专利名称：荧光检测装置及荧光检测方法
技术领域：
本发明涉及一种接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理的荧光检测装置。另外，本发明涉及一种接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理的荧光检测方法。特别是，涉及一种适用于在医疗、生物领域应用的流式细胞仪等利用荧光色素发出的荧光进行细胞、 DNA、RNA等测量对象物的识别以进行测量对象物的分析等的分析装置的荧光检测装置。
背景技术：
应用于医疗、生物领域的流式细胞仪中，包括有接收测量对象物的荧光色素受到激光照射后发出的荧光以识别测量对象物种类的荧光检测装置。具体来说，在流式细胞仪中，用荧光试剂将浑浊液中的细胞、DNA、RNA、酶、蛋白等的活体物质进行标签化，且施加压力使测量对象物在以每秒大约IOm以内的速度在管道内流动的鞘液中流动，由此形成分层鞘流。通过向该流动中的测量对象物照射激光，由此接收测量对象物上附着的荧光色素发出的荧光，并将该荧光作为标签进行识别，由此特定分析对象物。该流式细胞仪例如能够测出DNA、RNA、酶、蛋白质等的细胞内的相对量，并在短时间内能够分析这些对象物的作用。另外，可使用通过荧光对特定类型的细胞或染色体进行特定、并仅在特定的细胞或染色体以活着的状态下短时间内进行分选收集的细胞分类器寸。例如，用流式细胞仪分析DNA等活体物质时，通过荧光试剂荧光色素预先附着在该活体物质上。而且，该活体物质通过与后述的微胶珠上附着的荧光色素不同的荧光色素标签化，并混合于包括在其表面上设置有羧基等特别的结构体、且直径为5 20 μ m的微胶珠的液体中。上述羧基等的结构体结合(耦合)于某个已知结构的活体物质。因此，当同时检测微胶珠发出的荧光和活体物质发出的荧光时，可知活体物质与微胶珠的结构体结合。由此，能够分析活体物质的特性。准备具有多种多样耦合用的结构体的多种微胶珠，在短时间内分析活体物质的特性需要非常多种类的荧光色素。专利文献1中记载了以下内容将微胶珠等作为测量对象物，向该测量对象物上照射用规定频率强度调制的激光，求出此时发出的荧光的荧光弛豫时间。不同种类的荧光色素其荧光弛豫时间不同，因此利用该荧光弛豫时间能够识别荧光种类并进一步识别测量对象物的种类。专利文献专利文献1 特开2006-2^698号公报
发明内容
在上述专利文献1中，即使荧光弛豫时间的基础上能够在短时间内高效率地识别荧光，但是荧光弛豫时间的测量精度并不一定很高。例如，测量对象物包括荧光弛豫时间超过20纳秒的比较长的微胶珠等时，测量精度将下降。 本发明的目的在于，提供一种能够提高荧光弛豫时间的测量精度的荧光检测装置和荧光检测方法。发明人进行了认真的研究，结果发现如果对激光进行强度调制的频率不同，通过该频率能够高精度地测量的测量对象物的荧光弛豫时间的范围也不同。即，测量对象物的荧光弛豫时间为宽范围时，通过不是用一个频率对激光进行强度调制，而是用多个频率对激光进行强度调制来能够提高测量精度。因此，本发明的荧光检测装置，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括激光光源部，向所述测量对象物照射激光；受光部，输出所述测量对象物受到所述激光照射后发出的荧光的荧光信号；光源控制部，生成将从所述激光光源部发射的激光强度用至少两个频率成分进行时间调制的调制信号；处理部，使用从所述受光部输出的荧光信号和所述调制信号，求出所述测量对象物的荧光的荧光弛豫时间，其中，所述处理部求出相对于所述至少两个频率成分的所述调制信号的所述荧光信号的相位滞后，利用所述相位滞后求出各频率成分的荧光弛豫时间， 通过对所述荧光弛豫时间进行加权平均来求出平均荧光弛豫时间。另外，本发明的荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括向所述测量对象物照射激光的工序；输出被所述激光照射的所述测量对象物发出的荧光的荧光信号的工序；生成用至少两个频率成分对所述激光强度进行时间调制的调制信号的工序；利用所述荧光信号和所述调制信号求出所述测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的工序，其中，求出所述荧光弛豫时间的工序包括求出相对于所述至少两个频率成分的所述调制信号的所述荧光信号的相位滞后的工序；利用所述相位滞后求出各频率的荧光弛豫时间的工序；通过对所述荧光弛豫时间进行加权平均而求出平均荧光弛豫时间的工序。根据本发明的荧光检测装置和荧光检测方法，能够提高荧光弛豫时间的测量精度。
图1为表示采用强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪的一个例的概略构成图；图2为表示用于强度调制激光的荧光检测装置的激光光源部的一个例的概略构成图；图3为表示用于强度调制激光的荧光检测装置的受光部的一个例的概略构成图；图4为表示用于强度调制激光的荧光检测装置的控制和处理部的一个例的概略构成图；图5为表示用于强度调制激光的荧光检测装置的分析装置的一个例的概略构成图；图6为表示相对于荧光弛豫时间的相位滞后的变化量的图。附图标记说明10 流式细胞仪
12 样品20 信号处理装置22 激光光源部23 光源24a、24b 透镜系统25,26 受光部27:光电转换器28 控制和处理部30 管道32:回收容器34 激光驱动器40 信号生成部42 信号处理部44 控制器46a、46b 振荡器48a、48b、48d 功率分配器(POWER SPLITTER)48c 功率分配器(POWER DIVIDER)50a、50b、50c、54、55、64 :放大器58、59: IQ 混频器60 系统控制器62 低通滤波器66 :A/D 转换器80 分析装置82 =CPU84 存储器86 相位滞后获取单元88 荧光弛豫时间获取单元90 权重系数获取单元92 荧光弛豫时间获取单元94:输入输出端口100 显示器
具体实施例方式以下，通过实施方式，对适用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪进行说明。<第一实施方式>(流式细胞仪的整体构成)首先，结合图1说明本实施方式的流式细胞仪的整体构成。图1为表示采用本发明的强度调制激光的荧光检测装置的流式细胞仪10的一个例的概略构成图。
流式细胞仪10包括信号处理装置20、分析装置(计算机)80。当作为测量对象物的微胶珠或细胞等样品12被激光照射时，信号处理装置20检测样品12中赋予的荧光色素发出的荧光的荧光信号并对其进行信号处理。分析装置80根据信号处理装置20中所得到的处理结果，进行样品12中的测量对象物的分析。如后述，信号处理装置20包括激光光源部22、受光部25、26、控制和处理部观、管道30。控制和处理部观包括信号生成部40、信号处理部42、控制器44。信号生成部40 对激光光源部22发射的激光进行强度调制。另外，信号处理部42识别来自样品12的荧光信号。另外，控制器44管理流式细胞仪10的整个动作。在管道30中，样品12含在形成高速流动的鞘液中一起流动，并形成分层鞘流。该流动例如流路直径为ΙΟΟμπι，流速为1 IOm/秒。另外，将微胶珠作为样品12使用时，微胶珠的球径为几μ m 30 μ m。在管道30的出口处设置有回收容器32。在流式细胞仪10中，也可以配置用来在短时间内通过激光照射分离样品12中的特定细胞等的活体物质的细胞分类器，以将其物质分别分离在各回收容器中。激光光源部22发射以规定频率强度调制的激光。在激光光源部22中，透镜系统按照在管道30中的规定位置聚焦的方式设置。在激光聚焦的位置(测量点)上测量样品 12。(激光光源部)接着，结合图2说明激光光源部22。图2为表示激光光源部22构成的一个例的概略构成图。激光光源部22包括光源23、透镜系统Ma、激光驱动器34。光源23发射规定强度的CW(连续波)激光，且对该CW激光的强度进行调制后发射激光。透镜系统2 使从光源 23发射的激光聚焦在管道30中的测量点上。激光驱动器34驱动光源23。发射激光的光源23例如为半导体激光器。激光的输出功率例如约为5 100mW。 激光波长例如为350nm 800nm的可见光区域。激光驱动器34连接于控制和处理部28。另外，激光驱动器34生成利用由至少两个频率构成的调制信号对激光进行强度调制所需的驱动信号，并将该驱动信号供给到光源 23。被激光激发的荧光色素附着在活体物质或微胶珠等样品12 (测量对象物)上。样品12通过管道30的几μ秒 几10μ秒期间，样品12在测量点上受到激光照射而发出荧光。此时，激光被两个频率强度调制后被发射出。(受光部)回到图1，受光部25按照夹着管道30与激光光源部22相对而置的方式进行配置。 受光部25包括光电转换器，通过在测量点上通过的样品12使激光发生前向散射，由此输出样品12正通过测量点情况的检测信号。从该受光部25输出的信号供给到控制和处理部观。从受光部25输出的信号在控制和处理部观中用作通知样品12通过管道30测量点的时间的触发信号。另一方面，受光部沈配置在相对于从激光光源部22发射的激光发射方向垂直的方向，且相对于管道30中样品12的移动方向垂直的方向。受光部沈包括光电转换器，以用来接收样品12在测量点被激光照射后发出的荧光。在此，结合图3说明受光部26的概略构成。图3为表示受光部26的一个例的概略构成图。如图3所示，受光部26包括透镜系统24b、光电转换器27。透镜系统24b使从样品12发出的荧光信号聚焦。另外，透镜系统24b按照使入射至受光部26的荧光在光电转换器27的受光面上聚焦的方式构成。光电转换器27包括例如光电倍增管，在光电面接收的光转换成电信号。通过光电转换器27转换的电信号(荧光信号)供给到控制和处理部28。(控制和处理部)接着，结合图4说明控制和处理部28的概略构成。图4为表示控制和处理部28 的一个例的概略构成图。控制和处理部28包括信号生成部40、信号处理部42、控制器44。 生成调制激光强度的调制信号的光源控制部通过信号生成部40和控制器44形成。信号生成部40包括振荡器46a、46b、功率分配器48a、48b、功率分配器48c、放大器 50a、50b、50c。信号生成部40生成调制信号，并将调制信号供给到激光光源部22的激光驱动器34，而且将调制信号供给到信号处理部42。如后述，向信号处理部42供给调制信号是用作对从光电转换器27输出的荧光信号进行检波的参照信号。振荡器46a、46b输出分别具有不同频率的正弦波信号。正弦波信号的频率例如设定成1 50MHz。从振荡器46a输出的频率(角频率(O1)的正弦波信号通过功率分配器 48a分配到功率分配器48c和放大器50a。从振荡器46b输出的频率f2 (角频率ω 2)的正弦波信号通过功率分配器48b分配到功率分配器48c和放大器50b。从功率分配器48a、48b 分配到功率分配器48c的正弦波信号在功率分配器48c中合成，由此生成调制信号。在功率分配器48c中生成的调制信号在放大器50c放大后供给到激光驱动器34。信号处理部42利用从光电转换器27输出的荧光信号提取关于微胶珠等测量对象物受到激光照射后发出的荧光的相位滞后的信息。信号处理部42包括功率分配器48d、放大器54、55、IQ混频器58,590功率分配器48d将从光电转换器27输出的荧光信号分配到放大器54、55。放大器 54、55放大从功率分配器48d分配的荧光信号，分别供给到IQ混频器58、59。在IQ混频器 58中，作为参照信号被供给从放大器50a供给的频率f\的正弦波信号。另外，在IQ混频器 59中，作为参照信号被供给从放大器50b供给的频率f2的正弦波信号。IQ混频器58、59是将从光电转换器27供给的荧光信号与将作为参照信号的从信号生成部40供给的频率f\、f2的正弦波信号合成的装置。具体来说，各IQ混频器58、59将参照信号和荧光信号(RF信号)相乘，由此计算出包括荧光信号的cos成分和高频率成分的处理信号。另外，各IQ混频器58、59将参照信号的相位90度相移的信号与荧光信号相乘，由此计算出包括荧光信号的sin成分和高频率成分的处理信号。包括cos成分的处理 信号和包括sin成分的处理信号被供给到控制器44。控制器44包括系统控制器60、低通滤波器62、放大器64、A/D转换器66。系统控制器60下达用于控制各部分的动作的指令，而且管理流式细胞仪10的整个动作。另外，系统控制器60按照在信号生成部40的振荡器46a、46b上生成规定频率的正弦波信号的方式控制。低通滤波器62从在信号处理部42中运算的cos成分、sin成分和高频率成分加在一起的处理信号去除高频率成分，由此得到两个频率f\、f2的cos成分、sin成分的处理信号。放大器64放大cos成分、sin成分的处理信号。A/D转换器66抽样被放大的处理信号。(分析装置)接着，结合图5说明分析装置(计算机)80的概略构成。图5为表示分析装置(计算机)80的一个例的概略构成图。分析装置80按照在计算机上启动规定程序的方式构成。 分析装置80除了包括CPU82、存储器84、输入输出端口 94之外，还包括通过启动软件来形成的相位滞后获取单元86、荧光弛豫时间获取单元88、权重系数获取单元90、平均荧光弛豫时间获取单元92。另外，分析装置80与显示器100连接。CPU82是设置在计算机上的运算处理器。CPU82实质地实行相位滞后获取单元86、 荧光弛豫时间获取单元88、权重系数获取单元90、平均荧光弛豫时间获取单元92的各种计
笪弁。存储器84包括储存通过在计算机上实行来形成相位滞后获取单元86、荧光弛豫时间获取单元88、权重系数获取单元90、平均荧光弛豫时间获取单元92的程序的硬盘或 ROM、以及存储从通过这些单元计算出的处理结果或输入输出端口 94供给的数据的RAM。输入输出端口 94接收从控制器44供给的、分别对应于至少两个频率成分f\、f2的 cos成分、Sin成分的检测值的输入。另外，输入输出端口 94将在各单元完成的处理结果信息输出在显示器100上。显示器100显示在各个单元求出的荧光的相位滞后信息、相位弛豫时间、权重系数、平均荧光弛豫时间等的处理结果值。相位滞后获取单元86根据从控制器44供给的、分别对应于至少两个频率成分的 cos成分、Sin成分的检测值，求出针对频率成分f\ (角频率)的相位滞后θ ω1、针对频率成分4 (角频率)的相位滞后θω2。荧光弛豫时间获取单元88根据相位滞后获取单元86求出的相位滞后θ ω1、θ ω2， 求出荧光弛豫时间τ ( θ ω1)、τ ( θ ω2)。权重系数获取单元90相对于荧光弛豫时间获取单元88求出的荧光弛豫时间 τ (θ ω1)、τ (θ ω2)求出进行加权的权重系数πι(θ ω1)、π!(θ ω2)。权重系数为0 1的值。平均荧光弛豫时间获取单元92根据荧光弛豫时间获取单元88求出的荧光弛豫时间τ(θω1)、τ (θ ω2)、权重系数获取单元90求出的权重系数πι(θ ω1)、π!(θ ω2)求出平均荧光弛豫时间rave。如此地，由于利用分别对应于至少两个频率成分f\、f2的荧光信号的检测值，能够求出测量精度高的荧光弛豫时间(上述的平均荧光弛豫时间τ _)。而且，通过利用该平均荧光弛豫时间τ _识别荧光色素来特定样品12的种类。以下，关于通过本发明测量精度提高的情况，进行详细的说明。通常，相对于调制激光强度的调制信号的荧光信号的相位滞后θ依赖于荧光色素发出的荧光的荧光弛豫时间。例如，表示一次弛豫过程时，cos成分和sin成分由下述式 (1)、(2)表示。[数1]
权利要求
1.一种荧光检测装置，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括激光光源部，向所述测量对象物照射激光；受光部，输出所述测量对象物受到所述激光照射后发出的荧光的荧光信号；光源控制部，生成将从所述激光光源部发射的激光强度用至少两个频率成分进行时间调制的调制信号；处理部，使用从所述受光部输出的荧光信号和所述调制信号，求出所述测量对象物的荧光的荧光弛豫时间，其中，所述处理部求出相对于所述至少两个频率成分的所述调制信号的所述荧光信号的相位滞后，利用所述相位滞后求出各频率成分的荧光弛豫时间，通过对所述荧光弛豫时间进行加权平均来求出平均荧光弛豫时间。
2.根据权利要求1所述的荧光检测装置，其特征在于所述调制信号是对至少两个频率信号进行合成的信号。
3.根据权利要求1或2所述的荧光检测装置，其特征在于所述处理部利用相对于所述至少两个频率成分的所述相位滞后的荧光弛豫时间的变化量的大小所对应的权重系数， 求出所述平均荧光弛豫时间。
4.根据权利要求1至3任一项所述的荧光检测装置，其特征在于在所述至少两个频率的一个频率值为其它频率值的两倍以上。
5.一种荧光检测方法，接收测量对象物受到激光照射后发出的荧光，并对此时所得到的荧光信号进行信号处理，其特征在于，包括向所述测量对象物照射激光的工序；输出被所述激光照射的所述测量对象物发出的荧光的荧光信号的工序；生成用至少两个频率成分对所述激光强度进行时间调制的调制信号的工序；利用所述荧光信号和所述调制信号求出所述测量对象物的荧光的荧光弛豫时间的工序，其中，求出所述荧光弛豫时间的工序包括求出相对于所述至少两个频率成分的所述调制信号的所述荧光信号的相位滞后的工序；利用所述相位滞后求出各频率的荧光弛豫时间的工序；通过对所述荧光弛豫时间进行加权平均而求出平均荧光弛豫时间的工序。
6.根据权利要求5所述的荧光检测方法，其特征在于在生成所述调制信号的工序中， 对所述至少两个频率成分的信号进行合成。
7.根据权利要求5或6所述的荧光检测方法，其特征在于在求出所述荧光弛豫时间的工序中，利用相对于所述至少两个频率成分的所述相位滞后的荧光弛豫时间的变化量的大小所对应的权重系数，求出所述平均荧光弛豫时间。
8.根据权利要求5至7任一项所述的荧光检测方法，其特征在于所述至少两个频率中的一个频率值为其它频率值的两倍以上。
全文摘要
本发明提供一种能够提高荧光弛豫时间的测量精度的荧光检测装置及荧光检测方法，该装置包括激光光源部，向所述测量对象物照射激光；受光部，输出测量对象物受到激光照射后发出的荧光的荧光信号；光源控制部，生成将从激光光源部发射的激光强度用至少两个频率成分进行时间调制的调制信号；处理部，使用从受光部输出的荧光信号和调制信号，求出测量对象物的荧光的荧光弛豫时间，其中，处理部求出相对于至少两个频率成分的调制信号的荧光信号的相位滞后，利用相位滞后求出各频率成分的荧光弛豫时间，通过对荧光弛豫时间进行加权平均来求出平均荧光弛豫时间。
文档编号G01N21/64GK102292630SQ20108000546
公开日2011年12月21日 申请日期2010年1月25日 优先权日2009年2月10日
发明者林弘能 申请人:三井造船株式会社