测定人POT1基因rs1034794位点多态性的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及测定单核苷酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] SNP(单核苷酸多态性）是指单个核苷酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基 的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生倶来的遗传特征，不随环境发生变化， 也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
[0003] 基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起 源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史， 阐明物种进化关系。应用于考古学中以确定古人类遗传变异特征以及不同种群的亲缘关 系。2.研究多态与种群未缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身 高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可以用于疾病预防措施。通过研究人体 对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触， 保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出 现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物 侵害。4.药理学中可以用于药物选择以及剂量确定。通过多态检测可以判断患病个体对某 种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物以免除其毒性作用。通过判断个体对药物效 果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。
[0004] 端粒相关基因在保护端粒结构的完整性方面发挥着重要的作用。端粒保护蛋白 l(protectionoftelomeres1，P0T1)通过结合端粒末端的单链3'悬突来稳定端粒结构， 达到保护染色体末端的作用。POTl基因rsl034794位点多态，在人群中存在两种等位基因 A和T，形成三种POTl基因的基因型：AA型（人体基因组rsl034794多态位点的两个等位 基因碱基均为A)，AT型（人体基因组rsl034794多态位点的两个等位基因碱基分别为A和 T)和TT型（人体基因组rsl034794多态位点的两个等位基因碱基均为T)。
[0005] 聚合酶链式反应-限制性片断长度多态（PCR-RFLP)技术是一种快速、简便、准 确、低成本测定SNP(单核苷酸多态性）基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行 扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片 段长度，最终测定出SNP。POTl基因rsl034794多态位点采取PCR-RFLP技术进行检测，所 需内切酶为HpyOMV内切酶，其价格较昂贵，需要开发新的检测技术。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人POTl基因 rsl034794位点多态性的可靠手段。
[0007] 根据本发明的第一方面，提供了一种测定人POTl基因rsl034794位点多态性的方 法，包括：
[0008] 提供待测人基因组DNA;
[0009] 提供扩增人POTl基因rsl034794位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游 引物具有错配喊基A;
[0010] 以所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应以 获得含WATT片段的扩增产物，其中W为人POTl基因rsl034794位点上的待定碱基A或T;
[0011] 提供限制性内切酶；
[0012] 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切（反应）以获得相应的酶切产物；以 及
[0013] 根据所得酶切产物来确定人POTl基因rsl034794位点上的待定碱基W是A还是 T，
[0014] 其中，限制性内切酶为仅能够切开AATT片段与TATT片段之一的限制性内切酶。
[0015] 根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基A与多态位点W的 互补碱基之间相隔一个碱基T。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行得极 其顺利，不会出现酶切不充分等现象。并且，如此设置下游引物错配碱基使PCR反应进行顺 利，提高了PCR的灵敏度和特异度，这可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改变有 关。
[0016] 在本发明的具体实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与多态位点W 的互补碱基相邻。例如，下游引物末端可以是……TAAT等结构。
[0017] 在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可以采用仅能切开AATT片段的 MluCI或其同裂酶。这类MluCI酶价格低廉，能大大降低测定成本。
[0018] 根据本发明的实施例，所得酶切产物包括三种片段类型：具有总片段长度的未切 断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物以及切断后具有较短片段的扩增产物（较短 片段通常不能有效观测到）。通过观测（判断）酶切产物所包含的片段类型来确定人POTl 基因rsl034794位点上的待定碱基是A还是T。例如，在采用MluCI酶的情况下，根据总片 段和切断后较长片段这两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具 有总片段长度的未切断扩增产物，则待定碱基为T;如果观察到酶切产物只有一种具有较 长片段（小于总片段长度）的切断产物，则待定碱基为A;如果观察到上述二者，则待定碱 基既包括A又包括T。
[0019] 在本发明的一个实施例中，判断（或观测）酶切产物所包含的片段类型是通过凝 胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。这种情况下，优选参照图是扩增产物在 凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图 像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图 像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本发明采用的参照图是由合成 的102bp和58bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNA ladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的 这种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了 误判。酶切反应后，优选将酶切产物浓缩1~2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判 断准确性。
[0020] 在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物 的总片段长度在1〇〇至300bp之间，并且下游引物的片段长度至少为35bp，优选长度40~ 60bp(在该优选区间扩增反应尤其顺利充分），使得酶切切掉部分片段长度占总片段长度 的百分比超过20%。本发明的这种设计可以使得具有总片段长度的未切断扩增产物与切断 后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位置区别显著。但是，如果总片段过长，则电 泳位移将不明显；过短则图像会变得模糊一片，无法准确区分。下游引物的片段长度范围保 证了PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足现象。
[0021] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火温度的范围在55~70°C 之间，优选温度60~69°C(该温度可提高扩增反应的特异性），使得设计的PCR产物纯度 较高。本发明的这种设计可以使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳识别。但 是，如果温度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难以区分判断；如果温度过高，则影响 PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效果。
[0022] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在10~60s 之间，优选时间15~30s(该时间可提高扩增反应的效率和扩增产物的特异性），使得设计 的PCR反应时间较短，扩增产物纯度较高。本发明的这种设计可以使PCR扩增产物条带清 楚，无杂带出现，易于电泳识别，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，则特异条带不能 完全扩增而使得扩增产物较少，电泳后难以区分判断；如果时间过长，则增加非特异条带的 出现几率，出现杂带，影响观察效果。
[0023] 在本发明中，PCR反应成分可以包含DNA模板、上下游引物、Taq DNA polymerase (DNA聚合酶或亦可称作"Taq酶"）、缓冲液、Mg2+等。在本发明的优选实施例 中，PCR扩增反应中可以使用Taq DNA polymerase(DNA聚合酶）及其Taq Antibody。Taq Antibody是Taq DNA polymerase的单克隆抗体，其与Taq DNA polymerase结合后抑制DNA 聚合酶活性，两者的亲和力非常高，即使在65°C下仍然可以封闭Taq DNA polymerase的活 性，因此可以非常有效地抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，具 有极高的扩增灵敏度和特异性。Champagne Taq Antibody只需要在95°C加热30s即可完 全失活，释放Taq DNA polymerase活性，保证了后续PCR扩增反应能够顺利进行。
[0024]PCR反应中可以加入pH值为8. 1~8. 7的Tris-HCl缓冲液，在72°C延伸反应时 调整PCR溶液pH值在6. 8~7. 8之间，从而使Taq酶在偏碱性环境中更好地发挥活性。另 外，PCR溶液中还可以加入明胶（0.01%)以减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性 及保护作用，促进PCR反应。
[0025] 另外，PCR溶液中Mg2+浓度在1. 5~2. Ommol/L之间时，可以很好地控制PCR反应 的产率和特异性。
[0026] PCR反应引物的终浓度一般为0. 1~IyM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太 低则扩增产物太少。
[0027] 此外，PCR反应中还可以加入助溶剂二甲亚砜（DMSO)和硫酸铵以降低碱基错配水 平，提高富含GC模板的扩增效率。这可能与消除引物和模板的二级结构，降低DNA解链温 度使DNA变性完全有关。
[0028] 根据本发明的另一方面，提供了一种用于测定人POTl基因rsl034794位点多态性 的试剂盒，其包含：
[0029] 用于PCR扩增人POT 1基因rs 1034794位点附近序列的上游引物和下游引物，其中 下游引物具有错配碱基A以获得含WATT片段的扩增产物，其中W为人POTl基因rsl034794 位点上的待定