毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。
【背景技术】
[0002]癌症是恶性肿瘤的统称。白血病是一种预后较差，死亡率较高的恶性肿瘤疾病，其严重危害人类健康和生命，曾被称为不治之症。急性白血病是病情非常凶险的一种疾病，患急性白血病患者若不经特殊治疗，其生存时间最多只有三个月，若该患者受到感染，或者是颅内出血，必死无疑。白血病治疗的一个重要手段是化疗，大部分病人往往会因白血病细胞的多药耐药而导致化疗无效或逐渐由有效转为无效。
[0003]金纳米颗粒(gold nanoparticle, Au)因其独特的结构、催化性能等优点在大多领域得到了广泛应用，在过去的十年，Au已在临床诊断和治疗癌症过程中得到了广泛应用，并且随着纳米技术的不断发展，作为一种有效、安全的药物载体，Au在癌症治疗领域获得越来越多的关注。
[0004]《毛蕊花苷对MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡的保护作用》中虽然公开了毛蕊花苷(Verbascoside, VB)能抑制MPP+诱导的SHSY5Y细胞凋亡，并且VB对神经细胞的保护作用可能与其降低细胞内活性氧水平，维持线粒体膜电位的高能状态和抑制Caspase-3的活性有关。然而，上述发明所指向的病症是帕金森病，并没有提及VB对肿瘤细胞特别是人白血病细胞K562的作用。本领域技术人员并不清楚VB是否具有促进肿瘤细胞凋亡进而达到抑制肿瘤生长的作用。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物(VB-Au)在治疗人或动物白血病中的应用。
[0006]本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
[0007]VB-Au在制备治疗人或动物白血病的药物中的应用；优选VB-Au在制备诱导人白血病细胞K562凋亡的药物中的应用。
[0008]本发明所述的应用，优选将VB包被Au制备成VB-Au复合物使用。本发明所述的VB-Au复合物可通过现有技术制备。
[0009]有益效果:
[0010]实验研究表明，同正常对照组(NC)相比，VB或VB-Au复合物均能促使人白血病K562细胞在体内外发生凋亡，但同VB处理组相比，VB-Au在体内外促使人白血病K562细胞发生凋亡的作用更加显著，加之VB-Au复合物成本低、易合成、毒副作用小等，因此VB-Au复合物有望用于制备治疗人或动物白血病药物。
【附图说明】
[0011]图1显示运用电镜鉴定合成的VB-Au复合物。A和C:Au纳米颗粒的扫描电镜图(A)和透射电镜图(C)出和D:VB-Au的扫描电镜图⑶和透射电镜图⑶。
[0012]图2显示电镜观察K562细胞经VB-Au处理48h后，细胞核凝缩及核碎裂情况。A和C:未经处理的K562细胞的透射电镜图㈧和扫描电镜图(C) ；B和D:经VB-Au处理的K562细胞的透射电镜图⑶和扫描电镜图(D)。
[0013]图3显示经VB-Au处理后K562细胞的凋亡状况。A:未经处理的K562细胞；B，C和D:经VB-Au处理24h(B)，48h(C)及72h(D)后，凋亡的K562细胞量不断增加。
[0014]图4显示经Au，VB及VB-Au分别处理K562细胞72h后，MTT检测各组细胞的细胞活力。结果显示，同未经处理的细胞(NC)相比，VB及VB-Au都可明显抑制细胞的活力，而VB-Au抑制细胞活力的作用比VB更显著。
[0015]图5显示经Au，VB及VB-Au分别处理K562细胞72h后，流式细胞术检测各组细胞的凋亡。图6为对图5细胞凋亡的定量分析。同样发现，同未经处理的细胞(NC)相比，VB及VB-Au都可显著诱导细胞的凋亡，而VB-Au促使细胞凋亡的作用比VB更显著。
[0016]图7显示进一步运用吖啶橙/溴化乙锭染色(Α0/ΕΒ染色)分析经VB-Au处理的K562细胞的凋亡情况。A和B:K562细胞经VB-Au复合物处理24h前(A)、后(B)的早期凋亡图；C和D:K562细胞经VB-Au复合物处理72h前(C)、后(D)的晚期凋亡图。
[0017]图8显示K562细胞经不同组处理后发生凋亡的DNA片段分析图。A:为各组处理24h后的结果:为各组处理细胞48h后的结果；C:为各组处理72h后的结果；D:为各组处理Oh的图片。其中，泳道I为正常对照组，泳道2为经VB单独处理组，泳道3为经VB-Au复合物处理组。结果显示，VB和VB-Au都可时间依赖性的诱导细胞发生凋亡，然而，同VB处理组相比，VB-Au诱导细胞凋亡的作用更加显著。
[0018]图9显示免疫印迹法(Western Blot)检测经Au，VB及VB-Au处理的K562细胞中相关凋亡蛋白的表达。A:检测各处理组细胞中Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleavedcas 3蛋白的表达水平，其中泳道I为未经过处理的正常的K562细胞；泳道2为经Au处理的K562细胞；泳道3为经VB处理的K562细胞；泳道4为经VB-Au复合物处理的K562细胞；B，C 和 D:分别为对 Cleaved cas 9(B)、Cleaved cas 8 (C)和 Cleaved cas 3 (D)蛋白表达的定量分析。结果显示，VB和VB-Au都可诱导以上3中凋亡相关蛋白的表达，但同VB处理组相比，VB-Au可更有效的诱导Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleaved cas 3蛋白的表达。
[0019]图10显示经腹腔注射VB-Au及其他对照组后，各组小鼠K562肿瘤的改变。A和C:植瘤小鼠经腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au后，检测各组小鼠肿瘤的大小，其中图(A)为肿瘤图片观察，图(C)为肿瘤体积检测；B:各组植瘤小鼠注射PBS、Au、VB和VB-Au期间，肿瘤体积随时间的变化情况；D:各组小鼠肿瘤组织进行苏木素-伊红染色(H-E染色)分析。结果表明，同PBS组相比，经VB和VB-Au治疗后可显著抑制小鼠K562肿瘤的生长、诱导组织中肿瘤细胞的凋亡。但VB-Au复合物的作用较VB更显著。
【具体实施方式】
[0020]实施例1
[0021]在5ml 20nm的金纳米颗粒(Au)溶液中，加入0.4ml水和2.6ml IM的SH-PEG-C00H (分子量 5000)，15min 后，加入 4ml 的 1M 的 SH-PEG (分子量 5000)，20min 后，离心(10000g/min，30min)，取底部沉淀液，去离子水稀释到5ml，碳酸钾溶液调PH为8，加热到60度，随后，加入2ml IM的毛蕊花糖苷(VB)溶液，进行酯化反应。反应2h后，离心去底部沉淀液，即为20nm的金纳米颗粒共价键修饰毛蕊花糖苷的复合物(VB-Au)。最后可通过扫描电子显微镜(SEM)和透射电子显微镜(TEM)分别测量Au和VB-Au复合物的大小，结果见图1，由图可看出，VB-Au纳米颗粒复合物的大小约为20nm。
[0022]实施例2
[0023]K562细胞购自天津血液学研究所，用添加10% GIBCO胎牛血清和青霉素(100U/ml)的1640培养基，在37°C、pH值7.2?7.4，二氧化碳浓度为5%，且湿气充足的培养箱中无菌恒温培养。为了检测VB-Au对K562细胞活力的影响，取100 μ L VB-Au加入到Κ562细胞中，继续放于培养箱中培养。培养48h后，运用SEM和TEM观察细胞的形态变化，结果见图2，由图A，B可看出，细胞加药后发生核破裂，由图C，D可看出，细胞加药后发生核萎缩。
[0024]实施例3
[0025]将K562细胞接种到孔板中，其中一组作为正常对照组，其余分别添加100 μ LVB-Au纳米颗粒复合物，于37 °C、pH值7.2?7.4，二氧化碳浓度为5%并且湿气充足的培养箱中分别培养24h、48h、72h，用显微镜观察细胞的凋亡状况，结果见图3，由图可知，VB-Au可促使细胞发生凋亡，并且随着处理时间的延长，凋亡的细胞数量也逐渐增加。
[0026]实施例4
[0027]将K562细胞进行计数，根据计数结果将K562细胞按2X 14Cells/孔的密度接种于96孔板中，每孔100 μ L。于37°C、pH值7.2?7.4，二氧化碳浓度为5%并且湿气充足的培