专利名称：抗wssv和/或tsv的核酸药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种抗WSSV和/或TSV的核酸药物。
背景技术：
对虾养殖大面积发展兴起于七、八十年代，我国沿海从南到北对虾养殖生产量很 大，对沿海经济的发展起到了很大的促进作用。目前，病毒感染是影响对虾养殖的严重威 胁，导致对虾养殖场严重的经济损失。其中，对虾桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus, TSV)病和对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)病是当前严重危害对 虾养殖业健康发展的两种主要对虾病毒性传染病。根据世界银行的虾病报告，1994年对虾 病毒病对全球对虾养殖业造成74%的产量损失，其经济损失达30亿美元以上。1995年，国 际兽疫局(0ΙΕ)、联合国粮农组织(FAO)以及亚太地区水产养殖发展网络中心(NACA)将该 病列为需要报告的水生动物病毒性疫病之一。对虾白斑综合征病毒(WSSV)病，于1992年首次发现于台湾，1993年5 8月在我 国大陆沿海从南到北的养殖场暴发，日本等亚洲国家的对虾养殖场也相继暴发了此病。目 前，在亚洲已报道的该病毒的流行国家和地区包括朝鲜、泰国、韩国、印度尼西亚、越南、马 来西亚、印度、斯里兰卡、孟加拉国、中国大陆沿海及台湾省等。1995年，美国德克萨斯州对 虾养殖场出现白斑综合征病毒，并在西半球的其它地区相继暴发。至此，WSSV在世界范围内 传播开来，每年给对虾养殖业造成几百亿元的经济损失，成为威胁对虾养殖业的主要疾病。随着市场需求的增加和养殖技术的不断提高，我国水产养殖业迅速发展。但国内 外市场对水产品质量的要求越来越高，我国水产品药残超标时有发生，水产品携带病毒、细 菌、寄生虫、生物毒素的几率较高，这就造成了水产品的安全障碍。对虾属于无脊椎动物，主 要是通过非特异性免疫(Non-specific immunity)力来抵抗病原的入侵。对虾非特异性免 疫包括细胞免疫和体液免疫两个方面，虾体内的细胞免疫和体液免疫作用紧密相关，血细 胞可合成并释放体液免疫因子，细胞免疫反应又受到体液免疫因子的介导和影响。目前主 要采用免疫增强剂来促进或诱发宿主(对虾)防御反应，增强对虾机体抗病能力。因而相 对于脊椎动物采用疫苗可以产生好的效果看，开发针对对虾疫病新的治疗和预防措施显得 尤为重要。
发明内容
本发明的目的是提供一种无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死WSSV和/或 TSV，抗病毒效果好，无药残的抗WSSV和/或TSV的核酸药物。本发明所提供的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其活性成分为五种核酸，所述五 种核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中所述五种核酸为任意质量比。本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中所述五种核酸的质量比为 1:1:1:1:1。
本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其中还包括可药用载体或赋形剂。本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀 死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，无药残，能控制对虾的白斑病病毒和桃拉综合症病毒的 感染，避免对虾的大规模死亡，减少对虾养殖的风险，避免使用化学抗病毒及抗菌药物所产 生的药残超标等问题，以此提高对虾产品的质量。
具体实施例方式人工合成如下核酸VP19-1 :5，-UCAGAAUCGCUGUCCUUCUUU-3，；VP19-2 :5’ -⑶CAUCAUCAUCG⑶GACCUU-3’ ；VP19-3 :5， -CCUG⑶CCUGUUCUUAUAUUU-3，；VP28-1 :5’ -CGAUAUU⑶CU⑶⑶GG⑶UU-3’ ；VP28-2 :5’ -A⑶CACAGGAAUGCGGAGGUU-3’ ；VP28-3 :5’ -UUUCCAUUGCGGAUCUUGAUU-3’ ；CPl-I :5，-AUG⑶CGCU⑶GCUAAGUAUU-3，；CP1-2 :5， -AAUAUUUCCACGCCACCAAUU-3，；CP1-3 :5， -CACUACCAUAAGGGAGAUAUU-3，；CP2-1 :5，-UUGAGAACGGAAAUGACGAUU-3，；CP2-2 :5， -CUUUAGCAAGCGUACCUG⑶U-3，；CP2-3 :5， -UCUAAUUUCAGAAUUUCAAUU-3，。实验条件小水箱，温度20 士 2°C ；实验动物日本对虾，每尾10克左右，体长10 12cm ；毒株WSSV，TSV；病毒悬液的制备10g对虾病料在500mL TNE缓冲液中勻浆，4°C、3500g离心5min， 上清液经400目尼龙网过滤后，4°C 30000Xg离心30min，弃上清，沉淀悬于IOmL TM缓冲 液，经3500\8离心5!1^11后，41 30000Xg离心20min，沉淀中的病毒粒子重悬浮于ImL TM 缓冲液，并用PCR进行定量分析，将所制备的病毒悬液用生理盐水调浓度。WSSV感染从日本对虾倒数第二腹节处进行注射；感染不给药组对虾每尾注射白 斑病毒悬液100 μ L ；空白对照组注射等量0. 9%无菌生理盐水；感染给药物组对虾每尾注 射WSSV病毒悬液，拌料给核酸0. 2mg/天/只；注射后每日观察、记录活动情况，发病症状， 死亡情况等，如甲壳内侧有明显白斑、活力迅速下降等；并连续观察10d，每天换水30%，傍 晚时投饵一次。TSV感染TSV感染方法同于WSSV感染方式。WSSV检测具体方法如下(1)煮沸法提取DNA 取患WSSV日本对虾肌肉组织0. Ig分装至1. 5mL离心管，每 管加入ImL pH为7. 4的PBS缓冲液，冰浴勻浆，将勻浆液6000rpm离心5min，取上清50 μ L 加入1 μ L蛋白酶K (10mg/mL)，55 V煮沸15min，然后立即放于冰上5min，以8000rpm离心 lOmin，上清做PCR模板；(2)引物
第一次扩增引物Fl 5' -CGT GCC TGA ATC A GT ATG TAC GC-3'；Rl :5，-GAC GTT ACA ATA GAC CCA TGT TCG AT-3'；第二次扩增引物F2 5' -CTC ATG TAC CAA ATC TGG GTT ACG A-3'；R2 :5， -CGA TAG ACC ACA A GT TCC GTA GGA-3，。(3) PCR检测WSSV的体系及程序(i) PCR 反应体系第一次扩增2.5yL 10XPCR 缓冲液，0. 4μ L dNTP (2. 5mM)，0. 8 μ L 弓| 物 (F1+R1)，0. 3 μ L 的 TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)，2. 0 μ L 模板 DNA,最后加 19 μ L 的 ddH20 ；第二次扩增2.5yL10XPCR 缓冲液，0. 4μ L dNTP (2. 5mM), 0. 8 μ 引物(F2+R2)， 0. 3 μ LTaq DNA聚合酶(5U/ μ L)，2. 0 μ L第一次扩增的产物，最后加19 μ L的ddH20。(ii) PCR 扩增条件:95V 2min ；35 个循环:95°C，30s ；55°C，30s，72°C，lmin。最后 72°C IOmin 后在 10°C保存。(4) PCR完成后，进行1 %琼脂糖凝胶电泳。第一次扩增产物DNA片段长约为328bp，第二次扩增产物DNA片段长约为258bp。TSV检测具体方法如下扩增体系(20 μ L) :Real-time PCR Premix 10 μ L, 25mmol/L MgCl2 0. 25 μ L, 2. 5mmol/LdNTP 0. 5 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0· 125 μ L, Tsv-F, Tsv-R 和 Tsv-T 浓度都 分别为0. 6,0. 4和0. 6 μ mol/L，体积均为2 μ L，其余用水补足。反应程序为95°C预变性20s ；然后按95°C变性10s、60°C退火延伸30s进行40个 循环，最后于40°C结束反应。最后采用软件进行数据分析。Tsv-F 5' -GCTTGCGTGGTGGGACTAAAT-3‘；Tsv-R 5' -CCTCCACTGGTTGTTGTATCAAAA-3‘；Tsv-T 5' -HEX-AATGCCTGCTAACCCAGTCGAAATT-ECLIPSE-3'。核酸在对虾上的抗WSSV活性分析结果如表1所示；核酸在对虾上的抗TSV活性分析结果如表2所示。表1.核酸在对虾上的抗WSSV活性分析
5 表2.核酉髮在对虾上的抗TSV活性分析
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从表1和表2的结果中确定VP19-l、VP19-2、VP28-2、CPl--1、CP1-3、CP2-2、CP2_:
抗WSSV活性和抗TSV活性较高。将VP19-1、VP28-2、CP1-1、CP2-3 和 CP2-3 按照质量比为 1 1 1 1 1混
合制成核酸药物。核酸药物稳定性分析流通蒸汽高温105°C，20分钟灭菌不影响其生物活性；50°C 恒温箱内存放2个月不影响其生物活性；室温下存放24个月不影响其生物活性；-20°C存 放48个月不影响其生物活性。日本对虾每尾10克左右，体长10 12cm，随机分成14组，每组100只，每组分别 肌肉注射 VP19-1、VP19-2、VP19-3、VP28-1、VP28-2、VP28-3、CPl-U CP1-2、CP1-3、CP2-1、 CP2-2、CP2-3、核酸药物、0. 9%无菌生理盐水注射后每天观察对虾的活动情况及是否出现 死亡等，结果如表3。
表3.对虾的毒性分析结果 ( 二)临床试验病毒滤液的制作分别取WSSV和TSV感染病虾的鳃、上皮、肌肉、步足和头部软组 织，加入缓冲液PBS (PH7. 14)勻浆，8000g离心IOmin去沉淀，上清液用0. 45 μ m滤膜过滤， 得到可供感染的WSSV和TSV病毒滤液。投喂感染用上述获得的WSSV和TSV病毒滤液分别注射感染健康对虾，采集因此 感染而濒临死亡的虾，_20°C保存，作为投喂感染模式的病虾；感染时取该样品的鳃部、上 皮、肌肉、步足和头部，剪细制成肉糜，用青霉素和链霉素处理0. 5h，攻毒组幼虾饥饿空胃 24h后投喂病虾肌肉肉糜一次，6h以后，清除残余物；然后继续投喂各相应饵料，同时设立 阴性对照。投药途径按照每千克饲料加入200毫克核酸药物混入虾饲料中，通过饲喂给药。症状观察感染后，每日观察对虾的活动情况，病死情况，10天后随机抽取部分对 虾进行病毒检测。WSSV和TSV的检测方法同上。数据统计分析结果如表4和表5。
表4.对WSSV病毒的抗性分析结果 表 5.
以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进 行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通工程技术人员对本发明的技术方 案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
8序号处理方式PCR检出率存活率1核酸药物3%98%2阳性对照组97%51%2阴性对照组099%
表 5.
对TSV病毒的抗性分析结果序号处理方式PCR检出率存活率1核酸药物4%97%2阳性对照组91%57%2阴性对照组095%
权利要求
抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其活性成分为五种核酸，所述五种核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。
2.根据权利要求1所述的核酸药物，其特征在于所述五种核酸为任意质量比。
3.根据权利要求1或2所述的核酸药物，其特征在于所述五种核酸的质量比为 1:1:1:1:1。
4.根据权利要求3所述的核酸药物，其特征在于还包括可药用载体或赋形剂。
全文摘要
本发明公开了一种抗WSSV和/或TSV的核酸药物，其活性成分为五种核酸，所述五种核酸的核苷酸序列分别为序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4和序列5。本发明的抗WSSV和/或TSV的核酸药物无毒副作用，无耐药性，能特异性直接杀死WSSV和/或TSV，抗病毒效果好，无药残。
文档编号A61P31/14GK101919873SQ20101022866
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月16日 优先权日2010年7月16日
发明者韩健宝 申请人:韩健宝