Med23基因的用途及其相关药物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及Med23基因的用途及其相关药物。
【背景技术】
[0002] 作为当前分子生物学研究的一个热点课题，Mediator被认为是信息中转整合 的"路由器"并且普遍参与到受化1II调控基因的转录过程（MalikandRoeder, 2010)。 Mediator复合物的发现人之一RogerKornberg教授由于其在真核转录系统中做出的杰出 贡献，获得了 2006年度的诺贝尔化学奖。瑞典皇家科学院在获奖公告中指出，"真核生物的 复杂性源于特异转录因子，DNA增强子和MediatorH者的相互作用，Mediator的发现是掲 示转录过程的一个里程碑"。转录信号从增强子传递到启动子，从转录因子到化1IURNA PolymeraseII,PolII) ,Mediator作为信息传递的桥梁一头连接转录因子，一头连接基础 转录因子和化1II，参与基因的转录调控过程（Carlstenetal., 2013)。Mediator在真核 生物中普遍存在，被认为是化1II转录装置中的一个必需组分，与化1II和通用转录因子 (GTFs)有同等重要的作用。
[0003] 尽管Mediator作为一个复合物普遍参与转录过程，但是在功能上又有其特异性 (MalikandRoeder, 2010;YinandWang, 2014)。不同的转录因子受到特定的环境或发育 信号的刺激时，会与Mediator复合物中的某个特定的亚基发生特异的相互作用，继而促进 Mediator在增强子区域的富集并发生在结构上的改变，招募通用转录因子和化1II到启 动子区域聚集并形成转录起始前复合物（Pre-initiationcomplex,PIC),进而参与基因表 达的水平的调控并最终导致特定的生物学现象的发生（MyersandKornberg, 2000;Ryuet al. , 1999 ;Tak址ashietal. , 2011)。目前的研究结果掲明了一些Mediator组分蛋白在特 定生物过程如发育、癌症和代谢等方面的功能度Iazeketal.，2005;Wangetal.，2009)。 比如在发育过程中，]\^01佑661曰1.，2002)、]\^014佑'〇11切6(16131.，2010)和]\^023(胖曰11邑 etal.，2009)通过不同的机制参与脂肪细胞分化的不同阶段，从而影响脂肪细胞的成熟； MED23(Yinetal.，2012)和MED28度eyeretal.，2007)参与平滑肌细胞的分化。在癌症方 面，MED15影响TGF目信号通路活性并在乳腺癌组织中高表达狂haoetal.，2013) ;MED23 作为RAS-MAPK下游的关键节点影响肺癌的发生灯angetal.，2012)。在代谢方面，MED15 可W通过与SREBPla相互作用参与调节脂质代谢平衡灯angetal.，2006) ;MED25通过影 响HNF4a的祀基因调节异生物质和脂质代谢（Ranaetal.，2011)等等。
[0004]MED23 又叫Sur2(suppressorofras2)，位于Mediator复合物尾部，最早是在 线虫中被鉴定出来的一个蛋白，是Ras/MAP-kinasepathway下游的一个祀标（Sin曲 andHan, 1995)。目前已知腺病毒因子ElA和MAPK激酶激发的转录因子Elkl可W与之 相互作用从而影响下游特定基因的表达。我们实验室的研究工作证明了M邸23作为Ras/ MAP-kinasepathway的下游参与Ras-active肺癌的发生发展，同时建立了MED23在肺癌 细胞株和肺癌临床样本中与ras-active肺癌发生发展的相关型。另外，本实验室进一步的 研究表明，MED23既是脂肪细胞分化过程中膜岛素信号转导途径和脂肪细胞分化基因转录 网络的一个重要节点，又是肌肉细胞的分化调控的一个关键因子（Wangetal.，2009;Yin etal.，2012)。脂肪、肌肉和肝脏是能量代谢主要器官，而参与脂肪和肌肉分化调控的一些 关键基因在能量代谢调控中也起着重要的作用，如调控脂肪细胞分化的转录因子PPARY2 对于肝细胞中脂生成（Iipogenesis)和脂质的积累（lipidac州mulation)具有调节作用 (Schadingeretal.，2005)，但是M邸23在糖脂代谢方面W及对2型糖尿病、癌症的发生发 展起到的作用，未曾有研究。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，公开与Med23基因相关的治疗方法及药 物，W基因敲除或RNAi为手段研究Med23基因在糖脂代谢方面W及对2型糖尿病发生发展 所起到的作用。
[0006] 本发明的第一方面，WRNA干扰为手段，研究了Med23基因在2型糖尿病发生和发 展中的作用，公开了一种抑制或降低肝组织中Med23表达的方法，该方法包括：向动物施用 一种能够特异性抑制Med23基因的转录或翻译，或能够特异性抑制Med23蛋白表达或活性 的分子，W此来抵抗2型糖尿病。
[0007] 所述抑制或降低肝组织中Med23表达的方法中，所述分子的施用量为足够降低 Med23基因的转录或翻译，或者足够降低Med23蛋白表达或活性的剂量。进一步的，所述 Med23基因的表达至少被降低50 %、80 %、90 %、95 %或99 %。
[0008] 所述分子可选自但不限于；核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、 多肤、蛋白、干扰慢病毒或干扰腺病毒。
[0009]所述核酸包括但不限于；反义寡核巧酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切酶 III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(ShRNA)。
[0010] 所述双链RNA、核酶、esiRNA或者ShRNA含有Med23基因的启动子序列或Med23基 因的信息序列。
[0011] 进一步的，所述双链RNA为小干扰RNA(SiRNA)D所述小干扰RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23 基因中15-27个连续的核巧酸序列基本相同。所述小分子干扰RNA能特异性结合祀序列所 编码的mRNA片段，并特异性沉默人Med23基因的表达。
[0012] 进一步的，所述小干扰RNA的第一链序列与Med23基因中的祀序列基本相同。较 优的，所述Med23基因中的祀序列含有SEQID;5-6中之任一序列。
[0013] 所述Med23基因中的祀序列即为所述小分子干扰RNA特异性沉默Med23基因表达 时，与所述的小分子干扰RNA互补结合的mRNA片段所对应的Med23基因中的片段。
[0014] 较佳的，所述Med23基因来源于人。
[0015] 本发明的第一方面还公开了一种Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗 药物，或者在筛选2型糖尿病药物诱发中的用途。
[0016] 所述将Med23基因用于制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物包括两方面的内 容；其一，将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用祀标应用于制备2型糖尿病 预防/治疗药物或制剂；其二，将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用祀标应 用于筛选2型糖尿病预防/治疗药物或制剂。
[0017] 所述将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用祀标应用于制备2型糖 尿病预防/治疗药物或制剂具体是指：将Med23基因作为基因敲除或者RNA干扰作用的祀 标，来研制针对2型糖尿病的药物或制剂，从而敲除或降低肝脏组织内Med基因的表达水 平。
[0018] 将Med23基因作为药物或制剂针对2型糖尿病的作用祀标应用于筛选2型糖尿病 预防/治疗药物或制剂，具体是指；将Med23基因作为作用对象，对药物或制剂进行筛选，W 找到可W敲除或抑制Med23基因表达的药物作为2型糖尿病预防/治疗药物或制剂。如本 发明所述的Med23基因小分子干扰RNA(SiRNA)即是WMed23基因为作用对象筛选获得的。 除此之外，诸如抗体药物，小分子药物等也可将Med23基因及其蛋白作为作用对象。
[0019] 所述2型糖尿病预防/治疗药物或制剂为能够特异性敲除Med23基因、抑制Med23 基因的转录或翻译，或能够特异性抑制Med23蛋白的表达或活性的分子，从而敲除Med23基 因或降低肝组织中Med23基因的表达水平，达到预防或治疗2型糖尿病的目的。
[0020] 所述通过Med23基因制备或筛选获得的预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂包括 但不限于：核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肤、蛋白、干扰慢病毒或 干扰腺病毒。
[0021] 所述核酸包括但不限于；反义寡核巧酸、双链RNA(dsRNA)、核酶、核糖核酸内切 酶III制备的小干扰RNA(esiRNA)或者短发夹RNA(ShRNA)。
[0022] 所述预防或治疗2型糖尿病的药物或制剂的施用量为能够敲除Med23基因、足够 降低Med23基因的转录或翻译，或者足够降低Med23蛋白的表达或活性的剂量。W使Med23 基因的表达至少被降低50%、80%、90%、95%或99%。
[0023] 所述将Med23基因用于筛选2型糖尿病诱发药物，是指首先构建一种抵抗2型糖 尿病小鼠模型，然后将诱发2型糖尿病备选药物施用于前述抵抗2型糖尿病小鼠，通过比较 用药前后小鼠的血糖、膜岛素、胆固醇和甘油H醋水平变化；膜岛素敏感、葡糖糖耐受和丙 丽酸耐受情况W及对肥胖的抵抗情况，筛选出使小鼠出现2型糖尿病症状的药物作为2型 糖尿病诱发药物。
[0024] 所述构建抵抗2型糖尿病小鼠模型的方法，采用的是条件性基因打祀技术，将 Med23基因两侧带有同向IoxP位点的标记小鼠与在肝脏特异性启动子A化umin的控制下表 达化e重组酶的化e小鼠杂交，筛选，获得抵抗2型糖尿病小鼠模型。
[00巧]WCre/LoxP系统与基因打祀技术相结合的条件性基因打祀（conditionalgene targeting)策略主要是运用DM重组方法来构建打祀基因置于同向LoxP之内的打祀载 体，经在ES细胞（胚胎干细胞）上同源重组及筛选，将携带该载体的小鼠与受控于组织 特异性启动子的化e基因的转基因小鼠交配，经化e介导重组，即可获得祀基因在某一组 织器官上缺失的基因敲除小鼠。
[0026] 进一步的，所述抵抗2型糖尿病小鼠模型的构建步骤如下：
[0027] 1)构建标记小鼠：通过同源重组的方法构建Med23基因两侧带有同向IoxP位点 的标记小鼠；
[002引。构建化e小鼠；构建在肝脏特异性启动子A化Umin的作用下表达化e重组酶的 化e小鼠；
[002引扣将标记小鼠与化e小鼠杂交，筛选，获得剔除Med23基因的纯合子小鼠即为抵抗 2型糖尿病小鼠模型。
[0030] 本发明所述剔除Med23基因的纯合子小鼠并不是在小鼠所有细胞基因组上都存 在基因的缺失，而只是在受A化umin启动子调控的肝脏组织中缺失，是Med23基因被条件性 敲除的纯合子小鼠。
[0031] 较优的，所述2型糖尿病小鼠模型的构建步骤具体为：
[0032] 1)构建标记小鼠；将含有Lox-Med23-Lox基因片段的载体转化胚胎干细胞，使其 与胚胎干细胞的Med23基因组发生同源重组；然后将同源重组后的阳性胚胎干细胞植入胚 胎，产生Med23基因两侧带有IoxP位点的后代即为标记小鼠；
[0033] 2)构建化e小鼠；通过转基因技术将表达化e重组酶的基因引入基因组中，并位 于组织特异性基因启动子A化umin的控制下，获得在肝脏特异性启动子A化umin的控制下 表达化e重组酶的化e小鼠