一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法

一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法。本发明提供一种载药组织粘贴膜，所述载药组织粘贴膜包括交替叠加的阳离子层和阴离子层，所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层、或所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物，所述药物为核酸药物。本发明所提供的载药组织粘贴膜具有良好的组织黏附性、良好的生物相容性及可降解吸收性、良好的稳定性，其物理、化学性能可通过调节材料的组成而调节。
【专利说明】
一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是涉及一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法，该载药组织粘贴膜可通过外科手术植入病患组织部位进行局部直接缓释控释给药治疗各种疾病。
【背景技术】
[0002]随着基因技术的迅速发展，核酸药物已成治疗肿瘤等疾病的最有发展前途的方法之一，而目前阻止核酸药物临床使用的最大障碍就是缺乏有效的给药技术，核酸药物容易被核酸酶降解，无法到达靶点并进入细胞内部发挥作用，因此，无论是在基因治疗领域，还是在对核酸药物的研发领域，都需要高效的将核酸输运进活体组织的靶细胞内部。
[0003]例如，RNA干扰是一种由大约二十多个核苷酸组成的双链小分子干扰RNA介导的基因沉默技术，它具有序列特异性，因而基于RNA干扰的小核酸在疾病治疗中极具应用前景，然而，由于包括SiRNA在内的小核酸分子本身不具备对组织或细胞的靶向能力，穿透细胞膜的能力差，在生理环境中极不稳定，因此其给药体系，尤其载体是急需解决的关键问题，这也是小核酸药物能否最终顺利应用于临床的关键因素之一。
[0004]总之，目前小干扰RNA基因药物给药技术的障碍和面临的现状:1、亲水性阴离子SiRNA易被快速从血液循环中清除，难以跨越表面负电的疏水性细胞膜，易被核酸酶降解，需要安全高效的载体释放系统保护并高效运送进入细胞发挥功能；2、siRNA的非病毒载体主要为阳离子脂质体和阳离子高分子，如聚乙烯亚胺(PEI)和壳聚糖(Chitosan，CHS)，尽管脂质体易与细胞膜融合，但不稳定且有较强细胞和体内毒性';PEI质子缓冲能力利于胞内转运，但也有较强的细胞和体内毒性;3、上述材料主要与s iRNA形成纳米微球、微粒、胶束，通过静脉滴注等形式全身给药，给药剂量大，副作用大，靶向性差，进入细胞内部的药物剂量少，达不到临床治疗效果。

【发明内容】

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种核酸药物载药组织粘贴膜及其制备方法和用途，该载药组织粘贴膜可通过外科手术植入病患组织部位，进行局部直接缓释控释给药治疗各种疾病，用于解决现有技术中的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种载药组织粘贴膜，更具体为核酸药物载药组织粘贴膜，所述载药组织粘贴膜包括交替叠加的阳离子层和阴离子层，所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层、或所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物，所述药物为核酸药物。
[0007]具体的，所述阳离子层整体上显示为正电荷，所述阴离子层整体上显示为负电荷。
[0008]当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层时，作为药物层的阳离子层和/或阴离子层为带电荷的药物，不作为药物层的阳离子层可含有带阳离子基团的载体材料，不作为药物层的阴离子层可含有带阴离子基团的载体材料。
[0009]当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物时，阳离子层可含有带阳离子基团的载体材料，阴离子层可含有带阴离子基团的载体材料。
[0010]在本发明所提供的载药组织粘贴膜中，所述带阳离子基团的载体材料为本身带有正电荷或在溶于溶剂发生电离后带有正电荷的材料，在本发明一实施方式中可以是溶于水发生电离后，带有正电荷的物质。
[0011]所述带阳离子基团的载体材料优选为可体内降解的生物相容性材料。
[0012]具体的，所述带阳离子基团的载体材料可选自带阳离子基团的有机高分子聚合物、带阳离子基团的多聚糖、带阳离子基团的多肽、带阳离子基团的蛋白、以及阳离子脂质体等中的一种或多种的组合。
[0013]所述有机高分子聚合物具体指由许多相同的结构单元(一种结构单元或多种结构单元)通过共价键重复连接而成的高分子量化合物，在本发明一实施方式中，具体可选用的带阳离子基团的有机高分子聚合物包括但不限于:聚乙烯亚胺、树形聚酰胺胺高分子、阳离子聚酯(具体例子如阳离子聚磷酸酯、聚磷酰酯、聚甲基丙烯酸酯等)、聚乙烯基吡啶等中的一种或多种的组合。
[0014]所述多聚糖具体指一分子水解时可以生成多个单糖，更具体为十个以上单糖的糖，所述带阳离子基团的多聚糖可以是本身带阳离子基团的多聚糖，也可以是通过改性获得的带有阳离子基团的多聚糖。对多聚糖进行改性以使其带有阳离子基团的技术为本领域的现有技术，具体可以是在侧链上接枝氨基等方法。在本发明一实施方式中，具体可选用的带阳离子基团的多聚糖包括但不限于:壳聚糖及其衍生物(具体例子如壳聚糖季铵盐、低取代度羧甲基壳聚糖、三甲基壳聚糖、含咪唑基壳聚糖、巯基化壳聚糖等)、阳离子淀粉及衍生物(具体例子如带有阳离子基团的环糊精等)以及其他带有阳离子基团的多聚糖中的一种或多种的组合。
[0015]所述带阳离子基团的多肽或蛋白可以是本身带有阳离子基团的多肽或蛋白，也可以是通过改性获得的带有阳离子基团的多肽或蛋白。在本发明一实施方式中，具体可选用的带阳离子基团的多肽或蛋白包括但不限于:聚赖氨酸或聚精氨酸及他们的衍生物(具体衍生物的例子如:在多肽上引入PEG、半乳糖、乳糖、叶酸、转铁蛋白等)、胶原、明胶、血清白蛋白等中的一种或多种的组合。由于一些蛋白(如胶原、明胶、血清白蛋白等)在不同PH值下既可能显示为带正电荷，也可能显示为带负电荷(在低于等电点的PH值下带有正电荷，在高于等电点的PH值下带有负电荷)，所以此类物质既可作为阳离子层，也可作为阴离子层。
[0016]所述阳离子脂质体可选用本领域各种阳离子脂质体，具体可选用的例子包括但不限于:用DOTMA类似体、D0TAP、亚精胺胆固醇制备的阳离子脂质体。
[0017]在本发明所提供的载药组织粘贴膜中，所述带阴离子基团的载体材料为本身带有负电荷或在溶于溶剂发生电离后带有负电荷的材料，在本发明一实施方式中可以是溶于水发生电离后，带有负电荷的物质。
[0018]所述带阴离子基团的载体材料优选为可体内降解的生物相容性材料。
[0019]具体的，所述带阴离子基团的载体材料可选自带阴离子基团的有机高分子聚合物、带阴离子基团的多聚糖、带阴离子基团的多肽、带阴离子基团的蛋白、以及阴离子脂质体等中的一种或多种的组合。
[0020]在本发明一实施方式中，具体可选用的带阴离子基团的有机高分子聚合物包括但不限于:如CNl 524184A中给出的由二羧酸构成的阴离子。
[0021]所述带阴离子基团的多聚糖可以是本身带阴离子基团的多聚糖，也可以是通过改性获得的带有阴离子基团的多聚糖。对多聚糖进行改性以使其带有阴离子基团的技术为本领域的现有技术，具体为如阴离子淀粉等(更具体的例子如羧甲基淀粉等)。在本发明一实施方式中，具体可选用的带阴离子基团的多聚糖包括但不限于:羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸、羧甲基淀粉、硫酸软骨素、肝素及他们的衍生物、以及其他带有阴离子基团的多聚糖等中一种或多种的组合。
[0022]所述带阴离子基团的多肽可以是本身带有阴离子基团的多肽，也可以是通过改性获得的带有阴离子基团的多肽。在本发明一实施方式中，具体可选用的带阴离子基团的多肽包括但不限于:聚谷氨酸或聚天冬氨酸及其衍生物、胶原、明胶等中的一种或多种的组入口 ο
[0023]所述阴离子脂质体可选用本领域各种阴离子脂质体，具体可选用的例子包括但不限于:AS-ODNs阴离子脂质体、D0PG/D0PE阴离子脂质体等。
[0024]在本发明所提供的载药组织粘贴膜中，所述带电荷的药物具体可以是带正电荷的药物和/或带负电荷的药物，只要其带有电荷，均可被用于作为药物层或包含于所述载药组织粘贴膜中，其包含的量一般为有效治疗量。治疗有效量对应于治疗适应症的目的，具体指一用量在经过适当的给药期间后，能够达到治疗适应症的效果。治疗具体包括药学和/或生理效果的预防性、治愈性或缓和性处置。该效果较佳地是指医疗上可减少适应症的一种或多种症状或者完全消除适应症，或阻滞、延迟适应症的发生和/或降低适应症发展或恶化的风险。
[0025]具体的，当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层时，所述药物层具体可选用带电荷的药物，具体来说，当阳离子层为药物层时，其可包括带正电荷的药物，而当阴离子层为药物层时，其可包括带负电荷的药物。
[0026]更具体的，对于带正电荷的药物来说，当阳离子层的至少一层为药物层时，带正电荷的药物可作为药物层，与临近的阴离子层形成静电作用；当其作为药物包含于阳离子层和/或阴离子层中时，其可位于阳离子层中与临近的阴离子层形成静电作用，从而稳定地被包含于所述载药组织粘贴膜中，或可位于阴离子层中，带正电荷的药物与带阴离子基团的载体材料作用后，该层整体上仍显示为负电荷，与带阳离子基团的载体材料形成静电作用，从而稳定地被包含于所述载药组织粘贴膜中。而对于带负电荷的药物来说，当阴离子层的至少一层为药物层时，带负电荷的药物可作为药物层，与临近的阳离子层形成静电作用；当其作为药物包含于阳离子层和/或阴离子层中时，其可位于阴离子层中与临近的阳离子层形成静电作用，从而稳定地被包含于所述载药组织粘贴膜中，或可位于带阳离子基团材料冲层中，带负电荷的药物与带阳离子基团的载体材料作用后，该层整体上仍显示为正电荷，与带阴离子基团的载体材料形成静电作用，从而稳定地被包含于所述载药组织粘贴膜中。
[0027]所述带电荷的药物，具体为带电荷的核酸药物，可以是一些本身即带有电荷的核酸药物(如，核酸本身一般均带有负电荷)，也可以是一些核酸药物经与带电荷(正电荷或负电荷)物质或材料结合或包裹形成的带有电荷的药物复合体。将药物与带电荷(正电荷或负电荷)物质或材料结合或包裹形成的带有电荷的药物复合体的方法为本领域的现有技术，具体的药物复合体包括但不限于药物脂质体、药物磷脂、药物与阴离子基团材料形成的聚合物、药物与阳离子基团材料形成的聚合物等。药物复合体的形式可以是微球、微囊、微粒、微团、胶束等。
[0028]具体的，所述药物为核酸药物。
[0029]所述核酸药物包括核酸或其衍生物，所述核酸具体包括但不限于:SiRNA、mi croRNA、mRNA、tRNA、rRNA、RNA病毒、核酶、反义核酸、肽核酸、三链核酸、DNA质粒、DNA病毒、DNA蛋白质合成结构基因等。各种核酸可以单独一种地使用，也可以两种以上适当地组合使用。所述核酸可以是来自人、动物、植物、细菌、病毒等的核酸，也可以是通过化学合成制备的核酸。因此，上述核酸可以是单链、双链、三链中的任一种，并且对其分子量也没有特殊的限定。
[0030]在本发明所提供的载药组织粘贴膜中，阳离子层和阴离子层交替叠加，并可通过静电吸引力结合，形成供载药的组织粘贴膜，所述阳离子层整体上显示为正电荷，所述阴离子层整体上显示为负电荷。具体可以是阳离子层材料和带阴离子层材料通过静电吸引力进行交替沉积的方法，如聚电解质层层自组装法等。其对于阳离子层和阴离子层交替叠加的次数没有特殊限制，本领域技术人员可根据实际需要(如，载药量、降解时间等)调整组织粘贴膜的总厚度，所述组织粘贴膜的总厚度可以< ΙΟΟΟμπι，更具体可以<600μπι，更具体可以< 400μηι，更具体可以< 200μηι，进一步具体可以为0.05μηι-1000μηι。对于每一层阳离子层和/或阴离子层而言，本领域技术人员可根据材料的种类和实际需要(如，载药量、降解时间等)调整各阳离子层和/或阴离子层的厚度，并可以进一步确定药物、带阳离子基团的载体材料和带阴离子基团的载体材料的使用量，其厚度可以为0.0005μπι--100μπι，更具体可以0.001μπι--50μπι，更具体可以为纳米级别，而阳离子层和阴离子层制备时材料的使用量为1:0.005—200 O
[0031]本发明第二方面提供所述载药组织粘贴膜的制备方法，包括如下步骤:在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层，制备获得组织粘贴膜。
[0032]本发明所提供的载药组织粘贴膜在制备完成后可以被完整地揭离基板，并可独立于其他附着材料(如基板、背衬等)稳定地存在。
[0033]具体的，当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层，所述制备方法可以是聚电解质层层自组装法，具体可以包括如下步骤:
[0034]在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层，制备获得组织粘贴膜，在沉积作为药物层的材料层时，使用带电荷的药物进行沉积。
[0035]具体的，在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层方法具体包括如下步骤:在沉积非药物层时，基板交替浸泡或喷涂带阳离子基团的载体材料的溶液和带阴离子基团的载体材料的溶液，在沉积药物层时，则浸泡或喷涂带电荷的药物的溶液，每次沉积后洗涤(具体可以为用水洗涤)、干燥，完成交替沉积后揭膜，即得所述组织粘贴膜。
[0036]更具体的，所述带阳离子基团材料的溶液、带阴离子基团材料的溶液、带电荷的药物的溶液均可为水溶液，也可在水溶液中添加适当的盐离子以改变分子的空间伸展情况，具体可用于改变分子的空间伸展情况的盐离子的种类是现有技术中已知的，如在溶液中添加 NaCl、KCl 等。
[0037]本领域技术人员可根据材料的种类调整沉积时所使用材料的溶液的浓度、pH值、盐离子浓度等，在本发明一实施方式中，沉积时所使用的溶液中，盐离子浓度具体可以为^10mol/L，更具体可以为0.05-10mol/L，pH值可以为3-11。
[0038]当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物时，所述制备方法可以是聚电解质层层自组装法，具体可以包括如下步骤:
[0039]在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层，制备获得组织粘贴膜;并在制备组织粘贴膜的过程中，将药物植入所述组织粘贴膜中。
[0040]具体的，在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层方法具体包括如下步骤:基板交替浸泡或喷涂带阳离子基团的载体材料的溶液和带阴离子基团的载体材料的溶液(在沉积包括药物的材料层时，用于沉积该材料层的溶液中则可以进一步包括药物)，每次沉积后洗涤(具体可以为用水洗涤)、干燥，完成交替沉积后揭膜，即得所述组织粘贴膜。
[0041]本领域技术人员可选用合适的方法，将药物植入所述组织粘贴膜中，具体可以是:在沉积含有带电荷的药物的阳离子层时，将药物与带阳离子基团的载体材料混合进行沉积(具体可以是浸泡或喷涂带阳离子基团的载体材料和药物的混合溶液);在沉积含有带电荷的药物的阴离子层时，将药物与带阴离子基团的载体材料混合进行沉积(具体可以是浸泡或喷涂带阴离子基团的载体材料和药物的混合溶液)；此外，也可以在制备获得组织粘贴膜以后，再使用高压瞬时喷涂含有药物的溶液，并进一步进行洗涤、干燥。
[0042]本发明第三方面提供一种组织粘贴膜在制备药物载体材料中用途。
[0043]所述药物具体为带电荷的药物，更具体为如上所述的带电荷的核酸药物。
[0044]具体的，所述组织粘贴膜包括交替叠加的阳离子层和阴离子层。
[0045]更具体的，所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层、或所述阳离子层和阴离子层中的至少一层用于包含带电荷的药物。
[0046]本发明所提供的载药组织粘贴膜具有良好的组织黏附性、良好的生物相容性及可降解吸收性、良好的稳定性，其物理、化学性能可通过调节材料的组成而调节。此外，所述载药组织粘贴膜制备方法简单，载药量可根据需要量进行调节，载体材料能保护被携带的药物(如使RNA免于被降解)，并能将被携带的药物高效率地转运至靶细胞内，具体例如:所述载药组织粘贴膜可通过外科手术直接将载药组织粘贴膜粘贴在病灶部位(即通过外科手术植入式缓释给药治疗各种疾病)，给药直接，靶向性好，药物局部浓度高治疗效果好，副作用小，对生物体的潜在毒性低，具有很高的生物安全性。
【附图说明】
[0047]图1显示为实施例12siRNA的凝胶电泳实验示意图。
[0048]图2显示为实施例13细胞转染试验示意图。
[0049]图3显示为实施例13相对荧光强度示意图。
【具体实施方式】
[0050]以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的【具体实施方式】加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0051]在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。
[0052]当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0053]除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，Second edit1n,Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edit1n，2001;Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR B1LOGY,John Wiley&Sons,New York,1987and per1dic updates；theseries METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCT1N,Third edit1n,Academic Press,San Diego，1998;METH0DS INENZYM0L0GY，Vol.304,Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego，1999;和METHODS IN MOLECULAR B1LOGY,Vol.119,ChromatinProtocols(P.B.Becker,ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
[0054]实施例1
[0055]在无菌工作台中，准备一 12厘米直径培养皿，内置一张同样直径硅片膜(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(lmg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mo I /L NaC I，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(I mg/m I羧甲基壳聚糖，0.15mo I /LNaCl , pH = 6 );取部分B液加入小干扰核酸药物(eGFP-siRNA(sense:5’_GGCACAAGCUGGAGUACAAUU-3 ’ ；antisense: 5’ -UUGUACUCCAGCUUGUGCCUU-3’，20ug/mL)及细胞靶向因子(透明质酸，分子量小于2万道尔顿，lOug/mL)与靶向多肽(1X10—4mg/ml)配制成C液，靶向多肽氨基酸顺序为:缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸;把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂C液，干燥成膜;接着高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗;接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作;接着再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗;最后高压瞬时喷涂C液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0056]实施例2
[0057]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的海藻酸，6至8万分子量，0.15moI/L NaCl，pH=6)简称B液;B液中再加入小干扰核酸药物(同实施例1，20ug/mL)及细胞靶向因子(透明质酸，分子量小于2万道尔顿，10ug/mL)，A液中再加入靶向多肽(I X 10—4mg/ml)，靶向多肽氨基酸顺序为:异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸;将平板先浸入A溶液中20分钟，取出入清洗液洗涤干燥;再将平板浸入B溶液中30分钟，取出入清洗液洗涤干燥，如此交替进行160次，最后用注射用水冲洗，干燥，揭膜，得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0058]实施例3
[0059]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的透明质酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)简称B液;A液中再加入小干扰核酸阳离子脂质体(阳离子脂质制备方法参考《阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导的基因转染》，药学实践杂志，2011 (29): 4，小干扰核酸同实施例1，小干扰核酸阳离子脂质体加入量为0.5mg/ml，小核酸载药量21.7% )搅拌均匀与靶向多肽(I X 10—4mg/ml)，靶向多肽氨基酸顺序为:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸;将平板先浸入A溶液中20分钟，取出入清洗液洗涤干燥;再将平板浸入B溶液中30分钟，取出入清洗液洗涤干燥，如此交替进行180次，最后用注射用水冲洗，干燥，揭膜，得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0060]实施例4
[0061]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的透明质酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)简称B液;B液中再加入小干扰核酸阴离子脂质体(制备方法参考《阴离子脂质体-阳离子脂质体复合物介导的基因转染》，药学实践杂志，2011(29):4，小干扰核酸同实施例1，小干扰核酸阴离子脂质体加入量为0.5mg/ml，小核酸载药量12.4%)搅拌均匀与靶向多肽(1\10—41^/1111)，靶向多肽氨基酸顺序为:缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸，将平板先浸入A溶液中20分钟，取出入清洗液洗涤干燥;再将平板浸入B溶液中30分钟，取出入清洗液洗涤干燥，如此交替进行180次，最后用注射用水冲洗，干燥，揭膜，得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0062]实施例5
[0063]在无菌工作台中，准备一12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤及灭菌除热原处理)，注射用水冲洗干燥;分别配制带阳离子基团材料的A液(lmg/ml胶原，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=3.5)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0.15mol/L NaCl，pH=6) ;A液中再加入小干扰核酸阳离子脂质体(制备方法如实施例3，浓度为0.5mg/ml)与革El向多肽(I X 10—4mg/ml)搅拌均勾，革El向多肽氨基酸顺序为:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸;把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥，接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作200次;最后再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0064]实施例6
[0065]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的海藻酸，6至8万分子量，0.15moI/L NaCl，pH=6)简称B液；B液中再加入索拉非尼透明质酸微球(浓度1.5mg/ml，微球直径ΙΟμπι至16μπι;载药量7.58%)，A液中再加入靶向多肽(I X 10—4mg/ml)，靶向多肽氨基酸顺序为:异亮氨酸-赖氨酸-缬氨酸-丙氨酸-缬氨酸;将平板先浸入A溶液中20分钟，取出入清洗液洗涤干燥;再将平板浸入B溶液中30分钟，取出入清洗液洗涤干燥，如此交替进行30次，最后用注射用水冲洗，干燥，揭膜，得载索拉非尼药物植入式组织粘贴膜。
[0066]实施例7
[0067]在无菌工作台中，准备一12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤及灭菌除热原处理)，注射用水冲洗干燥;分别配制带阳离子基团材料的A液(lmg/ml胶原，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=3.5)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0.15mo I /L NaC I，pH=6); B液中再加入舒尼替尼海藻酸钠微球(浓度1.0mg/ml，微球直径1μπι至15μπι;载药量6.28%)4液中再加入靶向多肽(1乂10—411^/1111)搅拌均勾，靶向多肽氨基酸顺序为:精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸;把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥，接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作50次;最后再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载舒尼替尼药物植入式组织粘贴膜。
[0068]实施例8
[0069]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的透明质酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)简称B液;B液中再加入神经节苷脂海藻酸钠微球(浓度1.0mg/ml，微球直径0.15μπι至0.26ym;载药量7.3 % )搅拌均匀与靶向多肽(I X 10—4mg/ml)，靶向多肽氨基酸顺序为:缬氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丙氨酸-脯氨酸-甘氨酸，将平板先浸入A溶液中20分钟，取出入清洗液洗涤干燥;再将平板浸入B溶液中30分钟，取出入清洗液洗涤干燥，如此交替进行30次，最后用注射用水冲洗，干燥，揭膜，得载神经节苷脂药物植入式组织粘贴膜。
[0070]实施例9
[0071]在无菌工作台中，准备一12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤及灭菌除热原处理)，注射用水冲洗干燥;分别配制带阳离子基团材料的A液(lmg/ml胶原，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=3.5)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0.15mol/L NaCl，pH = 6) ;B液中再加入抗菌肽(1.5mg/ml);把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥，接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作80次;最后再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载抗菌肽药物植入式组织粘贴膜。
[0072]实施例10
[0073]在无菌工作台中，准备一12厘米直径培养皿，内置一张同样直径高分子材料膜(经洗涤及灭菌除热原处理)，注射用水冲洗干燥;分别配制带阳离子基团材料的A液(lmg/ml胶原，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=3.5)和带阴离子基团材料的B液(lmg/ml透明质酸，0.15mol/L NaCl，pH=6);B液中再加入白介素-2(0.5mg/ml);把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥，接着高压瞬时喷涂B液，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作50次;最后再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗，干燥，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载白介素-2药物植入式组织粘贴膜。
[0074]实施例11
[0075]将实施例1-10制备获得的载药组织粘贴膜给药系统进行生物相容性评价检测，具备优良的生物相容性，具体如下:
[0076]1.细胞毒性试验:
[0077]参照/ 技术标准:GB/T 16886.5-2003
[0078]细胞株:L_929细胞(小鼠成纤维细胞)
[0079 ]培养液:含1 % (V/V)小牛血清的DMEM
[0080]空白对照:同批细胞培养液
[0081 ]阴性对照:高密度聚乙烯(见GB/T16886细胞毒性试验标准)
[0082]阳性对照:5g/L苯酚溶液
[0083]浸提介质:同批不含小牛血清的DMEM
[0084]浸提时间:24小时
[0085]供试品浸提比例:lg/5ml
[0086]试验方法:浸提液试验(MTT法)
[0087]在27°C、5%C02的空白对照、阴性对照、阳性对照和供试品浸提液接触贴壁生长的细胞，培养72h后，加入MTT液，孵育4h。吸除后，加入DMSO，通过分光光度计在波长630nm下对各组进行吸光度测定，并计算细胞的相对增殖率。
[0088]结果:供试品的细胞毒性:O级
[0089]结论:参照GB/T 16886.5-2003，该供试品无细胞毒性。
[0090]2.皮内刺激试验
[0091]参照/ 技术标准:GB/T 16886.10-2005
[0092]试验动物:健康新西兰兔
[0093]浸提介质:0.9%氯化钠注射液
[0094]供试品:材料浸提液
[0095]阴性对照:同批浸提介质
[0096]接触途径:皮内注射
[0097]评判指标:观察24h、48h、72h红斑、水肿反应程度
[0098]结果:注射后24h、48h、72h注射局部及周围皮肤组织均无红斑、水肿反应，试验侧皮肤反应不大于对照侧皮肤反应。
[0099]结论:参照GB/T 16886.10-2005，该供试品无皮内刺激反应。
[0100]3.急性全身毒性试验
[0101]参照/技术标准:GB/T16886.11-1997/ASTM F 750
[0102]试验动物:健康小白鼠
[0103]浸提介质:0.9%氯化钠注射液
[0104]供试品:材料浸提液
[0105]阴性对照:同批浸提介质
[0106]接触途径:尾静脉注射
[0107]评判指标:观察4h、24h、48h、72h动物一般状态、毒性表现和死亡动物数。
[0108]结果:72h观察期内供试品组动物反应不大于阴性对照组动物。
[0109]结论:参照GB/T 16886.11-1997/ASTM F 750，该供试品急性全身毒性试验结果符合要求。
[0110]4.溶血试验
[0111]参照/ 技术标准:GB/T 16886.4-2003/GB/T 16175-1996
[0112]试验动物:健康新西兰兔
[0113]稀释抗凝兔血制备:新鲜抗凝兔血+0.9%氯化钠注射液
[0114]阴性对照:0.9%氯化钠注射液
[0115]阳性对照:蒸馏水
[0116]接触途径:尾静脉注射
[0117]试验方法:将供试品按一定比例浸入0.9%氯化钠注射液中，37°C水浴保温30min后，加入0.2ml稀释新鲜抗凝兔血，37°C水浴保温GOminJSOOrpm离心5min后取上清液，用紫外分光光度计在545nm处测定其吸光度，计算溶血率。
[0118]结果:该供试品的溶血率为0.2%。
[0119]结论:参照GB/T 16886.4-2003，该供试品的溶血试验结果符合医用材料的要求。
[0120]实施例12
[0121]稳定性和完整性试验:
[0122]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的透明质酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)简称B液;取部分B液加入小干扰核酸药物(如实施例1，10ug/mL)配制成C液，把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥成膜;接着高压瞬时喷涂液B，用注射用水冲洗;接着高压瞬时喷涂液A，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作总共4次;接着再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗;再高压瞬时喷涂C液，用注射用水冲洗，干燥，如此交替喷涂A液、C液、冲洗，重复操作总共7次，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0123]将上述制备获得的多层薄膜置于IMNaCl溶液中，孵育一定时间，将所得的缓释液先经过截留分子量为30KDa的超滤离心管过滤处理，除去大分子物质。然后经过截留分子量为3KDa的超滤离心管再过滤处理，去除缓释液中的盐离子，即脱盐处理。最后把处理过的缓释液，作为样品液在电泳槽跑胶处理。本文采用聚丙烯酰氨凝胶电泳法(PAGE)，来验证多层薄膜释放siRNA的基因完整性和相关稳定性实验。
[0124]图1的凝胶电泳实验验证缓释siRNA序列的稳定性和完整性。载SiRNA的组织粘贴膜在IM NaCl溶液中孵育，膜逐渐破裂溶解，6天后，已难以观察到成型物。从图1凝胶电泳实验中，我们可看到，6天溶解液脱盐后未能观察到解离的siRNA，而10天溶解液脱盐后能清晰地看到解离的siRNA，由此我们推测，膜在逐渐破裂溶解过程中，溶出物为siRNA与阴、阳离子基团结合体，随着阴、阳离子基团的降解，siRNA逐渐解离出来，并保持了siRNA序列的稳定性和完整性。
[0125]实施例13
[0126]细胞转染实验:
[0127]在无菌工作台中，准备一高分子材料平板(经洗涤、灭菌及除热原处理)，干燥;分别配制带阳离子基团材料的A溶液(2mg/ml壳聚糖，0.lmol/L乙酸，0.2mol/L NaCl，pH=4)和带阴离子基团材料的B液(2mg/ml的透明质酸，0.15mo 1/L NaCl，pH=6)简称B液;取部分B液加入小干扰核酸药物(如实施例1，10ug/mL)配制成C液，把上述溶液分别灌装到高压瞬时喷涂设备中，首先往培养皿内高压瞬时喷涂A液，干燥成膜;接着高压瞬时喷涂液B，用注射用水冲洗;接着高压瞬时喷涂液A，用注射用水冲洗，如此交替喷涂A液、B液、冲洗，重复操作总共4次;接着再高压瞬时喷涂A液，用注射用水冲洗;再高压瞬时喷涂C液，用注射用水冲洗，干燥，如此交替喷涂A液、C液、冲洗，重复操作总共2次，揭膜，贴面用注射用水冲洗，干燥处理得载小干扰核酸药物植入式组织粘贴膜。
[0128]将上述制备获得的组织粘贴膜作为实验组，即实验组为载有eGFP-siRNA交替聚电解质反应2次的膜，阴性对照组为载有普通siRNA交替聚电解质反应2次的膜(制备方法同实验组，仅eGFP-siRNA替换为普通siRNA)。将实验组和阴性对照组分别放置6孔板中，分别将eGFP-HEK 293T细胞接种于其上的6孔板中(另外将未放置粘贴膜的孔直接接种细胞作为空白对照组)，分别于I天、2天和3天观察其荧光强度变化情况，结果显示图2。图3中，列出了实验组、阴性对照组和空白组的相对荧光强度，可以看到，空白组和阴性对照组在3天内荧光强度几乎没有变化，而实验组在3天内随着时间增加荧光强度明显减少。由次验证载有eGFPsiRNA的组织粘贴膜能使eGFP-HEK 293T细胞的荧光强度减弱，说明eGFP siRNA转染进细胞诱导了靶基因沉默。
[0129]综上所述，本发明效克服了现有技术中的种种缺点而具高度产业利用价值。
[0130]上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
【主权项】
1.一种载药组织粘贴膜，所述载药组织粘贴膜包括交替叠加的阳离子层和阴离子层，所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层、或所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物，所述药物为核酸药物。2.如权利要求1所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层时，作为药物层的阳离子层和/或阴离子层为带电荷的药物，不作为药物层的阳离子层含有带阳离子基团的载体材料，不作为药物层的阴离子层含有带阴离子基团的载体材料；当所述阳离子层和阴离子层中的至少一层含有带电荷的药物时，阳离子层含有带阳离子基团的载体材料，阴离子层含有带阴离子基团的载体材料。3.如权利要求2所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，所述带阳离子基团的载体材料选自带阳离子基团的有机高分子聚合物、带阳离子基团的多聚糖、带阳离子基团的多肽、带阳离子基团的蛋白、以及阳离子脂质体中的一种或多种的组合。4.如权利要求2所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，所述带阴离子基团的载体材料选自带阴离子基团的有机高分子聚合物、带阴离子基团的多聚糖、带阴离子基团的多肽、带阴离子基团的蛋白、以及阴离子脂质体中的一种或多种的组合。5.如权利要求2所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，所述带阳离子基团的载体材料和带阴离子基团的载体材料选用生物相容性材料。6.如权利要求1所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，所述阳离子层整体上显示为正电荷，所述阴离子层整体上显示为负电荷。7.如权利要求1所述的一种载药组织粘贴膜，其特征在于，所述带电荷的药物为药物复合体。8.如权利要求1-7任一权利要求所述的载药组织粘贴膜的制备方法，包括如下步骤:在基板上交替沉积阳离子层和阴离子层，制备获得组织粘贴膜。9.一种组织粘贴膜在制备药物载体材料中用途，所述组织粘贴膜包括交替叠加的阳离子层和阴离子层。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述阳离子层和阴离子层中的至少一层为药物层或所述阳离子层和阴离子层中的至少一层用于包含带电荷的药物。
【文档编号】A61K9/70GK105832709SQ201610142812
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2016年3月14日
【发明人】吴昌琳, 刘光万, 吴丽娟, 赵芳
【申请人】苏州博创康源生物技术有限公司