测定人TERT基因rs4975605位点多态性的方法及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及测定单核巧酸多态性的方法。
【背景技术】
[0002] SNP(单核巧酸多态性）是指单个核巧酸的改变引起的DNA序列变异，包括单碱基 的置换、插入和缺失等形式。基因多态性是个体与生俱来的遗传特征，不随环境发生变化， 也不是某种疾病特异或者非特异的临床表现，因此其应用并不存在诊断和治疗作用。
[0003] 基因多态性检测在遗传学领域和医学领域中应用广泛，举例如下：1.研究物种起 源和进化等遗传学现象。根据基因变异情况，获得生物大分子的信息，推断生物进化历史， 阐明物种进化关系。应用于考古学中W确定古人类遗传变异特征W及不同种群的亲缘关 系。2.研究多态与种群亲缘关系等遗传学研究。多态亦与各种人体特征密切相关，包括身 高、体重、肤色、相貌特征等等。3.在预防医学领域可W用于疾病预防措施。通过研究人体 对毒物的耐受性，发现易于对某种毒物发生毒性作用的个体，及时避免该个体与毒物接触， 保护该易感人群。例如，对准备从事接触苯等有机溶剂的人群进行多态检测，筛查出容易出 现血液毒性、神经毒性等反应的个体，令其远离苯等有机溶剂，保护此类易感人群免受毒物 侵害。4.药理学中可W用于药物选择W及剂量确定。通过多态检测可W判断患病个体对某 种药物毒副作用敏感，从而避免使用此种药物W免除其毒性作用。通过判断个体对药物效 果的反应程度确定药物剂量，减少药物用量及其副作用。 阳004] 真核生物体内的端粒酶（Telomerase)是一种逆转录酶，能够特异地延长端 粒DNA长度，从而调节细胞的分裂与增殖，端粒酶主要包括RNA组分（TelomeraseRNA Component,TERC)和逆转录酶组分（TelomeraseReverseTranscriptase,TERT),TERT是端 粒酶活性的限速成分。TERT基因rs4975605位点位于内含子区域，有研究表明该多态可能 影响TERT的功能。 阳0化]TERT基因rs4975605位点多态，在人群中存在两种等位基因A和C，形成=种TERT基因的基因型：AA型（人体基因组rs4975605多态位点的两个等位基因碱基均为A) ,AC型 (人体基因组rs4975605多态位点的两个等位基因碱基分别为A和C)和CC型（人体基因 组rs4975605多态位点的两个等位基因碱基均为C)。
[0006] 聚合酶链式反应-限制性片断长度多态（PCR-RFL巧技术是一种快速、简便、准 确、低成本测定SNP(单核巧酸多态性）基因型的经典方法。该方法通过引物来对模板进行 扩增反应，形成足够数量和稳定的扩增产物，通过对扩增产物的酶切和检测酶切产物的片 段长度，最终测定出SNP。TERT基因rs4975605多态位点采取PCR-RFLP技术进行检测，所 需内切酶为Cac8I，其价格较昂贵，因此需要开发新的检测技术。
【发明内容】
W07] 本发明的目的是提供一种非疾病诊断或治疗目的用的测定人TERT基因rs4975605位点多态性的可靠手段。
[000引根据本发明的第一方面，提供了一种测定人TERT基因rs4975605位点多态性的方 法，包括：
[0009] 提供待测人基因组DNA;
[0010] 提供扩增人TERT基因rs4975605位点附近序列的上游引物和下游引物，其中下游 引物具有错配碱基A; W11] W所述待测人基因组DNA为模板，利用上游引物和下游引物进行PCR扩增反应W 获得含GMAAGCCTTC片段的扩增产物，其中M为人TERT基因rs4975605位点上的待定碱基A和C;
[0012] 提供限制性内切酶；
[0013] 利用限制性内切酶对所得扩增产物进行酶切（反应）W获得相应的酶切产物；W 及
[0014] 根据所得酶切产物来确定人TERT基因rs4975605位点上的待定碱基M是A还是 C，其中，限制性内切酶为仅能够切开GAAAGCCTTC片段与GCAAGCCTTC片段之一的限制性内 切酶。
[0015] 根据本发明的实施例，在所得扩增产物上，下游引物的错配碱基A与多态位点M的 互补碱基之间相隔六个碱基AGGCTT。令人惊讶的是，如此设置错配碱基将使酶切反应进行 得极其顺利，不会出现酶切不充分等现象。并且，如此设置上游引物错配碱基使PCR反应进 行顺利，提高了PCR的灵敏度和特异度，运可能与错配碱基后使得扩增序列的二级结构改 变有关。
[0016] 在本发明的一个可选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基与多态位 点M的互补碱基相邻。
[0017] 在本发明的一个优选实施例中，在所得扩增产物上，下游引物末端碱基不与多态 位点M的互补碱基相邻。例如，下游引物末端可W是……AAGGCT、……AAGGC、……AAGG、…… AAG、……AA等结构。难W想象，具有运种设计的上游引物竟然会进一步大大促进酶切反 应，运可能与扩增结合力有某种关联。
[0018] 在本发明的一个优选实施例中，限制性内切酶可W采用仅能切开GAAAGCCTTC片 段的XmnI或其同裂酶。运类XmnI酶价格低廉，能大大降低测定成本。
[0019] 根据本发明的实施例，所得酶切产物包括=种片段类型：具有总片段长度的未切 断扩增产物、切断后具有较长片段的扩增产物W及切断后具有较短片段的扩增产物（较短 片段通常不能有效观测到）。通过观测（判断）酶切产物所包含的片段类型来确定人TERT 基因rs4975605位点上的待定碱基是A还是C。例如，在采用XmnI酶的情况下，根据总片段 和切断后较长片段运两个片段的观察结果来进行判断：如果观察到酶切产物只有一种具有 总片段长度的未切断扩增产物，则待定碱基为C;如果观察到酶切产物只有一种具有较长 片段（小于总片段长度）的切断产物，则待定碱基为A;如果观察到上述二者，则待定碱基 既包括A又包括C。
[0020] 在本发明的一个实施例中，判断（或观测）酶切产物所包含的片段类型是通过凝 胶电泳联合紫外灯拍照后与参照图对比来进行的。运种情况下，优选参照图是扩增产物在 凝胶电泳标准设定时间后经紫外灯拍照后而得且仅具有第一参照图像位置和第二参照图 像位置，其中第一参照图像位置针对的是未切断的总片段长度的扩增产物，而第二参照图 像位置则针对的是切断后具有较长片段的扩增产物。例如，本发明采用的参照图是由合成 的205bp和163bp两个碱基片段同时经凝胶电泳相同时间后紫外灯拍照而成。与常规DNA ladder的复合参照图相比，由于采用了仅具有两个特定参照图像位置的参照图，本发明的 运种方法能够直观快速地观测或判断酶切产物所包含的片段类型，同时最大限度地避免了 误判。酶切反应后优选将酶切产物浓缩1~2倍浓度后进行电泳，增加图像亮度，提高判断 准确性。
[0021] 在本发明的优选实施例中，通过设计上游引物和下游引物的长度而使得扩增产物 的总片段长度在100至300bp之间，并且下游引物的片段长度至少为35bp，优选长度40~ 6化P(在该优选区间扩增反应尤其顺利充分），使得酶切切掉部分片段长度占总片段长度 的百分比超过20%。本发明的运种设计可W使得具有总片段长度的未切断扩增产物与切断 后具有较长片段的扩增产物的电泳紫外照片的位置区别显著。但是，如果总片段过长，则电 泳位移将不明显；过短则图像会变得模糊一片，无法准确区分。下游引物的片段长度范围保 证了PCR扩增反应能够顺利进行，避免了错配碱基时会出现的扩增不足现象。 阳02引在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中退火溫度的范围在55~70°C之间，优选溫度60~69°C(该溫度可提高扩增反应的特异性），使得设计的PCR产物纯度 较高。本发明的运种设计可W使得PCR扩增产物条带清楚，无杂带出现，易于电泳识别。但 是，如果溫度过低，则特异条带少且杂带过多，电泳后难W区分判断；如果溫度过高，则影响 PCR扩增效率使得特定扩增产物过少，影响观察效果。
[0023] 在本发明的优选实施例中，通过控制PCR扩增程序中延伸时间的范围在10~60s 之间，优选时间15~30s(该时间可提高扩增反应的效率和扩增产物的特异性），使得设计 的PCR反应时间较短，扩增产物纯度较高。本发明的运种设计可W使PCR扩增产物条带清 楚，无杂带出现，易于电泳识别，而且PCR时间较短。但是，如果时间过短，则特异条带不能 完全扩增而使得扩增产物较少，电泳后难W区分判断；如果时间过长，则增加非特异条带的 出现几率，出现杂带影响观察效果。
[0024] 在本发明中，PCR反应成分可W包含DNA模板、上下游引物、TaqDNA polymerase(DNA聚合酶或亦可称作"Taq酶"）、缓冲液、Mg2+等。在本发明的优选实施例 中，PCR扩增反应中可W使用！"aqDNApolymerase及其！"aqAntibody。TaqAntibody是 TaqDNApolymerase的单克隆抗体，其与！"aqDNApolymerase结合后抑制DNA聚合酶活 性，两者的亲和力非常高，即使在65°C下仍然可W封闭化qDNApolymerase的活性，因此 可W非常有效地抑制引物的非特异性退火及引物二聚体引起的非特异性扩增，具有极高的 扩增灵敏度和特异性。TaqAntibody只需要在95°C加热30s即可完全失活，释放化qDNA polymerase活性，保证了后续PCR扩增反应能够顺利进行。 阳02引PCR反应中可W加入抑值为8. 1~8. 7的Tris-肥1缓冲液，在72°C延伸反应时 调整PCR溶液抑值在6. 8~7. 8之间，从而使Taq酶在偏碱性环境中更好地发挥活性。另 夕F，PCR溶液中还可W加入明胶化01%)W减少PCR管对Taq酶的吸附作用，稳定酶活性 及保护作用，促进PCR反应。
[0026] 另外，PCR溶液中Mg2+浓度在1. 5~2.Ommol/L之间时，可W很好地控制PCR反应 的产率和特异性。
[0027]PCR反应引物的终浓度一般为0. 1~1yM左右，浓度太高会导致非特异性扩增，太 低则扩增产物太少。
[0028] 此外，PCR反应中还可W加入助溶剂二甲亚讽值MS0)和硫酸锭W降低碱基错配水 平，提高富含GC模板的扩增效率。运可能与消除引物和模板的二级结构，降低DNA解链溫 度使DNA变性完全有关。
[0029] 根据本发明的另一方面，提供了一种用于测定人TERT基因rs4975605位点多态性 的试剂盒，其包含：