环境响应型含肽类树状分子脂质材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学材料领域，特别涉及一种具有环境响应能力的组装体及其制 备方法与应用。 技术背景
[0002] 越来越多与基因相关的疾病被认为是可以利用基因治疗的方法治愈，这些疗法通 常需要将核酸药物递送到靶细胞，从而对一些肿瘤、哮喘和心血管疾病进行治疗。但基因是 带负电的遗传物质，很难自身穿过细胞膜，因此目前能将其有效装载的合成载体通常是高 密度正电性的，许多阳离子脂质和聚合物系统被人们所开发。这种高密度的正电荷载体与 基因装配后有利于细胞摄取，但会带来细胞毒性高的副作用，同时还会造成遗传物质包载 过紧、在靶组织或细胞内释放不完全从而导致正电荷载体在体内、外转染的效果较差的后 果。
【发明内容】
[0003] 研究证明，细胞内外的谷胱甘肽（GSH)浓度具有明显差异，细胞浆中的GSH浓度较 高，而血液循环中的GSH浓度只有细胞内的千分之一左右。比如，细胞外的GSH只有1-10 y M左右，而胞浆中的GSH则高达毫摩尔级（1-10 mM)。
[0004] 此外，正常组织中其体液pH为7. 4即正常生理环境，而在肿瘤组织中由于肿瘤组 织的供氧不足而产生乳酸和三磷酸腺苷（ATP)水解的产物，导致肿瘤组织pH值降低至6. 8。 继而载体颗粒进入细胞形成内涵体，随着细胞质中的氢离子被栗入使得纳米粒所在微环境 的pH值进一步降低（〈5. 5)。普通的基因载体在这种转染环境中会无法避免DNA在酸性条 件下发生降解，降低了转染效率。而利用这种转染过程中所遇到的阶梯式pH下降所设计的 多重刺激响应型的病毒载体，可以智能化的增加细胞对基因的吞噬能力和从溶酶体的逃逸 能力，大大加强了基因到达肿瘤细胞核的概率。
[0005] 目前也有不少研究利用这种差异合成、构建了还原环境响应或pH响应的基因输 送载体。这些载体在体外能高效的装配核酸，在到达肿瘤部位后或细胞内后能响应性的发 生还原、pH敏感键断裂，载体电荷变化、降解，释放遗传物质，从而提高转染效果，也降低载 体的毒性。
[0006] 但要想达到精确定位和可控释放则需要设计的载体在肿瘤组织和细胞内都能发 生灵敏的生物响应。因此，开发出具有较低细胞毒性、且高转染效率的基因输送载体是行 业亟待解决的问题。现在最常用的阳离子脂质载体中通常都含有各种阳离子磷脂成分，如 D0GS、D0SPA等。这些磷脂成分在释放DNA后，由于降解缓慢会极大的地损伤细胞器而造成 很高的细胞毒性。此外，过高的正电荷也会因吸附过多的非特异性血浆蛋白而导致转染效 率在有血清条件下或在体内条件下急剧下降。将机体自有的氨基酸和易降解的酰胺键加入 脂质中增加了载体的生物降解性，而制备出的表面电荷为负的脂质体也有效降低了传统脂 质体的毒性。
[0007] 基于上述研究分析，本发明提供了一种能够利用转染过程中正常组织与病理组织 间、或细胞内外微环境的差异设计的能够有效传递基因的环境响应系统以及其制备方法， 并将其应用于体内外基因转染、肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗等方面。此基因载体系 统主要有两个部分组成：质粒DNA、环境响应型含肽类树状分子脂质组装载体。将环境响应 型含肽类树状分子脂质组装载体按照不同比例通过静电作用与DNA混合，获得具有环境响 应能力的复合物。采用还原/pH响应机制，使得载体具有随着输送环境不同产生变化，完成 入胞、溶酶体逃逸、基因释放等过程的特性，可以提高基因运输的效率，降低毒性，并远优于 非响应性基因载体。
[0008] 本发明通过以下技术方案来实现： 一种环境响应型含肽类树状分子脂质材料，所述脂质材料的主体为外围含氨基和\或 胍基的树状分子，构成所述脂质材料的亲水端，所述树状分子的一端连接有疏水基团，构成 所述脂质材料的疏水端，所述亲水端与疏水端之间的连接分子中含有还原敏感的二硫键或 二硒键。该还原敏感的二硫键或二硒键在高浓度还原物质条件下(如细胞质中或肿瘤、炎症 部位等)会断裂，从而使所述脂质材料具有还原环境响应特性。所述两亲性的脂质材料可通 过亲疏水作用自组装成纳米尺寸的脂质体或胶束或囊泡，在其中包裹药物或基因可形成药 物或基因载体系统，当所述载体系统进入高浓度还原物质环境时，还原敏感键断裂，发生解 组装，可释放出药物或基因。
[0009] 作为可选方式，所述环境响应型含肽类树状分子脂质材料的结构式如下：
......(式 1) 其中，K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表不一代和n代树状分子，n为2或3或 4或5, X-X为具有还原响应功能的连接分子，X为S或Se，R为疏水基团。
[0010] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，所述树状分子的 亲水端还连接有具有pH响应功能的亲水性基团，所述具有pH响应功能的亲水性基团与所 述树状分子末端的氨基或胍基相连，通过在所述所述树状分子末端的氨基或胍基上连接具 有pH响应功能的亲水性基团，既保证了亲水端具有的良好的亲水性，又使所述脂质材料具 备还原响应和pH响应的双重环境响应特性。进一步的，所述具有pH响应功能的亲水性基 团还具有电负性，对树状分子外围的氨基和\或胍基的正电荷具有屏蔽作用，使所述脂质 材料整体带负电荷，能够形成具有较高负电荷的自组装体，可与不同的药物或阳离子基因 载体、基因一起组成负电性的、中性的或微正电的具有pH响应能力的复合物，该复合物可 以在肿瘤组织外正常pH环境下保持稳定，不会与体内负电性物质发生聚合，同时还可以保 护DNA不被血清中的脱氧核糖核酸酶（DNase)降解，从而可以在体内进行长时间循环。同 时，所述具有pH响应功能的亲水性基团，能够在一定的酸性条件下断裂脱落，当环境pH低 于7. 4时(如肿瘤组织处或细胞溶酶体的微环境)，具有pH响应功能的亲水性基团断裂脱 落，使得基因复合物发生电荷翻转或者正电荷增多，利于与负电的细胞膜发生吸附作用，从 而更好地被细胞内吞，增强了载体入胞能力。在内吞入胞后，当环境中还原物质浓度升高到 毫摩尔级时，链接亲水部分和疏水部分的二硫键或二硒键断裂，组装体被破坏，迅速释放其 压缩装载的基因，可以提尚基因运输的效率。^硫键和^砸键的引入还能使尚正电荷的聚 集体快速降解，从而降低毒性。
[0011] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，所述具有pH响 应功能的亲水性基团优选为A类基团或B类基团中的至少一种，其中A类基团在环境pH 为6. 8以下时能够断裂脱落，B类基团在环境pH为5. 5以下时能够断裂脱落。当环境pH 在6.8以下时(如肿瘤组织处)，A类基团断裂脱落，使得三元复合物发生电荷翻转或者正 电荷增多，利于与负电的细胞膜发生吸附作用，从而更好地被细胞内吞，增强了载体入胞能 力。而内吞入胞后，当环境pH在5. 5以下时(所形成的细胞溶酶体的微环境)，B类基团发 生断裂，暴露更多的氨基，使得质子缓冲能力和破坏溶酶体膜的能力增加，达到加速从溶酶 体中逃逸的效果，同时环境中还原物质浓度升高到毫摩尔级，连接亲水部分和疏水部分的 二硫键或二硒键断裂，组装体被破坏，迅速释放其压缩装载的基因，还可以进一步提高基因 运输的效率。采用pH响应机制，使得载体具有类似病毒随着环境的变化而完成入胞、逃逸 等过程，可以提尚基因运输的效率，并远优于非响应性基因载体。进一步的，所述A类基
[0012] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，其结构式如下：
......(式 2) 其中，K为树状分子的重复单元，G1和Gn分别表不一代和n代树状分子，n为2或3或 4或5，X-X为具有还原响应功能的连接分子，X为S或Se，Rl为疏水基团，R2为具有pH响 应功能的亲水性基团。
[0013] 进一步的，其结构式为：
其中，R2为具有pH响应功能的亲水性基团，R1为疏水基团。
[0014] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，具有pH响应功能 的亲水性基团只含有A类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入 体内，同样具有屏蔽体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 6.8断裂的 pH敏感型基团的复合物在进入肿瘤组织后发生电荷翻转或者正电荷增多，获得更强的入胞 能力，从而有利于药物或基因的传递。
[0015] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，具有pH响应功能 的亲水性基团只含有B类基团。所述脂质材料具有一重pH响应特性。当此类组装体进入 体内，同样具有屏蔽体内负电性物质干扰和保护DNA的作用。只含有能够在pH 5.5断裂的 pH敏感型基团的复合物在进入细胞后，才发生电荷翻转或者正电荷增多，增强传递系统破 坏溶酶体膜的能力，阻碍了溶酶体酶对DNA的降解，从而实现基因的高表达或药物的有效 释放。
[0016] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，单个脂质分子结 构中同时含有A类基团和B类基团，所述脂质材料具有多重pH响应特性。
[0017] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，所述脂质材料为 只含A类基团的脂质与只含B类基团的脂质的混合物，所述脂质材料具有多重pH响应特 性。进一步的，所述脂质材料是由两种类型的pH响应型脂质（分别含A类基团和B类基团） 按不同同比例混合后制备成混合自组装体。所述自组装体的制备可采用溶剂注入法或薄膜 超声法等常用的自组装体制备方法（具体方法可参见《现代药物制剂技术丛书一一脂质体 技术》，邓杰英主编，人民卫生出版社2007年出版）。
[0018] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，所述树状大分子 结构中50%以上的氨基上修饰pH响应型基团。足够高的接枝率才有利于保证所述脂质材 料具有$父尚的电负性。
[0019] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，所述疏水基团为 饱和或不饱和烃基或胆固醇衍生物。本发明中的烃基是指含碳、氢两种原子的官能团，可以 看作是相应的烃失去一个氢原子（H)后剩下的自由基。优选为烷基、烯基，芳香基、更优选 为C10-C20的烷基、C10-C20的烯基、含有芳香基的氨基酸衍生物。
[0020] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子脂质材料中，可以选择具有多 官能度的分子作为桥接单元来将疏水基团连接到树状分子的一端，可选用肽键连接，也可 选用其他的连接方式代替肽键连接，所述桥接单元分子内部或桥接单元与亲水端连接处或 桥接单元与或水端连接处三个位置中的至少一处通过依靠具有还原敏感的二硫键或二硒 键的分子连接；也可以将疏水基团直接通过具有还原敏感的二硫键或二硒键的分子连接到 树状分子的一端。总之，以使树状分子的一端具备疏水性同时使脂质材料的亲水端与疏水 端之间通过还原敏感键连接为目的，具体的连接方式可灵活选择。
[0021] 作为可选方式，在上述环境响应型含肽类树状分子材料中，所述疏水基团依靠赖 氨酸通过肽键连接，所述赖氨酸的另一端在通过具有还原敏感的二硫键或二硒键的分子连 接到树状分子上。赖氨酸中的氨基通过肽键与具有还原敏感的二硫键或二硒键的分子一端 相连，