SiRNA祀点（SEQIDNO;5、6)合成含粘性末端的双链DNAOligo序列（表 5-2)O
[0198] 表5-2含粘性末端的双链DNA0IigO
[0199]
[0200] 上述DNAOligo可交给上海生工合成，合成之后引物溶解成lOOul。
[020" 2)将ShRNA连入RNAi-ReadypSIREN-RetroQ载体
[020引 各 4. 5ul上述DNAOligo加上Iulannealingbuffer退火（用PCR仪 95 度 5 分 钟之后缓慢降温）。退火后的产物经过1 :1000稀释后，取7ul加入到Iul经过BamHI和 EcoRI酶切好的RNAi-ReadypSIREN-RetroQ载体质粒（购自Clontech公司，见图6)进行连 接，连接产物转化amp板，随机挑出几个克隆，用化el酶且鉴定会有1. 5化条带，送测序公 司使用U6测序引物测序，选择测序正确的质粒保存，分别命名为pSIREN-RetroQ-si23-B; pSIREN-RetroQ-si23-D；pSIREN-RetroQ-siCtrl0
[0203] 3)获得U6启动子和其下游的shRNA片段
[0204] 针对RNAi-ReadypSIREN-RetroQ设计PCR引物；将U6启动子连同后面的ShRNA 一同扩增出来。
[020引 PCR引物如下，扩增得到的产物命名为U6-si23-B，U6-si23-D，U6-siCtrl:
[020引 pSIREN-Ret;roQ-si23-B
[0207]正义链；5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDN014 [020引 反义链：5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAATGAAGCC3' 沈QIDN015
[0209]pSIREN-RetroQ-si23-D；
[0210] 正义链；5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDN016
[0211] 反义链；5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAAGAGATAAG3' 沈QIDN017
[0212] pSIREN-RetroQ-siCtrl；
[0213]正义链；5'GGGGTACCGAAGAGGGCCTATTTCCCAT3'SEQIDN018
[0214]反义链；5'GAAGATCTGCTAGCAAAAAATCTCTTG3'SEQIDN019
[0引引 4)将U6启动子及其下游ShRNA连入pShuttle质粒，W便于与腺病毒的骨架质粒 进行重组。
[0216]将扩增得到的U6-si23-B，U6-si23-D，U6-siCtrl连同pShuttle质粒进行 化nl和BglII双酶切W及DNA琼脂糖凝胶回收、连接。转化，挑克隆，送公司测序鉴定， 将鉴定成功的质粒利用Qiagen质粒大抽试剂盒进行大抽，得到pShuttle-U6-si23-B, pShuttle-U6-si23-D,pSiuttle-UG-siCtrl质粒。
[0217] 5)腺病毒的构建遵照Stratagene公司的标准步骤，下述实验所用材料均可W在 Strategene买到：
[0218]①线性化pShuttle-U6-si23-B,pShuttle-U6-si23-D,pShuttle-UG-siCtrl质 粒；利用F*mel质粒对pShuttle-U6-si23-B，pSuittle-U6-si23-D，pSuittle-U6-siCt;rl质 粒进行酶切，TiangenDNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。
[0219]②将IugpShuttle-U6-si23-B,pSiuttle-U6-si23-D，pSiuttle-UG-siCtrl质粒 分别与lugpA祀asy-1质粒共同转化到BJ5183大肠杆菌细胞中，涂Kanamycin抗性的平板。 挑选长的瘦小的克隆进行摇菌。
[0220] ⑨鉴定发生重组的pA祀asy-U6-siB,pA祀asy-U6-si23-D,pA祀asy-UG-siCtrl质 粒：抽提上一步得到的质粒，并利用化CI进行酶切，跑胶鉴定；跑胶产生的条带产生两条 条带，一条是30化左右，另一条要么是3化，要么是4. 5化，就是我们需要的发生重组的质 粒。
[0221] ④扩增pA祀asy-U6-siB,pA祀asy-U6-si23-D,pA祀asy-UG-siCtrl质粒并线性 化：将pA祀asy-U6-siB,pA祀asy-U6-si23-D,pA祀asy-UG-siCtrl质粒转化D册a进行扩 增，利用Qiagen质粒大抽试剂盒进行大抽得到质粒。利用化CI酶切上述质粒，Tiangen DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收线性化的质粒。
[022引⑤将线性化的质粒4ug利用lipofectamine2000试剂（购自invitrogen公司）转 染至6cmdish的293A细胞。第二天在细胞上面铺一层低烙点胶。待6-8天后，挑取8-10 个腺病毒克隆，感染24孔板的293A细胞，得到腺病毒的种子。
[0223] ⑧将上述种子腺病毒进行扩增纯化：具体方法如同实例4中的腺病毒扩增方法； 纯化的腺病毒利用商业试剂盒（StratageneA祀asyviralTiterKit#972500)测定病毒 滴度，符合使用要求；得到腺病毒Ad-SiCtrl,Ad-si23-B，Ad-si23-D。
[0224] ⑦检测腺病毒对MED23的敲低效率；将Ad-siCtrl，Ad-si23-B，Ad-si23-D同样的 滴度MOI= 7感染细胞，并利用western检测效率，如下图7。发现si23-B和Ad-si23-D均 能敲低Med23基因，且si23-D对Med23的敲低效率更高。后续实验采用si23-D进行，简写 为Ad-si23。3.对2型糖尿病模型小鼠化/化的Med23基因进行敲除 [022引对5只6-8周2型糖尿病模型小鼠化/化小鼠尾静脉注射Ad-si23腺病毒，（每 只小鼠注射SXlO9P即，由于腺病毒有嗜肝性，经血液循环后，腺病毒会聚集到达肝脏，实现 Med23基因的敲除。并对5只6-8周2型糖尿病模型小鼠化/化小鼠尾静脉注射Ad-Sictrl， 每只小鼠注射5XIO9P即，作为对照小鼠。
[0226]Westernblot的结果显示Ad-si23可W特异降低肝脏中Med23的蛋白水平，而没 有影响其在白色脂肪中的蛋白水平（图5A)。腺病毒敲除Med23基因的小鼠的体重W及肝 体比与注射了同样剂量不针对任何基因的腺病毒Ad-Ctrl的雄性对照组相比，没有显著差 异（图5B和5C)。Med23的敲除并没有影响小鼠在饥饿化和1她时的血糖水平（图5D)。 另外，与对照组相比，Med23敲除小鼠的wako商业化试剂盒测定的血浆胆固醇水平显著下 降，而甘油H醋水平基本不变（图祀）。
[0227] 葡萄糖耐受实验表明敲除小鼠比对照小鼠对葡萄糖的耐受力更强，而丙丽酸耐受 实验表明敲除小鼠的肝糖输出水平下降（图5G和5H)。
[022引该试验结果证明，敲除或沉默2型糖尿病模型小鼠化/化体内Med23基因的表达， 能够使其表现出抵抗2型糖尿病症状，说明Med23基因可作为预防或治疗2型糖尿病的祀 点。
[0229] W上所述，仅为本发明的较佳实施例，上述实施例仅例示性说明本发明的原理及 其功效，而并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技 术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可W做出若干改进和补充，送些改进和补充也 应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情 况下，当可利用W上所掲示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本 发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的 更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物，或者在筛选诱发2型糖 尿病药物中的用途。2. -种抵抗2型糖尿病小鼠模型的构建方法，其特征在于，利用条件性基因打靶技术， 将Med23基因两侧带有同向ΙοχΡ位点的标记小鼠与在肝脏特异性启动子Albumin的控制 下表达Cre重组酶的Cre小鼠杂交，筛选，获得抵抗2型糖尿病小鼠模型。3. -种降低肝组织中Med23基因表达的分离的核酸分子，所述分子包括： 1) 双链RNA，所述双链RNA中含有能够在严紧条件下与Med23基因杂交的核苷酸序列； 或者 2. shRNA，所述shRNA中含有能够在严紧条件下与Med23基因杂交的核苷酸序列。4. 根据权利要求3所述的分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA包含第一链和第 二链，所述第一链和所述第二链互补共同形成RNA二聚体，并且所述第一链的序列与Med23 基因中的靶序列基本相同；所述shRNA包括正义链片段和反义链片段，以及连接所述正义 链片段和反义链片段的茎环结构，所述正义链片段和所述反义链片段的序列互补，并且所 述正义链片段的序列与Med23基因中的靶序列基本相同。5. 根据权利要求4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述Med23基因的靶序列含有 SEQIDNO:5-6 中任一序列。6. 根据权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述双链RNA为小干扰RNA， 该小干扰RNA第一链的序列如SEQIDNO:20-21任一序列所示。7. 根据权利要求3或4所述分离的核酸分子，其特征在于，所述shRNA的序列如SEQID NO:22-23任一序列所示。8. -种Med23基因干扰核酸构建体，含有编码权利要求3-7任一权利要求所述分离的 核酸分子中的shRNA的基因片段，能表达所述shRNA。9. 根据权利要求8所述Med23基因干扰核酸构建体，其特征在于，所述Med23基因干扰 核酸构建体为干扰腺病毒载体。10. 根据权利要求9所述的Med23基因干扰核苷酸构建体，其特征在于，所述干扰腺病 毒载体由将编码所述shRNA的基因片段克隆入腺病毒后获得。11. 一种Med23基因干扰腺病毒，由权利要求8-10任一权利要求所述干扰腺病毒载体 在腺病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装而成。12. -种用于预防或治疗2型糖尿病的药物组合物，其有效物质含有权利要求3-7任一 权利要求所述的分离的核酸分子，权利要求8-10任一权利要求所述Med23基因干扰核酸构 建体，和/或权利要求11所述的Med23基因干扰腺病毒以及药学上可接受的载体、稀释剂 或赋形剂。13. 权利要求12所述药物组合物在制备预防/治疗2型糖尿病药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了Med23基因的用途及其相关药物。本发明公开了Med23基因在制备或筛选2型糖尿病预防/治疗药物，或者在筛选2型糖尿病诱发药物中的用途。本发明还进一步构建了Med23基因小分子干扰RNA、Med23基因干扰核酸构建体、Med23基因腺病毒并公开了它们的用途。本发明提供的siRNA或者包含该siRNA序列的核酸构建体、腺病毒能够特异性敲除或抑制Med23基因的表达，尤其是腺病毒，能够高效侵染肝细胞，高效率地抑制肝细胞中Med23的表达，在预防/治疗2型糖尿病中具有重要意义。
【IPC分类】C12N15/861, A61K48/00, C12N15/12, A01K67/02, C12Q1/68, C12N7/01, A61P3/10
【公开号】CN105296600
【申请号】CN201410225081
【发明人】王纲, 初雅婧
【申请人】中国科学院上海生命科学研究院
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2014年5月26日