专利名称：抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种反义核酸，尤其涉及针对慢性粒细胞白血病融合基因bcr3/abl2和血管内皮生长因子VEGF的反义核酸药物组合物及其在制备治疗白血病药物中的应用。
背景技术：
慢性粒细胞白血病(CML)是造血系统克隆性疾病，其特征性的Ph染色体和由此而形成的bcr/abl融合基因及其编码的蛋白质是CML的发病基础。现已证实在CML中，bcr/abl基因的表达可抑制CML细胞的凋亡，这是造成患者白血病克隆性增生的主要原因。VEGF作为一种主要的促血管形成因子，它与特异性受体结合，在体外能够诱导血管内皮细胞的增殖和迁移，在体内能够促进血管新生。VEGF在实体瘤的发生、发展及转移过程其重要作用，最新研究发现恶性血液病细胞亦高表达VEGF蛋白，并不同程度表达VEGF受体，即VEGF和受体共表达现象，提示有VEGF自分泌机制存在。VEGF以自分泌方式作用与白血病细胞表面VEGF受体，促进白血病细胞增殖，维持白血病细胞存活，并且阻止放射线和化疗药物诱导的凋亡，增强白血病细胞的耐药性。VEGF及受体已成为血液恶性肿瘤治疗的理想靶点。最近文献报道，CML患者体内表达过量表达VEGF，骨髓微血管密度增加，且VEGF水平还可能影响疾病的预后。值得注意的是，肿瘤的发生发展是多因素作用的结果，涉及到多个基因，不同发展阶段的癌基因和抑癌基因的数目和种类各不相同，所以肿瘤的单基因治疗往往不能达到理想的目的。因此在治疗中选择两个或两个以上的目的基因进行有效联合，理论上应该具有更佳的效果。
以bcg3/abl2和VEGF为靶点药物中，最有应用前景的可能是反义核酸药物，因为它可以直接、特异性地封闭某种基因的表达，并且少有毒副作用，价格适宜，与化疗药物联合应用，可能会降低耐药性，减少毒副作用，提高缓解率，改善预后，甚至达到根治效果。
已有研究报道18-26个核苷酸的反义寡核苷酸能降低bcr/ablmRNA水平和P210蛋白表达，在体外抑制CML细胞和细胞系的生长，恢复细胞对凋亡刺激的敏感性(ClarkRE.Leukemia，2000，14347-355)。在实体肿瘤治疗中，国内外不同实验小组应用VEGF反义寡核苷酸能够抑制血管新生，延缓肿瘤生长。何睿等利用反义VEGF片段转染K562细胞，观察到细胞生长受抑，裸鼠肿瘤生长缓慢，凋亡增加(Rui He，Bin Liu，Chen Yang，et al.CancerGene Therapy，2003，10879-886)。Tomasz Skorski报道了磷酸化的bcr/abl和C-myc反义寡核苷酸单独和联合应用在体内对SCID鼠白血病进展的作用，结果显示，联合治疗的白血病鼠疾病进展延迟，生存期明显延长，表明针对多癌基因治疗的可行性(SkoskiT，Skorska MN，Campbeii K，et al.J ExpMed，1995，1821645-1653)。
尽管在癌症的分子研究包括癌基因和抑癌基因的研究方面取得了巨大的成就，但目前癌症的治疗主要以手术治疗、放疗和化疗为基础，辅以某些生物治疗。传统的化疗药物以转录抑制或DNA损伤为作用机制，缺乏特异性，对人体正常细胞也有严重的毒性作用。核酸化学和生物化学领域的发展及对肿瘤发生的认识进一步加深，使设计出以寡核苷酸为基础的治疗药物成为现实。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，以bcr/abl融合基因和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为靶点，采用bcr3/abl2和VEGF基因反义寡核苷酸(AS-ODNs)联合作用于K562细胞系和K562移植瘤，提供CML联合药物治疗和基因治疗的新用途，能增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物的用量，提高其临床疗效。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是设计出具有药用价值的bcr/abl融合基因以及VEGFmRNA反义核酸序列，分别为bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO-B3/A2)互补于bcr3/abl2型融合点两侧各9个核苷酸，序列为5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’。VEGF反义寡核苷酸(ASO-VEGF)互补于VEGF mRNA第3个外显子，序列为5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’。
上述两条反义核酸链经全硫代修饰，联合应用于制备治疗慢性粒细胞白血病的药物，可有效抑制白血病细胞生长，增加细胞对凋亡刺激的敏感性，延缓裸鼠移植瘤的生长。
所述两种反义核酸的配比浓度分别为50～125nmol/L。
所述治疗白血病的药物中，两种反义核酸序列的最佳配比浓度分别为100nmol/L。
选择K562细胞做研究对象，通过小鼠体内、体外一系列实验证明上述两条反义核酸序列联合应用对白血病细胞的抑制作用优于任何一条核酸单独应用。
本发明的有益效果是利用针对不同作用机制的两种反义寡核苷酸联合应用或联合化疗药物治疗癌症，不仅可以提高疗效，同时还可以降低两者单独使用时的副作用。反义核酸联合化疗至少有以下3个优点(1)防止肿瘤耐药细胞耐药性的形成；(2)与化疗药物联合，可增加抗癌疗效，并且能降低药物剂量和毒性；(3)特异性强，特异性地攻击靶细胞，对正常细胞几乎无影响。
图1a为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞的bcr3/abl2和VEGF基因mRNA水平表达的抑制作用。
图1b为bcr3/abl2 mRNA表达水平半定量分析。
图1c为VEGF mRNA表达水平半定量分析。
图2为在无血清条件下，bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞增殖的影响。
图3为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞对凋亡刺激的敏感性。
图4为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用在不同治疗阶段K562细胞裸鼠移植瘤体积的变化。
图5各实验组移植瘤组织切片H&E染色和TUNEL原位凋亡检测。其中，A对照组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；BASO-B3/A2组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；CASO-VEGF组移植瘤的病理形态，光镜HE×100；D联合治疗组移植瘤的病理形态，光镜HE×100。a-d各实验组移植瘤凋亡细胞形态(TUNEL原位凋亡检测)。
图6为图5中a-d各实验组移植瘤组织切片免疫组化CD31染色，光镜×200。
具体实施例方式
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步详细说明一、ASO的设计和合成①硫代修饰的bcr3/abl2反义寡核苷酸(ASO-b/a)互补于bcr3/abl2型融合点两侧各9个核苷酸(Skorski T，Szczylick C，Malaguamera L，et al.Folia Histochem Cytobiol，1991，2985～89)，序列为5’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’。
②全硫代修饰的VEGF反义寡核苷酸(ASO-V)互补于VEGF mRNA第3个外显子(Li XM，Tang ZY，Zhou G，et al.J Exp Clin Cancer Res，1998，171～3)，序列为5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’。
③无关反义寡核苷酸(N-ODN)序列为5’-CATTTCTTGCTCTCCACG-3’，经微机检索与包括bcr/abl及VEGF基因在内的人类基因无同源性。
二、细胞培养及转染K562细胞株是来源于CML急性红白血病变的细胞株，细胞接种于含10％小牛血清的RPMI1640(Gibco/BRL公司产品)培养液，置于37℃、5％CO2培养箱中常规培养。取对数生长期细胞进行台盼蓝染色计数，观察细胞存活率(＞98％)。用Oligofectamine转染试剂(Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA)。按试剂盒操作说明优化转染条件，分别将ASO-b/a(200nmol/L)，ASO-V(200nmol/L)，ASO-b/a(100nmol/L)+ASO-V(100nmol/L)，N-ODN(200nmol/L)加入K562细胞培养液，孵育24-48h后收集细胞进行检测。
三、RT-PCR用TRIzol试剂盒(Gibco/BRL公司产品)按说明提取总RNA，电泳鉴定抽提RNA质量，紫外光分光光度计定量。取2.5μg总RNA，用随机引物(Gibco/BRL公司产品)及Super ScriptTMII逆转录试剂盒(Invitrogen)按试剂盒说明逆转录成cDNA。PCR反应体系为50μL(cDNA 2μL，引物浓度400nmol/L，Taq酶1u)。bcr3/abl2引物序列为5’CTCCAGACTGTCCACAGCATTCCG3’，5’CAGACCCTGAGGCTCAAAGTCAGA3’，扩增产物为164bp。VEGF引物序列为5’ATGAACTTTCTGCTGTCTTGG3’，5’TCACCGCCTCGGCTTGTCAC3’，扩增产物为577bp和446bp。内参照引物GAPDH序列为5’ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCAGC3’，5’TGGTATCGTGGAAGGACTCATGAC3’，扩增产物为305bp。β2-MG序列为5’CCCCCACTGAAAAAGATGAG3’，5’TCATCCAATCCAAATGCGGC3’，扩增产物为133bp。反应条件94℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，共进行35个循环，最后72℃延伸10min。取10μL PCR产物进行15g/L琼脂糖凝胶电泳，紫外照相并进行扫描分析，以bcr-abl/GAPDH、VEGF165/β2-mG进行bcr/abl、VEGF基因表达水平半定量分析。
四、细胞增殖和细胞活力检测1、细胞计数转染后72h进行台盼蓝染色计数，并以下式计算生长抑制率。
N为处理后细胞计数，N0为未处理的细胞计数。
2、MTT法实验各组均按每孔3.0×104细胞数接种96孔板，每组设3个复孔。转染后24h，漂洗细胞，继续含/去血清培养24h。然后每孔加入MTT(5mg/ml)20μL，37℃培养4h，离心弃去培养液，每孔加入100μL二甲基亚砜(DMSO)，振荡10min，酶标仪测定570nm处吸光度(A570)值，根据A值计算细胞抑制率。
3、流式细胞术测定细胞凋亡转染后24h，漂洗细胞1次，继续含血清、去血清及加入5μM Etoposide(Sigma，Dublin，Ireland)培养24h。离心收集细胞，PBS洗涤2次，按Annexin-V-Fluos试剂盒(Roche MolecularBiochemicals，Germany)说明进行标记。应用1×106细胞仅加PI或仅加Annexin V的结果调节补偿。根据FCM散点图，计算凋亡细胞所占百分比。
4、裸鼠K562细胞移植瘤模型建立雌性6-8周龄BALB/C nu/nu裸鼠，由中国医学科学院动物所提供，在严格无菌条件下饲养，1周后进行试验。指数生长期的K562细胞制成单细胞悬液，细胞浓度为7.5×107/ml，每只裸鼠接种0.2ml于右侧背部皮下，以皮下结节体积超过500mm3为成瘤标准。
5、抑制肿瘤生长实验裸鼠20只随机分成4组，每组5只。①.ASO-b/a治疗组，瘤内注射100μL 1.0μM ASO-b/a，每3天1次，共4次。②.ASO-V治疗组，同法注射100μL 1.0μM ASO-V。③.联合治疗组，同法注射0.5μM ASO-b/a和0.5μM ASO-V 100μL。④.对照组，同法注射等容积的无血清培养液。每3天测量肿瘤最长径(W1)和最短径(W2)，根据公式V＝π/6(W1×W2×W2)计算肿瘤体积。实验重复3次。
5、肿瘤组织学检测4次治疗后处死裸鼠，取出肿瘤，固定于10％福尔马林液中过夜，石蜡包埋，液氮冻存，制作石蜡组织切片。H&E染色光镜观察组织形态学改变。免疫组织化学ABC法检测内皮细胞CD31表达情况，应用抗鼠的CD31单克隆抗体(Zymed，San Francisco，CA)标记，×200倍，计数5个随机视野内的微血管数，取平均值。应用TUNEL原位凋亡试剂盒(Roche Molecular Biochemicals，Germany)检测肿瘤组织凋亡情况。
五、实验结果1、反义寡核苷酸对K562细胞生长的影响如表1所示，为bcr3/abl2和VEGF反义寡核苷酸单独或联合应用对K562细胞增殖的影响。实验分为空白对照组(Control)，阴性对照组(N-ODN)和处理组；处理组又分为ASO-b/a组、ASO-V组及ASO-b/a+V(半量联合)组，每组设3个复孔，实验重复3次，取均值。转染后24h，台盼蓝染色计数活细胞。ASO-b/a和ASO-V均能抑制K562细胞的生长，联合应用时其抑制作用明显增强；N-ODN对K562细胞生长无抑制作用，证明ASO-b/a、ASO-V对K562细胞的作用具有特异性表1
顺放(PP)、逆放(D)、冲洗(P)、三次压力均衡升(E3R)、二次压力均衡升(E2R)、一次压力均衡升(E1R)、最终升压(FR)。吸附占6个步位，顺放(PP)占3个步位，冲洗(P)占3个步位。其余吸附塔也经历同样的过程，只是时间上相互错开。
该工艺吸附(A)总时间为180秒，冲洗(P)时间为90秒，处理40℃，2.5MPa压力下的原料气最多只能实现3次均压，因此产品氢气的收率较低，最高收率为85％。
国外在80中期推出了改进型的10-3-3工艺，主要改进点将顺放(PP)时间缩短为2个步位，将冲洗(P)时间延长为4个步位。改进后的10-3-3工艺时序表见表2。
表2改进后的10-3-3工艺时序表
由于没有增加容器设备，该工艺某一塔的顺放(PP)气体同时用于两台待再生吸附塔的冲洗(P)，例如T0101吸附塔的第一步位顺放气(PP)同时用于T0108及T0109吸附塔的冲洗(P)；T0101吸附塔的第二步位顺放气(PP)同时用于T0109及T01010吸附塔的冲洗(P)。为了保证待冲洗的2台吸附塔的冲洗气流均匀，顺放及冲洗回路必须采用可调节性程控阀，总共10台。由于每台可调节性程控阀的调节性能随着安装位置及运行时间的变化而出现差异，导致进入两塔的冲洗气流量不均匀，甚至严重偏流，致使再生效果恶化。
该工艺吸附(A)总时间为180秒，冲洗(P)时间为120秒，处理2.5MPa压力下的中变气最多只能实现3次均压，因此产品氢气的收率仍然不高，(PASO-B3/A2＝0.0297，PASO-V＝0.0469，PASO-B3/A2+V＝0.0040，vs control；PASO-B3/A2+V＝0.0328 vs ASO-B3/A2 group；PASO-B3/A2+V＝0.0319 vs ASO-VEGFgroup)。与对照组相比，各治疗组肿瘤生长抑制率分别为23.18％(ASO-B3/A2组)，17.28％(ASO-VEGF组)和57.83％(联合治疗组)。
6.不同反义核酸治疗组肿瘤组织的病理观察如图5所示，H&E染色镜下观察，对照组瘤细胞体积大，胞浆丰富，核浆比例大，核仁明显。凋亡细胞以核固缩和胞浆空泡为特点，应用TUNEL方法可以检测凋亡细胞。在ASO-B3/A2和ASO-VEGF组可以见到凋亡细胞增加和肿瘤细胞生长并存。联合治疗组可以见到较多的细胞坏死区域，肿瘤结构消失。
7.不同反义核酸治疗组肿瘤微血管计数如图6所示，通过肿瘤组织切片免疫组化CD31染色后，光学显微镜下直接观察(×200)，计数褐色的肿瘤微血管数。结果显示，对照组26.72±5.04/视野，ASO-B3/A2组14.68±1.69/视野，ASO-VEGF组16.12±3.15/视野，联合治疗组6.37±0.57/视野(P＜0.01)。
综上所述，体外实验表明，ASO-B3/A2和ASO-VEGF能够抑制K562细胞生长、增殖，实验中观察到半量联合组对K562细胞的生长抑制作用比单独应用一种AS-ODNs时强，呈现协同效应。同时，从抑制肿瘤细胞增殖的角度，从抑制肿瘤细胞生长和肿瘤血管生成两个方面，ASO-B3/A2和ASO-VEGF对裸鼠K562移植瘤的治疗效果与单一治疗组相比，联合治疗组能很显著延缓肿瘤的发展，抑制肿瘤的生长，肿瘤细胞凋亡增加和肿瘤血管密度减少更明显。ASO-B3/A2和ASO-VEGF在体内抗肿瘤治疗中同样具有一定的协同作用。BCR-ABL和VEGF反义寡核苷酸联合应用抑制裸鼠K562移植瘤，证实联合治疗具有显著的抑制肿瘤的效果。
权利要求
1.一种抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于含有序列ASO-bcr3/abl25’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’和ASO-VEGF5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’的反义核酸。
2.根据权利要求1所述的抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于所述序列ASO-bcr3/abl25’-GAAGGGCTTTTGAACTCT-3’和ASO-VEGF5’-GCAGTAGCTGCGCTGATAGTGC-3’经全硫代修饰。
3.根据权利要求2所述的抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于所述两种反义核酸的配比浓度分别为50～125nmol/L。
4.根据权利要求3所述的抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物，其特征在于所述两种反义核酸的最佳配比浓度分别为100nmol/L。
5.一种抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的联合应用。
6.根据权利要求5所述的抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的联合应用，其特征在于所述两种反义核酸可与化疗药物联合运用。
全文摘要
本发明公开了一种抑制bcr3/abl2和VEGF基因功能的反义核酸药物组合物及其应用，以bcr/abl融合基因和血管内皮细胞生长因子(VEGF)为靶点，采用bcr3/abl2和VEGF基因反义寡核苷酸(AS－ODNs)联合作用于K562细胞系和K562移植瘤，提供在制备治疗慢性粒细胞白血病药物中的联合药物治疗和基因治疗的新用途，能增加白血病细胞对化疗药物的敏感性，减少化疗药物的用量，提高其临床疗效。
文档编号A61P35/00GK1679964SQ200510013168
公开日2005年10月12日 申请日期2005年2月1日 优先权日2005年2月1日
发明者韩忠朝, 丛秀丽 申请人:中国医学科学院血液学研究所泰达生命科学技术研究中心