc.，USA);核酸蛋白分析仪;分析天平;离心机。
[0036]实施例1双歧杆菌等其它标准菌株DNA提取及酸奶、配方奶粉等食品中益生菌DNA 提取
[0037] (1)标准菌株培养物:取细菌培养液l-5mL，lOOOOrpm离心lmin，尽量洗净上清，保 留沉淀。
[0038] (2)酸奶等液体发酵乳：吸取lmL酸奶于2mL离心管，加入750yL去离子水、100yL 18%柠檬酸钠和50yL lmol/L氢氧化钠。4°C，12000r/min离心5min，弃上清，保留沉淀。 [0039] (3)配方奶粉等固体样品：称取5g样品于50mL离心管，加入20mL去离子水溶解样 品，再依次加入1〇1^18%朽1檬酸钠和1〇1111^11]1〇1凡氢氧化钠。4°〇，1200〇1'/111；[11离心15111；[11， 弃上清，保留沉淀。
[0040] (4)采用TianGen DP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒对双歧杆菌、嗜热链球菌等 其它标准菌株培养物DNA进行提取。
[0041 ] (5)采用TianGen DP302-02细菌基因组DNA提取试剂盒对益生菌发酵乳、婴儿配方 奶粉、益生菌固体饮料等其它食品中益生菌DNA进行提取。
[0042]上述（1)~（5)的DNA浓度采用紫外分光光度仪Nanovue Plus测定，模板量控制在 30ng/反应以上，0D260/280控制在1.8至2.0之间。
[0043] 实施例2引物对和探针的设计
[0044] (1)本实施例的引物对和探针的序列见表1:
[0045] 表1引物及探针序列
[0046]
[0047] (2