[0030] 用于PCR扩增人TERT基因rs4975605位点附近序列的上游引物和下游引物，其 中下游引物具有错配碱基AW获得含GMAAGCCTTC片段的扩增产物，其中M为人TERT基因 rs4975605位点上的待定碱基A和C;W及
[0031] 仅能够切开GAAAGCCTTC片段与GCAAGCCTTC片段之一的限制性内切酶。 阳03引上述试剂盒中还可W包括其它成分，例如PCR反应Mix(包括4种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymeraseJaqAntibody、缓冲液，DMSO和硫酸锭）和用于实施测定的说明 书等。
[0033] 本领域技术人员可W理解，除非有明显抵触，本发明的第一方面和第二方面的相 关特征可W相互组合。
[0034] 本发明的测定手段不但快速可靠，而且测定成本大大降低。
【附图说明】
[00对图1描述了根据本发明的方法获得的酶切产物电泳紫外照片。其中Marker是：标 准参考位置；泳道1:AC基因型；泳道2:AA基因型；泳道3:CC基因型。
【具体实施方式】
[0036] 下面对本发明进行详细描述。本领域技术人员应当理解，W下详细描述仅用于说 明而非限定本发明。
[0037] (1)待测DNA的获取
[0038] 采集不同人群外周血，提取基因组DNA后进行下面的TERT基因rs4975605位点多 态性的测定。
[0039] 对于待测DNA的选择，本发明并没有特别的限制。既可W是从人体的体液或者组 织获得离体样本，还可W是经过预先降解处理的基因组。为了方便实施，通常优选从血液提 取离体样本。其中所述的组织包括人体中含有全部或至少TERT基因的组织，而与是否表达 该TERT基因无关。从体液和/或组织中提取DNA的方法是本领域技术人员公知的，并且可 W参考常用的分子生物学手册，例如《实用流式细胞术彩色图谱》、《分子克隆》第2版等。 W40] 0)引物设计与合成
[0041] 查找NCBI网站的Gene数据库和SNP数据库，分别获得TERT基因全序列和 rs4975605 多态位点信息。rs4975605 多态位点m前后部分碱基序列（碱基序列W5'一3' 表示，大小写意义相同）如下（SEQIDNO: 1):
[0042]
[0044] 根据上述序列设计引入错配碱基的上游引物和下游引物。在最终所得扩增产物 上，下游引物的错配碱基A与多态位点M的互补碱基之间相隔六个碱基AGGCTT。
[0045] 在本发明中，下游引物具有错配碱基A，且长度为35~60bp。其中一个实施例中， 引物如下：
[0046] 上游引物：5'417〇：46口'4(：17666466(：了6466〔4464 644了3'（沈9 10側:2)，下游 引物：5'口'66口'4〔6(：1〇1^'〇：176 64417〇：〇：了0〔646176心66(：17 3'（沈9 10側：3)。其中 下游引物下划线碱基为错配碱基。 柳47] 做制备PCR扩增产物
[0048] 根据上游引物和下游引物特征及PCR相应试剂制定PCR扩增程序和条件，制备 PCR扩增产物。其中一个实施例中，取基因组DNA(50~80ng)、上下游引物（终浓度为 0. 1 ~1yM)、2XPCRMix7. 5yL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\hqDNApolymerase、hq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸锭）和双蒸水共同组成15yL反应体系，调整溶液抑为7. 3 左右。PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性80s- 65°C退火80s- 72°C延伸20s共 30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。 W例 （4)酶切反应
[0050] 本发明采用XmnI内切酶，与多态位点附近碱基无错配情况下可采用的内切酶 CacSI相比，价格非常低廉，如表1所示。
[0051] 表1肥B公司几种内切酶识别序列及其价格
[0053] 注：N为A或T或G或C。
[0054]其中一个实施例中，取PCR产物10化，加入抓内切酶XmnI、2yLIOX酶切缓冲 液和7. 5yL双蒸水组成20yL反应体系，37°C水浴中酶切4~12h，即得酶切产物，酶切产 物经1倍浓缩后电泳观察。 阳〇5引 妨电泳测试
[0056] 其中一个实施例中，PCR产物经XmnI酶切后如果不能切开则仍为20化P，如果被切 开则出现163bp和42bp，其中42bp片段电泳图中难W分辨。
[0057] 将酶切产物在2~4%琼脂糖凝胶中3~8V/cm条件下，电泳30~80min，于紫外 灯下拍照测定。酶切电泳图见图1，依据205bp和163bp片段的有无判断来判断基因型：AA 型为163bp-个片段，AC型有205bp和163bp两种片段，CC型为205bp-个片段。
[0058] 下面是实施本发明的若干实施例。
[0059] 实施例1提取人外周血白细胞DNA测定rs4975605多态性
[0060] 1材料与方法
[0061] 1.1主要试剂及仪器
[0062]试剂：2XPCRMix(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymerase、hq Antibody、缓冲液，DMSO和硫酸锭），限制性内切酶XmnI(肥B公司），琼脂糖度lowest公 司），引物由上海Sangon公司合成。
[0063]仪器：9600型PCR仪（阳公司），微型电泳槽（Pharmacia Biotech, EPS1000), Gel Doc 2000凝胶成像仪度io-RAD公司）。 W64] 1. 2从外周血白细胞中提取DNA作为待测基因组DNA模板
[0065] 邸TA-Kz抗凝管采集人外周血ImU参考《实用流式细胞术彩色图谱》中白细胞的分 离方法进行白细胞分离，参考《分子克隆》中氯化钢盐析法提取白细胞基因组DNA，并作为待 测人基因组DNA模板。1.3序列查找及引物设计
[0066] 在NCBI网站查找TERT基因序列和rs4975605多态位点信息来设计引物，具体如 下：
[0067]上游引物：5'ATTCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGCAAGAGAAT3'（沈QIDN0:2)，
[0068]下游引物：5'CTGGCTACGC TCCGTCCTTG GAATTCCCCT GCGAGTTGM GGCTT3'（沈QID NO:3)O
[0069] 1.4PCR扩增
[0070] 取基因组DNA巧0~80ng)、上下游引物（终浓度为0.1~1yM)、2XPCRMix 7. 5yL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\TaqDNApolymeraseJaqAntibody、缓冲液，DMSO和 硫酸锭），灭菌双蒸水补足15yL反应体系，调整溶液抑为7. 3左右。
[0071]PCR反应条件为：95°C预变性30s，95°C变性30s- 65°C退火30s- 72°C延伸20s 共30个循环，72°C延伸7min。PCR反应后获得稳定的扩增产物。
[0072] 1. 5酶切鉴定 W73] 取PCR产物10yL，加入抓内切酶XmnI、2yL10X酶切缓冲液和7. 5yL双蒸水 组成20yL反应体系，37°C水浴中酶切12h，即得酶切产物，酶切产物经1倍浓缩后电泳观 察。
[0074] 上述酶切产物在3%琼脂糖凝胶5V/cm条件下，电泳40min，于紫外灯下拍照鉴定 多态类型。 W巧]2结果
[0076] 2. 1 PCR扩增结果
[0077]扩增后序列（其位于SEQIDNO: 1碱基序列中342-546处，共20化P)，所获得的扩 增产物序列如下（SEQIDNO:4):
[0078]
[0079] 扩增后产物序列中下划线部分分别为上游、下游引物所对应的序列，m代表A/C多 态即SNP位点rs4975605。
[0080] 2. 2酶切结果
[0081] 经内切酶XmnI酶切后的产物序列分别如下：
[0082] 该多态位点含有A等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段163bp序列（SEQ IDNO:5)：
[0083]
[0084] 该多态位点含有A等位基因时PCR产物酶切后可形成切开片段42bp序列（SEQID NO:6)：
[0085]ccttc曰曰etcgc曰gggg曰曰ttee曰曰gg曰Cgg曰gcgt曰gee曰g 42
[0086] 酶切产物电泳后于紫外灯下拍照鉴定，结果示于图1中。其中，rs4975605位点扩 增后出现205bp片断（W上游序列为准，W下同），经XmnI酶切后电泳会出现20化P、163bp、 42bp=种片断（其中42bp在电泳图中不易分辨）。
[0087] 如图1所示，酶切后基因型判断：AA型为163bp-个片段，AC型有205bp和163bp 两种片段，CC型为205bp-个片段。
[0088] 2. 3TERT基因rs4975605位点多态结果
[0089] 共检测80例人员，检测结果发现rs4975605位点出现AA型2例、AC型18例和CC 型60例。
[0090] 实施例2人外周血全血标本测定TERT基因rs4975605多态性
[0091] 主要试剂及仪器同实施例1 ;参考《分子克隆技术》中酪-氯仿抽提法提取外周血 全血基因组DNA，并作为待测人基因组DNA模板。序列查找同实施例1，PCR反应所采用的 上游引物是沈QIDNO: 7,下游引物是沈QIDNO:8。
[0092] 上游引物：5'AGGCTGAGGCAAGAGAATTGCTTGAACTCAG3'（沈QIDN0:7);
[0093]下游引物：5'TGGCTACGCTCCGTCCTTGGAATTCCCCTGCGAGTTGMGGCT3'（沈QID NO:8)O
[0094] 取基因组DNA巧0~80ng)、上下游引物（终浓度为0.1~1yM)、2XPCRMix 10yL(包括 4 种dNTP混合物、Mg2\hqDNApolymerase、hqAntibody、缓冲液，DMSO和 硫酸锭），灭菌双蒸水补足20yL反应体系，调整溶液抑为7. 3左右。 阳O巧]PCR反应条件为：95°C预变性3min，95°C变性3