一种a型轮状病毒的荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 轮状病毒，属于呼肠孤病毒科，是一种由11条双链RNA片段构成的无包膜病毒，外 层由3层蛋白壳包被(外衣壳，内衣壳，核衣壳)。轮状病毒的发病遍及全球各地，他是导致 全球婴幼儿腹泻和死亡率最高的病原体。保守估计，截止到2008年，五岁以下的婴幼儿中， 每年因轮状病毒引起的死亡接近453000,其中绝大多数的在发展中国家。轮状病毒总共有 七个种，以英文字母编号，A、B、C、D、E、F与G。其中，A种是最为常见的，而超过90%的人类 轮状病毒感染案例也都是该种造成的。
[0003] 轮状病毒颗粒共由六个病毒蛋白（viralprotein，VP)构成。这些"结构性"的蛋 白质分别被称为VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7。除了结构性蛋白之外，还有六个非结构性 蛋白质（nonstructuralprotein，NSP)，这六个非结构蛋白仅仅在轮状病毒感染的细胞中 制造，而没有构成病毒的结构。这六个非结构性蛋白分别称为NSP1、NSP2、NSP3、NSP4、NSP5 与NSP6。其中vp6蛋白由第6号基因编码，占编码病毒蛋白总量的51%，在不同血清型间具 有高度保守性（87%-99%)，是内衣壳的主要组成成分。Vp6蛋白不仅具有转录酶的活性，在 轮状病毒的复制过程中发挥巨大作用，而且决定了轮状病毒种的特异性，根据RV抗原VP6 的差异可将其分成七个种。VP6蛋白在轮状病毒感染的诊断上是一个重要的检测指标，且在 疫苗的开发上具有潜在的价值。
[0004] 目前，轮状病毒的主要检测方法包括病变检测、电镜观察、ELISA、PAGE电泳以及 RT-PCR。由于某些RV的基因型病变不明显或非致细胞病变，从而使得病变检测方法的检出 率受到影响；ELISA受到主观因素影响较大，出现假阳性概率较大；PAGE的灵敏性不高且不 能保证RNA的完整性；电镜方法实验操作繁琐且灵敏度不高；常规的RT-PCR易污染且不能 定量。荧光定量PCR方法可以有效地克服以上方法的不足，具有速度快、特异性强、灵敏性 高、重复性好的特点。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种A型轮状病毒的荧光定量PCR检 测方法；本发明的方法具有特异性强、灵敏度高、重复性好假阳性低等特点。
[0006] 为了实现上述目的，本发明技术方案如下： (1) 将轮状病毒的RNA逆转录为cDNA，以逆转录的cDNA为模板，采用如下外围引物扩 增基因片段：上游引物：5' -AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC-3'，下游引物：5'-AGGGAAIT CTAATGGAAGCTACCGTGAAA-3' ； (2) 将基因片段构建重组质粒并进行纯化，纯化后的克隆载体体外转录酶进行体外转 录，并对转录完成的RNA进行RNA纯化并测其OD值，并根据如下公式换算成RNA拷贝数： 拷贝数（copise/ul)=质粒浓度（g/yI)X阿式常数/RNA分子量；阿式常数为6. 02X1023， RNA分子量=一个碱基的分子量（340)X重组RNA总长度（bp); (3) 将已知拷贝数的RNA做十倍梯度稀释，配制拷贝数为103-109C〇pieS /iU的溶液， 在荧光定量PCR反应仪中进行实时PCR反应，建立了Ct/LogCopynumber工作曲线； (4) 收集临床轮状病毒粪便样本，并提取样本的RNA; (5) 按照常规荧光定量PCR检测方法检测样品中轮状病毒的含量，其中定量检测的引 物和探针为： 上游引物：5' -TTATTAITTCAGITGATGCGTCCA-3'， 下游引物：5 ' -TGCTAACAGAGirTCAITTGCG-3 '， 探针：5' - (FAM)TCCACAAGCACAACCTTTTCAGCACC(TAMRA)-3'。
[0007]荧光定量PCR检测采用试剂盒为OneSt印PrimeScriptRTPCRKit(TaKaRa， RR064A)，反应体系为： ExTaqHS 0. 4y1 PrimeScriptRTEnzymeMixII 0. 4yI ROXReferenceDyeII 0. 5yI 上游引物（IOyM) 0. 5yl 下游引物（IOyM) 0. 5Ii1 探针（5yM) 1.2yl 2 XOneStepRT-PCRBufferIIIIOyl RNaseFreedH20 I. 5yI 模板 5 yI 总体积 20yI 荧光定量PCR扩增条件为： 42°C5min;95°C10s;95°C5s，6(TC34s;45 个循环。
[0008] 本发明的优点和技术效果如下： PCR技术作为一种新兴的分子检测技术，通过实时监测荧光信号积累能够对未知样本 中病毒载量进行准确定量，不仅操作快捷简便，具有高度灵敏度和特异性，而且可防止传 统PCR普遍存在的污染问题，对临床样本进行快速、大批量检测，为RV的诊断、检疫、食品 安全检验和病原生物学、分子流行病学研究提供了一种新的方法。
【附图说明】
[0009] 图1为HRV-WA株型VP6外围基因片段RT-PCR电泳检测结果，其中M为Maker2000， "一"为阴性对照； 图2为不同退火温度下内围片段扩增电泳检测结果，其中M为Maker2000，"一"为阴性 对照； 图3为不同引物浓度下内围片段扩增电泳检测结果； 图4为不同探针浓度扩增曲线； 图5为以IO9-IO3拷贝数为模板建立的标准曲线； 图6为以轮状病毒、EV71病毒、柯萨奇病毒A16为模板建立的TaqManPCR方法特异性 分析曲线； 图7为TaqManPCR方法灵敏性分析曲线； 图8为组间重复性检测扩增曲线； 图9为临床样本检测结果。
【具体实施方式】
[0010] 实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按常规条件如Sambrook等，分子克 隆：实验室手册（NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件 或者按照制造厂商所建议的条件。
[0011] 实施例1 :以人轮状病毒（Rotavirus，购自武汉病毒所）VP6基因构建的RNA为标 准品的TagMan探针荧光定量PCR方法 1、对人轮状病毒vp6基因片段的克隆并测序 1. IPCR引物的设计和PCR扩增 PCR引物是根据GenBank中下载的不同亚型的轮状病毒核酸序列，通过MEGA6软件比 对，得到特异性保守序列，通过Primerpremier5. 0设计引物，引物由大连宝生物公司合 成，引物扩增长度为893bp; 外围上游引物：5' -AGGAAGCTTGTATGTATGGATGAAATGGC- 3'(305bp_325bp) 外围下游引物：5' -AGGGAATTCTAATGGAAGCTACCGTGAAA- 3'(1178bp-1197bp)； 以提取的人轮状病毒RNA为模板，一步法RT-PCR反应，10XOneSt印RNAPCRBuffer 5y1、Mgcl2 (25Mm) 10y1、dNTPMixture(各IOmM) 5y1、RNaseInhibitor(40U/yI) lyl、AMVRTaseXL(5U/yl)lyl、AMV-〇ptimizedTag(51]/^1)1以1、外围上游特异性引 物（20yM)IyI、外围下游特异性引物（20yM)IyI、轮状病毒总RNAlyI、RNaseFreedH20 24y1。以50y1反应体系，按以下件件进行RT-PCR反应：50°C30min、94°C2min;然后进行 45 个循环扩增 94°C30sec、54°C30sec、72°C2min;72°C5min。-20°C冰箱保存备用。扩 增产物大小为893bp，0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测（图1)。
[0012] I. 2PCR产物通过胶回收产物纯化，将目的片段与P⑶NA3.I+载体连接，将其转化 JM109感受态细胞，进行测序验证。
[0013] 2、TaqManPCR检测体系的建立 2. ITaqManPCR引物和探针的设计 根据重组质粒893bp的序列，利用Primerexpress. 3. 0设计引物和探针，目的片段长 165bp，片段序列如SEQIDN0:1所示。
[0014]内围上游引物：5' 一TTATTATTTCAGTTGATGCGTCCA-3'（891bp-914bp) 内围下游引物：5' 一TGCTAACAGAGITTCAITTG