养箱中培养24h，其中一组作为正常对照组，其余分别添加5 μ L Au、VB及VB-Au纳米颗粒复合物，72h后，向各孔中加入1yL MTT(5mg/mL)，37°C培养箱继续培养4h，取出孔板，弃培养液，向各孔中加入100 μ L DMS0，溶解紫色结晶，然后将96孔板放入酶标仪中37°C孵育lOmin，在570nm波长下读取吸光度值。结果见图4，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒处理后的K562细胞的活力显著降低，即=VB-Au可有效抑制细胞的存活。
[0028]实施例5
[0029]将K562细胞接种到1cm培养皿中，其中一组作为正常对照组，其余添加200uLVB-Au纳米颗粒后于37°C、pH值7.2?7.4，二氧化碳浓度为5%并且湿气充足的培养箱中培养72h，收集细胞进行流式检测，步骤如下:
[0030](I)将K562细胞收集到15mL的离心管中，每样本细胞数为lX106cells/mL，1000r/min离心5min，弃去培养液。
[0031](2)用PBS缓冲液洗涤I次，1000r/min离心5min，弃去上清液。
[0032](3)用100 μ L的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10?15min。
[0033](4) 1000r/min离心5min，沉淀细胞用PBS缓冲液洗I次。
[0034](5)加入荧光溶液4°C下孵育20min，避光并不时振动。
[0035](6)流式细胞仪分析:流式细胞仪激发光波长用488nm，用一波长为515nm的通带滤器检测FITC焚光，另一波长大于560nm的滤器检测PI。
[0036](7)结果判断:凋亡细胞对所有用于细胞活性鉴定的染料如PI有抗染性，坏死细胞则不能。细胞膜有损伤的细胞的DNA可被PI着染产生红色荧光，而细胞膜保持完好的细胞则不会有红色荧光产生。因此，在细胞凋亡的早期PI不会着染而没有红色荧光信号。正常活细胞与此相似。在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限显示活细胞，为(FITC-/P1-);右上象限是非活细胞，即坏死细胞，为(FITC+/PI+);而右下象限为凋亡细胞，显现(FITC+/P1-)。结果见图5，由图可知，经VB-Au纳米颗粒复合物处理后的K562细胞凋亡的细胞量最多。根据实
[0037]施例5的实验，对实验结果进行定量分析，结果见图6，由图可知，同VB处理组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理后，K562细胞凋亡的数量显著增加。
[0038]实施例7
[0039]将K562细胞接种到孔板中，添加20 μ L VB-Au纳米颗粒复合物后于37°C、pH值
7.2?7.4，二氧化碳浓度为5%并且湿气充足的培养箱中培养24h或72h，用胰酶消化细胞，随后向细胞悬液中加入I μ L Α0/ΕΒ染色液混合物(100 μ g/mL吖啶橙和100 μ g/mL溴化乙锭)，在荧光显微镜下观察凋亡的细胞，结果见图7。由图可知，同未经处理的正常细胞相比，经VB-Au纳米颗粒处理的K562细胞经染色后橙红色或红色的细胞(注:发生凋亡的细胞显示红色)量增加，并且随着处理时间的延长，凋亡细胞的数量显著增加。
[0040]实施例8
[0041](I)收集分别经VB、VB-Au纳米颗粒复合物处理24h、48h和72h后的K562细胞17个到15mL离心管中，以100rpm离心5min后去上清液，其中未经处理的正常细胞作为对照；
[0042](2)向所述15mL离心管中加入50 μ L细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500rpm离心5min后，取上层液A于1.5mL离心管中；再次向所述15mL离心管中加入50 μ L所述细胞裂解液，吹打混匀10秒钟，以4500rpm离心5min，取上层液A和B于所述1.5mL离心管中；
[0043](3)于所述1.5mL离心管中加入5 μ L A液混匀，放入30°C ± 1°C孵育1min ；
[0044](4)再于所述1.5mL离心管中加入5 μ L B液混匀，放入50°C ± 1°C水浴锅中过夜孵育10?12h ；
[0045](5)再于所述1.5mL离心管中加入5 μ L醋酸铵溶液混匀，并加入100 μ L异丙醇充分混匀后放入_20°C冷冻lOmin，然后以13000rpm离心lOmin，去除上层液C，得到DNAladder 沉淀；
[0046](6)所述DNA ladder沉淀中加入500 μ L的质量浓度为70%的乙醇，以13000rpm离心lOmin，去除上层液D，得到洗涤后的DNA ladder沉淀；
[0047](7)所述洗涤后的DNA ladder沉淀室温下瞭干1min后加入30 μ L DNAladder溶解液，然后采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验，Ih后采用凝胶成像系统进行紫外检测即可。
[0048]所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行凝胶电泳实验的条件是指琼脂糖胶的质量浓度为1.2%，电压为80V，温度为常温，进样方式为点样，进样量为10 μ L。
[0049]所述步骤(7)中采用凝胶成像系统进行紫外检测的条件是指波长为254nm，温度为常温，进样量为10 μ Lo
[0050]结果见图8，由图可知，未经处理的正常Κ562细胞没有凋亡条带出现，且同VB处理组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理的K562细胞经提取DNA ladder后可见清晰条带，并且随着处理时间的延长，条带越清晰。由此可见，同单独VB处理组相比，VB-Au纳米颗粒复合物促使K562细胞发生凋亡的效果最好。
[0051]实施例9
[0052]向处于对数期的K562细胞中加入等量的Au、VB、VB-Au，分别培养48h，其中，未处理的正常细胞作为对照。收集处理的细胞，用RIPA缓冲液进行裂解提取蛋白，随后用BCA试剂盒测定蛋白浓度，然后将等量样品上样到配制好的10% SDS-PAGE胶上，进行电泳，随后进行转膜、封闭、孵育抗体及显影。结果见图9，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物处理的K562细胞，促凋亡蛋白Cleaved cas 9、Cleaved cas 8和Cleaved cas3的表达量明显增加，因而，VB-Au纳米颗粒复合物可更好的促使K562细胞发生凋亡。
[0053]实施例10
[0054]取处于对数期的K562细胞，对8只裸鼠出周龄的雌鼠)进行皮下植瘤，每2天观察一次肿瘤生长情况。约植瘤后一周，待肿瘤生长至200_3，将植瘤鼠随机分四组，分别经腹腔注射PBS、Au、VB和VB-Au，注射剂量为200 μ L/次，隔天给药并持续给药2_3周。给药结束后，处死裸鼠并取出肿瘤。经石蜡包埋，制成切片，经H-E染色观察不同组之间肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡情况。结果见图10，由图可知，同其他对照组相比，经VB-Au纳米颗粒复合物注射后，小鼠肿瘤的体积明显减小，且肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡显著增加，说明VB-Au纳米颗粒复合物可更有效的抑制肿瘤生长，促使肿瘤细胞的凋亡。
【主权项】
1.毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于将毛蕊花苷包被金纳米颗粒制备成毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在制备诱导人白血病细胞K562凋亡的药物中的应用。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在抑制人白血病恶性肿瘤生长，诱导肿瘤组织中肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物在治疗人或动物白血病中的应用。经过多种实验充分证明了，毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物可明显降低肿瘤细胞的活力、增强肿瘤细胞的凋亡，特别地毛蕊花苷-金纳米颗粒复合物可显著抑制植瘤小鼠肿瘤的生长、诱导小鼠肿瘤组织中肿瘤细胞的凋亡，为癌症的治疗提供了一种新思路。
【IPC分类】A61K31/7032, A61P35/02, A61K47/48
【公开号】CN105056249
【申请号】CN201510435728
【发明人】袁毅, 张亚琴, 刘宾, 郭志睿, 吴友农, 张伟
【申请人】袁毅, 南京医科大学附属口腔医院
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年7月22日