专利名称：一种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体及其制备方法。
背景技术：
通过表达生物活性物质、抑制导致基因紊乱或不可控细胞增值的功能异常基因等策略来进行基因治疗是预防和治疗遗传缺陷性疾病、感染、肿瘤和心血管等诸多重大疾病的有力方法。目前，缺乏安全而有效的基因载体是限制基因治疗在临床上的广泛应用的主要瓶颈。尽管病毒载体，比如腺病毒、逆转录病毒和慢病毒，具有高转染效率，其潜在的免疫原性和生产控制、成本等问题阻碍了其应用。与病毒载体相比，非病毒载体具有许多优点，例如低免疫原性和毒性、易于合成并批量生产、成本低、稳定性好、易于通过结构调整传递分子大小不同的一系列核酸类药物等。因此，开发有效的非病毒载体是近年来化学、材料、药学、生物学、医学和纳米科学等学科交叉研究的前沿领域之一。
通过使用一系列阳离子磷脂和聚合物可以实现核酸药物的凝聚和传递，其中包括Lipofectamine 2000、类磷脂化合物、聚こ烯亚胺(PEI)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚ニ甲基ニ烯丙基胺盐酸盐(PDADMAC)、聚[2- (ニ甲基胺基)-こ基丙烯酸甲酷](PDMAEMA)、阳离子型聚丙烯酰胺(CPAM)、聚精氨酸，以及天然的壳聚糖(Chitosan)及其衍生物等。此外,近年来新合成的用于基因转染的可降解聚阳离子电解质有聚磷酸酯为主链的阳离子聚电解质、聚(4-羟基-L-脯氨酸酷)、聚(L-丝氨酸酷)型阳离子聚合物、聚[a-(4-氨基丁基)-L-こ醇酸]、聚(β -胺基酷)型阳离子聚电解质、环糊精主链型阳离子聚电解质、聚(L-天冬酰胺)型阳离子聚电解质、以及阳离子聚磷腈等。这些载体系统的最終转染效率取决于其分子结构。另外，可以将核酸类药物包裹或吸附于微胶囊(Microcapsule)、迷你细胞(MinicelI)、脂质体(Liposome)、脂质纳米粒、聚合物纳米粒、无机纳米粒、有机/无机杂化纳米粒及DNA/RNA组装体等微纳结构中，实现其细胞内化、转运及靶部位转染。尽管最近十年来开发了包括上述阳离子型材料和聚合物納米粒在内的许多非病毒型载体系统，这些工作只取得了有限的成功，仅有个别系统目前进入临床研究。阳离子型聚合物载体，由于其与核酸类药物主要通过静电作用络合，最终络合物易于受到血液和细胞外液大量存在的多聚阴离子的影响而解络合，从而无法到达靶部位实现理想的转染。另外，对于低分子量核酸类药物匕如反义核苷酸、siRNA和miciORNA)，其本身的刚性结构和较低的电荷密度往往导致不完全的凝聚。尽管通过使用高电荷密度和高分子的载体可以部分解决这些问题，但又会导致细胞毒性、组织损伤和血栓形成明显加剧。另ー方面,对于反义核苷酸、siRNA和microRNA等核苷酸，其良好的水溶性和低表面电荷限制了有效包裹，因此聚合物或其他有机纳米对该类核酸类药物的负载效率较低。因此，探寻安全、高效、低成本且易于批量生产的非病毒纳米载体依然是ー项极具挑战性的工作
发明内容
本发明的目的是提供一种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体及其制备方法。为了达到上述目的，本发明采取以下措施本发明所述的能高效负载核酸类药物的复合纳米载体由可降解有机材料和不同分子量多聚胺组成，其中 不同分子量多聚胺与可降解有机材料的质量比为O. 005 100-3 7 ;该复合纳米载体为球形，粒径为80-950 nm，核酸类药物均匀分布于其中。上述可降解有机材料选自聚乳酸(PLA)、聚丙交酯-こ交酯(PLGA)、聚ε -己内酯(PCL)、聚原酸酷、缩醛化α-环糊精、缩醛化环糊精、缩醛化Y-环糊精、缩醛化α-环糊精聚合物或缩醛化β_环糊精聚合物；其中聚合物类可降解有机材料的分子量为1-100kDa ο上述不同分子量多聚胺选自低分子量多聚胺或聚こ烯亚胺；其中聚こ烯亚胺的分子量为 O. 6-50 kDa O上述低分子量多聚胺选自亚精胺(Spermidine)、精胺(Spermine)或腐胺(Putrescineノ。上述能高效负载核酸类药物的复合纳米载体的制备方法如下首先将核酸类药物溶于水中得到内水相，将可降解有机材料与不同分子量多聚胺溶解在有机溶剂中得到有机相，将聚こ烯醇(PVA)的水溶液作为外水相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声作用下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到本发明所述的能高效负载核酸类药物的复合纳米载体。在上述制备方法中，所述有机溶剂选自ニ氯甲烷、氯仿或こ酸こ酷。在上述制备方法中，所述核酸类药物在内水相中的浓度为O. 00001-1000 nmol/μ I。在上述制备方法中，所述可降解有机材料在有机相中的浓度为O. 5 -5000 mg/ml。在上述制备方法中，所述内水相和有机相的体积比为O. 005 1-0. 5 :1。在上述制备方法中，所述有机相和外水相的体积比为O. 005 1-0. 5:1。在上述制备方法中，所述聚こ烯醇在外水相中的质量百分浓度为O. 001-10%;其中聚こ烯醇的分子量为1-100 kDa，摩尔水解度为60-90%。本发明的优点是(I)本发明所使用的缩醛化环糊精材料合成简单、易于放大、且成本较低；其他可降解有机材料和不同分子量多聚胺均有市售产品，其价格相对低廉，故易于实现相应复合纳米载体的产业化。(2)本发明所选用的可降解有机材料和低分子量多聚胺或低分子量聚こ烯亚胺均有较好的体内外相容性；而使用高分子量聚こ烯亚胺时，用量很低，因此保证了最終复合纳米载体的体内相容性。(3)本发明所采用的双乳液法简单易行，且使用的低沸点溶剂易于去除，保证了最终复合纳米载体应用的可行性和安全性。(4)本发明所制备的复合纳米载体微粒的大小可以通过制备エ艺參数来调控。(5)本发明所采用的复合纳米载体制备方法可以实现核酸类药物的高效包裏。
(6)本发明所制备的复合纳米载体中核酸类药物均匀分布，易于在细胞内或其他靶部位释放。(7)本发明所制备的复合纳米载体对部分核酸类药物的转染效率大于目前广泛使用的分子量为25 kDa的枝化PEI和Lipofectamine2000，且细胞毒性低于后两者。
图I是由分子量为25 kDa的枝化PEI和PLGA制备的包裹pDNA (编码β -半乳糖苷酶)的复合纳米载体的扫描电镜图片。图2是由分子量为I. 8 kDa的枝化PEI和PLGA制备的包裹Bcl_2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体的扫描电镜图片。图3是由分子量为1.8 kDa的枝化PEI和缩醛化α-环糊精制备的包裹TNF-a -siRNA的复合纳米载体的扫描电镜图片。
具体实施例方式本发明以可降解有机材料为主要载体材料来设计能高效负载核酸类药物的复合纳米载体，通过其中引入不同分子量多聚胺一方面提高复合纳米载体对反义核苷酸、siRNA和microRNA等的负载或包裹效率，促进内涵体/溶酶体逃逸；另一方面又不会增加载体系统的细胞毒性或组织损伤作用。不同于以往研究中使用的常规双乳液法，其中不同分子量多聚胺与核酸类药物形成的络合物水溶液作为内水相，本发明设计的方法为将核酸类药物作为内水相，而将不同分子量多聚胺溶于有机相中。以此改良方法制备的复合纳米载体的优点如下1)可以更加有效地提高核酸类药物的负载效率；2)核酸类药物与不同分子量多聚胺缔合形成的纳米复合物能更为均匀的分布于复合纳米载体中，有利于核酸类药物的完全释放和可控释放；3)与纯粹可降解纳米粒相比，复合纳米载体系统的转染效率得到大幅度提高；4)使用少量不同分子量多聚胺即可达到理想的药物负载，且最终转染效率较高；5)使用少量不同分子量多聚胺能保证最终复合纳米载体的安全性。更具体地说，本发明采取的措施如下首先将核酸类药物溶于10-500 μ 水中得到内水相，其中核酸类药物在内水相中的浓度为O. 00001-1000 nmol/μ I ;将可降解有机材料与不同分子量多聚胺溶解于O. 02-100 ml有机溶剂中得到有机相，其中可降解有机材料在有机相中的浓度为O. 5-5000 mg/ml,不同分子量多聚胺与可降解有机材料的质量比为
O.005 100-3 7 ;然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声作用下乳化于O. 1-150 ml聚こ烯醇的质量百分浓度为O. 001-10%的聚こ烯醇水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶齐U，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到本发明所述能高效负载核酸类药物的复合纳米载体。该复合纳米载体为球形，平均数均粒径为80-950 nm (图1_3)。下面结合非限定性的实施例对本发明做详细说明。实施例I首先将I nmol编码β -半乳糖苷酶的pDNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg聚乳酸(PLA，分子量15 kDa)和O. 5 mg分子量800 Da的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于10 ml质量百分浓度为O. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剤，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载PDNA的复合纳米载体，其中PDNA的负载效率为92%。实施例2首先将O. 5 nmol Bcl_2反义寡核苷酸溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg聚丙交酷-こ交酯(PLGA，乳酸/こ醇酸摩尔比50 50,分子量20 kDa)和2. 5 mg分子量I. 8 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于20 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡核苷酸的复合纳米载体，其中寡核苷酸的负载效率为95%。实施例3首先将I nmol Bcl_2反义寡核苷酸溶于150 μ 水中得到内水相；50 mg聚丙交酷-こ交酷(PLGA，乳酸/こ醇酸摩尔比75 :25，分子量25 kDa)和5 mg分子量10 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml氯仿中得到有机相；然后在探头超声下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声作用下乳化于50 ml质量百分浓度为O. 8%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度80%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡核苷酸的复合纳米载体，其中寡核苷酸的负载效率为94%。实施例4首先将O. 2 nmol肿瘤坏死因子(TNF) siRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg聚ε -己内酯(PCL，分子量16 kDa)和2. 5 mg分子量25 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于Imlこ酸こ酯中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于15 ml质量百分浓度为2%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载TNF-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为93%。实施例5首先将I nmol肿瘤坏死因子(TNF)siRNA溶于200 μ 水中得到内水相；50 mg聚原酸酯(分子量32 kDa)和I. 25 mg分子量I. 2 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于100 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载TNF-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为95%。实施例6首先将I nmol肿瘤坏死因子(TNF)siRNA溶于200 μ 水中得到内水相；50 mg聚原酸酯(分子量32 kDa)和I. 25 mg分子量I. 8 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于15 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载TNF-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为95%。实施例7首先将5 nmol化学趋化因子受体2 (CCR-2) siRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醒化α -环糊精和2. 5 mg分子量I. 2 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于30 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载CCR-2-siRNA的复合纳 米载体，其中siRNA的负载效率为93%。体外细胞转染表明最终复合纳米系统的转染效率为枝化聚こ烯亚胺(分子量25 kDa)的I. 3倍，为Lipofectamine 2000的I. 5倍；细胞毒性研究表明复合纳米系统的半抑制浓度(IC50)分别为枝化聚こ烯亚胺(分子量25 kDa)和Lipofectamine 2000 的 100 倍和 10 倍。实施例8首先将I nmol化学趋化因子受体2 (CCR-2) siRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醒化β -环糊精和5 mg分子量10 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于25 ml质量百分浓度为I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剤，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载CCR-2-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为98%。体外细胞转染表明最终复合纳米系统的转染效率为枝化聚こ烯亚胺(分子量25 kDa)的I. 8倍，为Lipofectamine 2000的I. 4倍；细胞毒性研究表明复合纳米系统的半抑制浓度(IC50)分别为枝化聚こ烯亚胺(分子量25 kDa)和Lipofectamine 2000 的 100 倍和 10 倍。实施例9首先将I nmol化学趋化因子受体2 (CCR_2)siRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化Y-环糊精和2. 5 mg精胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于25 ml质量百分浓度为I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载CCR-2-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为80%。实施例10首先将10 nmol Bcl-2反义寡聚核苷酸溶于200 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化α-环糊精聚合物(分子量为8 kDa)和2. 5 mg亚精胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于30 ml质量百分浓度为2%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为82%。实施例11首先将2 nmol Bcl_2反义寡聚核苷酸溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化β-环糊精聚合物(分子量为15 kDa)和10 mg腐胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于25 ml质量百分浓度为I. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为86%。
实施例12首先将O. 5 nmol Bcl-2反义寡聚核苷酸溶于50 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化Y -环糊精聚合物(分子量为9 kDa)和2. 5 mg分子量为I. 8 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于O. 5 ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于15 ml质量百分浓度为O. 5%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为95%。实施例13首先将I nmol Bcl_2反义寡聚核苷酸溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化α -环糊精和2. 5 mg分子量为I. 2 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于20 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为98%。体外细胞转染表明最終复合纳米系统的转染效率为枝化聚こ烯亚胺(分子量25 kDa)的I. 5倍，为Lipofectamine的2倍。实施例14首先将O. 5 nmol抑制化学趋化因子受体2 (CCR-2)的microRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化α -环糊精和10 mg分子量为800 Da的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于20 ml质量百分浓度为I. 2%的聚こ烯醇(分子量8. 8kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剤，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载microRNA的复合纳米载体，其负载效率为97%。实施例15首先将0. 5 nmol抑制肿瘤坏死因子(TNF- α )的shRNA溶于100 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化β -环糊精和I mg分子量为I. 8 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于I ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于25 ml质量百分浓度为O. 8%的聚こ烯醇(分子量25 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载shRNA的复合纳米载体，其负载效率为91%。实施例16首先将O. 01 nmol抑制肿瘤坏死因子(TNF- α )的shRNA溶于20 μ 水中得到内水相；100 mg缩醛化α -环糊精和2. 5 mg分子量为I. 8 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于O. Iml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于I ml质量百分浓度为O. I %的聚こ烯醇(分子量50 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机 相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载shRNA的复合纳米载体，其负载效率为96%。实施例17首先将500 nmol肿瘤坏死因子(TNF_a ) siRNA溶于30 μ 水中得到内水相；50mg聚ε -己内酯(PCL,分子量16 kDa)和14 mg分子量25 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于5 mlこ酸こ酯中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于25 ml质量百分浓度为O. 5%的聚こ烯醇(分子量8. 8kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载TNF-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为89%。实施例18首先将4000 nmol化学趋化因子受体2 (CCR-2) siRNA溶于50 μ 水中得到内水相；50 mg聚乳酸(分子量为50 kDa)和2. 5 mg分子量30 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于10ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于50 ml质量百分浓度为1%的聚こ烯醇(分子量8. 8 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剤，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载CCR-2-siRNA的复合纳米载体，其中siRNA的负载效率为90%。实施例19首先将8000 nmol Bcl-2反义寡聚核苷酸溶于450 μ 水中得到内水相；50 mg聚原酸酯(分子量为25 kDa)和16 mg亚精胺溶解于50 ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于120ml质量百分浓度为2%的聚こ烯醇(分子量60 kDa,水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为87%。实施例20
首先将4500 nmol Bcl-2反义寡聚核苷酸溶于300 μ 水中得到内水相；50 mg缩醛化α-环糊精和2. 5 mg分子量为45 kDa的枝化聚こ烯亚胺溶解于50 ml ニ氯甲烷中得到有机相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声下乳化于150 ml质量百分浓度为7%的聚こ烯醇(分子量80 kDa，水解度88%)水溶液中得到水包油包水复乳；所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到负载Bcl-2反义寡聚核苷酸的复合纳米载体，其中反义寡聚核苷酸的负载效率为94%。本发明所述的核酸类药物是对许多重大疾病发挥治疗作用的一大类活性物质。在上述实施例中，所采用的核酸类药物为编码β -半乳糖苷酶的pDNA、Bcl-2反义寡聚核苷酸、肿瘤坏死因子(TNF) siRNA、化学趋化因子受体2 (CCR-2) siRNA、抑制化学趋化因子受体2 (CCR-2)的microRNA或抑制肿瘤坏死因子(TNF-α )的shRNA。但是这些核酸类药物并不限制本发明的保护范围，本领域普通技术人员可根据所需治疗疾病的不同，选择合适的核酸类药物。例如，所需治疗的疾病是肿瘤，则所述的核酸类药物是对于治疗肿瘤有用的 药物；而如所需治疗的疾病为心血管病，则所述的核酸类药物是对于心血管疾病治疗有用的药物。
权利要求
1.一种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体，其特征在于所述复合纳米载体由可降解有机材料和不同分子量多聚胺组成，其中不同分子量多聚胺与可降解有机材料的质量比为O. 005 :100-3 7 ;所述复合纳米载体为球形，粒径为80-950 nm，核酸类药物均匀分布于其中。
2.根据权利要求I所述的ー种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体，其特征在于所述可降解有机材料选自聚乳酸、聚丙交酯-こ交酷、聚ε -己内酷、聚原酸酷、缩醛化α-环糊精、缩醛化环糊精、缩醛化Y-环糊精、缩醛化α-环糊精聚合物或缩醛化 环糊精聚合物；其中聚合物类可降解有机材料的分子量为I -100 kDa。
3.根据权利要求I所述的ー种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体，其特征在于所述不同分子量多聚胺选自低分子量多聚胺或聚こ烯亚胺；其中聚こ烯亚胺的分子量为O. 6-50 kDa ο
4.根据权利要求3所述的ー种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体，其特征在于所述低分子量多聚胺选自亚精胺、精胺或腐胺。
5.—种权利要求I所述的能高效负载核酸类药物的复合纳米载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤首先将核酸类药物溶于水中得到内水相，将可降解有机材料与不同分子量多聚胺溶解在有机溶剂中得到有机相，将聚こ烯醇的水溶液作为外水相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声作用下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剤，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即得能高效负载核酸类药物的复合纳米载体。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述有机溶剂选自ニ氯甲烷、氯仿或こ酸こ酷。
7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述核酸类药物在内水相中的浓度为 O. 00001 -1000 nmol/μ I。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述可降解有机材料在有机相中的浓度为 O. 5 -5000 mg/ml ο
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述内水相和有机相的体积比为O. 005 1-0. 5:1。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在干所述有机相和外水相的体积比为O.005 1-0. 5:1。
11.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于所述聚こ烯醇在外水相中的质量百分浓度为O. 001-10%，其中聚こ烯醇的分子量为I -100 kDa，摩尔水解度为60-90%。
全文摘要
本发明涉及一种能高效负载核酸类药物的复合纳米载体及其制备方法。该复合纳米载体由可降解有机材料和不同分子量多聚胺组成，其中不同分子量多聚胺与可降解有机材料的质量比为0.005100-37；所述复合纳米载体为球形，粒径为80-950 nm，核酸类药物均匀分布于其中。制备方法为，首先将核酸类药物溶于水中得到内水相，将可降解有机材料与不同分子量多聚胺溶解在有机溶剂中得到有机相，将聚乙烯醇的水溶液作为外水相；然后在探头超声作用下将内水相乳化于有机相中形成油包水初乳，该初乳在探头超声作用下乳化于外水相中得到水包油包水复乳，所得复乳在室温下磁力搅拌以挥发去除有机相的有机溶剂，待纳米微粒固化后，离心分离，用双蒸水洗涤，即可得到能高效负载核酸类药物的复合纳米载体。
文档编号A61K47/34GK102861341SQ20121037657
公开日2013年1月9日 申请日期2012年9月29日 优先权日2012年9月29日
发明者张建祥, 李晓辉, 窦寅, 李淑慧 申请人:张建祥