抑制靶基因表达的组合物的制作方法
【专利说明】
[0001] 本申请是中国专利申请号为200980130771.X(PCT申请号为PCT/JP2009/063685， PCT公开号为WO2010/013815)、申请日为2009年7月31日、发明名称为"抑制靶基因表达 的组合物"的中国发明专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及用于抑制靶基因表达的组合物等。
【背景技术】
[0003] 作为抑制革El基因表达的方法，已知例如利用RNA干涉（RNAinterference，以下 称为RNAi)的方法等，具体而言，有报道指出通过在线虫中导入具有与靶基因相同的序列 的双链RNA，可特异性地抑制该靶基因表达的现象[参见"自然（Nature) "，1998年，第391 卷、第6669号，p. 806-811]。另外，发现通过在果蝇中导入21~23碱基长度的双链RNA代 替长双链RNA，可以抑制靶基因的表达，将其命名为短干扰RNA(shortinterferingRNA) (siRNA)(参见国际公开第01/75164号说明书）。
[0004] 哺乳动物细胞中导入长双链RNA时，由于病毒防御机制引起细胞程序死亡，不能 抑制特定的基因表达，但发现只要为20~29碱基的siRNA，则不会引起上述反应，可以抑 制特定基因的表达。其中21~25个碱基的siRNA的表达抑制效果高["自然（Nature) "， 2001 年，第 411 卷，第 6836 号，p. 494-498，"遗传学自然评论（NatureReviewsGenetics) "， 2002 年，第 3 卷，第 10 号，p. 737-747，"分子细胞（MolecularCell)"，（美国），2002 年，第 10 卷，第 3 号，p.f549_56l，" 自然生物技术（NatureBiotechnology) "，（美国），2002 年，第 20卷，第5号，p. 497-500]。另外，已有报道指出，不仅是双链RNA，具有通过分子内杂交形 成的发夹（hairpin)结构的单链RNA也与siRNA相同地显示为RNAi[参见"美国国家科学 院院刊（ProceedingsoftheNationalAcademyofSciencesoftheUnitedStatesof America) "，2002 年，第 99 卷，第 9 号，p. 6047-6052] 〇
[0005] 关于RNAi，在体内试验中也经常得到验证，已经报道了对胎儿动物使用50个碱基 对以下的siRNA的效果（参见专利文献1)及对成体小鼠的效果（参见专利文献2)。另外， 静脉内给与小鼠胎鼠siRNA时，可确认在肾脏、脾脏、肺、胰脏及肝脏各脏器内具有抑制特 定基因表达的效果（参见非专利文献1)。并且，还报道了在脑细胞中直接给与siRNA，也能 抑制特定基因的表达（参见非专利文献2)。
[0006] 另一方面，作为向细胞内输送核酸的方法，已知有使用阳离子脂质体或阳离子聚 合物的方法。但是，该方法中，静脉内给与含有核酸的阳离子脂质体或阳离子聚合物后，核 酸被迅速地从血中除去，靶组织为肝脏或肺以外的组织时，例如为肿瘤部位等时，不能将核 酸输送到靶组织，不能够充分地发挥作用。因此，已有报道指出一种包封核酸的脂质体（在 脂质体内包封了核酸的脂质体）可以解决核酸在血中被迅速地除去的问题（参见专利文献 3~6及非专利文献3)。作为包封核酸等的脂质体的制备方法，专利文献3中报道了如下方 法，即，例如将阳离子性脂质预先溶解在氯仿中，然后加入寡脱氧核苷酸（ODN)的水溶液和 甲醇，混合后，通过离心分离使阳离子性脂质/ODN的复合体移至氯仿层中，再取出氯仿层， 向其中加入聚乙二醇化磷脂、中性的脂质和水，形成油包水型（W/0)乳剂，采用逆相蒸发法 处理，制备ODN内包脂质体，专利文献4及非专利文献3中报道了如下方法，S卩，将ODN溶解 于PH3. 8的柠檬酸水溶液中，加入脂质（乙醇中），使乙醇浓度降低至20v/v%，制备ODN内 包脂质体，进行定型过滤，通过透析除去过量的乙醇后，再在PH7. 5下透析试样，除去附着 在脂质体表面的0DN，制备ODN内包脂质体。上述方法均可制备包封核酸等有效成分的脂质 体。
[0007] 相对于此，在专利文献5及6中报道了通过在液体中用脂双层膜（lipidbilayer membrane)被覆微粒的方法，制备包封了核酸等有效成分的脂质体。在该方法中，通过减少 含有分散有微粒且溶解了脂质的极性有机溶剂的水溶液中的极性有机溶剂的浓度，可以在 液体中用脂双层膜被覆微粒。该方法中，能够以优异的效率制备例如适于静脉注射用微粒 等的大小的用脂双层膜被覆的微粒（被覆微粒）。另外，专利文献5及6中，作为被覆微粒 的例子，例如举出了由ODN或SiRNA与阳离子性脂质构成的通过静电相互作用形成的复合 体。有报道指出被覆该粒子得到的被覆微粒的粒径较小，可以用作注射剂，静脉内给与该被 覆微粒时，显示较高的血中滞留性，较多地集聚在肿瘤组织。
[0008] 专利文献1:美国公开第2002-132788号
[0009] 专利文献2:国际公开第03/10180号说明书
[0010] 专利文献3:日本特表2002-508765号公报
[0011] 专利文献4:日本特表2002-501511号公报
[0012] 专利文献5:国际公开第02/28367号说明书
[0013] 专利文献6:国际公开第2006/080118号说明书
[0014] 非专利文献1: "自然?遗传学（NatureGenetics) "，2002年，第32卷，第1号， p. 107 - 108
[0015] 非专利文献2: "自然生物技术（NatureBiotechnology) "，2002年，第20卷，第 10 号，P. 1006 - 1010
[0016] 非专利文献3: "生物化学与生物物理学报（BiochimicaetBiophysicaActa) "， 2001 年，第 1510 卷，p. 152 - 166
【发明内容】
[0017] 本发明的目的在于提供用于抑制靶基因表达的组合物等。
[0018] 本发明涉及以下（1)~（54)项发明。
[0019] (1) -种组合物，含有包封了RNA的脂质体，所述RNA含有靶基因mRNA的连续15~ 30个碱基的序列（以下记为序列X)及与该序列X互补的碱基的序列（以下记为互补序列 X'），与序列X及互补序列X'的碱基键合的糖的总计1~90%为在2'位上被修饰基团取 代的核糖，所述脂质体是可到达包含靶基因表达部位的组织或脏器的脂质体。
[0020] (2)如上述（1)所述的组合物，其中，所述脂质体是具有可静脉内给药的大小的脂 质体。
[0021] (3)如上述（1)或⑵所述的组合物，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉（RNAi) 抑制该靶基因表达的作用的RNA。
[0022] (4)如上述⑴~⑶中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与肿瘤或炎症 相关的基因。
[0023] (5)如上述（1)~（4)中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是与血管新生 (angiogenesis)相关的基因。
[0024] (6)如上述⑴~⑷中任一项所述的组合物，其中，所述靶基因是血管内皮生长 因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍 生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样 因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一种的基因。
[0025] (7)如上述⑴~（6)中任一项所述的组合物，其中，所述mRNA为人或小鼠的 mRNAo
[0026] (8)如⑴~（7)中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体含 有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，所述复合粒子的构成成分为前导粒子（lead particle)和该RNA，
[0027] 该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该复合粒 子可以分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。
[0028] (9)如⑶所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为醇。
[0029] (10)如⑶所述的组合物，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。
[0030] (11)如⑶~（10)中任一项所述的组合物，其中，所述前导粒子是含有阳离子性 物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物 或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0031] (12)如⑴~（7)中任一项所述的组合物，其中，所述包封了RNA的脂质体是含有 复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜的脂质体，所述复合粒子以含有阳离子性物质的前 导粒子和该RNA为构成成分，
[0032] 其中，该脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0033] (13)如（11)或（12)所述的组合物，其中，所述阳离子性物质为选自N- [1 - (2， 3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化铵、N- [1 一（2,3-二油酰丙基）]一N，N- 二甲基胺、N- [1 - (2, 3 -二油基氧基丙基）]-N，N，N-二甲基氣化钱、N- [1 - (2， 3-双十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羟乙基溴化铵及3f3 -[N-（N'，N' 一 二甲基氨基乙基）氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。
[0034] (14)如（11)~（13)中任一项所述的组合物，其中，所述水溶性物质的脂质衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0035] (15)如（11)~（14)中任一项所述的组合物，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。
[0036] (16) -种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有脂质体，所述脂质体含有复 合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，
[0037] 所述复合粒子以前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的 靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（以下记为序列X1)及与该序列互补的碱基的 序列（以下记为互补序列X/)，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~90% 为在2'位上被修饰基团取代的核糖，
[0038] 其中，该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该 复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。
[0039] (17)如（16)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为醇。
[0040] (18)如（16)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。
[0041] (19)如（16)~（18)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述前导粒 子为含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生 物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0042] (20) -种癌症或炎症疾病的治疗剂，所述治疗剂含有复合粒子及被覆该复合粒子 的脂双层膜，所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含 有与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与该序列 互补的碱基的序列（互补序列X/ )，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~ 90%为在2'位上被修饰基团取代的核糖，
[0043] 其中，该脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0044] (21)如（19)或（20)所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述阳离子性物质为 选自N- [1 一（2,3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化铵、N- [1 一（2,3 -二油酰 丙基）]-N，N-二甲基胺、N- [1 - (2,3-二油基氧基丙基）]-N，N，N-三甲基氯化 铵、N- [1 一（2,3-双十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羟乙基溴化铵及3P- [N-（N'，N' 一二甲基氨基乙基）氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。
[0045] (22)如（19)~（21)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述水溶性 物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0046] (23)如（19)~（22)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述中性脂 质为卵黄卵磷脂。
[0047] (24)如（16)~（23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述RNA是 具有利用RNA干涉（RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。
[0048] (25)如（16)~（23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，与肿瘤或炎 症相关的靶基因是与血管新生相关的基因。
[0049] (26)如（16)~（23)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述与肿瘤 或炎症相关的靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、 纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因 子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的任一 种的基因。
[0050] (27)如（16)~（26)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗剂，其中，所述mRNA 是人或小鼠的mRNA。
[0051] (28)-种癌症或炎症疾病的治疗方法，所述治疗方法将含有脂质体的组合物给与 哺乳动物，所述脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜：
[0052] 所述复合粒子以前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的 靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与该序列互补的碱基的序列（互 补序列X/ )，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~90%为在2'位上被修 饰基团取代的核糖，
[0053] 其中，该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该 复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。
[0054] (29)如（28)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述极性有机溶剂为醇。
[0055] (30)如（28)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述极性有机溶剂为乙 醇。
[0056] (31)如（28)~（30)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述前导 粒子是含有阳离子性物质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍 生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0057] (32)-种癌症或炎症疾病的治疗方法，所述治疗方法将组合物给与哺乳动物，所 述组合物含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，
[0058] 所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有 与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与该序列互补 的碱基的序列（互补序列X/)，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~90% 为在2'位上被修饰基团取代的核糖，
[0059] 其中，该脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0060] (33)如（31)或（32)所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述阳离子性物 质为选自N- [1 一（2,3 -二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化铵、N- [1 一（2,3 - 二油酰丙基）]一N，N-二甲基胺、N- [1 一（2,3-二油基氧基丙基）]一N，N，N-三甲 基氯化铵、N- [1 一（2, 3 -双十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-轻乙基溴化铵及 30 -[N-（N'，N' 一二甲基氨基乙基）氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。
[0061] (34)如（31)~（33)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中所述水溶 性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0062] (35)如（31)~（34)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述中性 脂质为卵黄卵磷脂。
[0063] (36)如（28)~（35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述RNA 是具有利用RNA干涉（RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。
[0064] (37)如（28)~（35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，与肿瘤或 炎症相关的靶基因是与血管新生相关的基因。
[0065] (38)如（28)~（35)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，所述与肿 瘤或炎症相关的靶基因是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因 子、纤维芽细胞生长因子受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生 长因子、肝细胞生长因子受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中的 任一种的基因。
[0066] (39)如（28)~（38)中任一项所述的癌症或炎症疾病的治疗方法，其中，mRNA是 人或小鼠的mRNA。
[0067] (40)-种组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗剂中的应用，所述组合物含有脂质 体，所述脂质体含有复合粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，
[0068] 所述复合粒子以前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有与肿瘤或炎症相关的 靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与该序列互补的碱基的序列（互 补序列X/ )，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~90%为在2'位上被修 饰基团取代的核糖，
[0069] 其中，该脂双层膜的构成成分可溶于极性有机溶剂，该脂双层膜的构成成分及该 复合粒子能够分散在以特定浓度含有该极性有机溶剂的液体中。
[0070] (41)如（40)所述的应用，其中，所述极性有机溶剂为醇。
[0071] (42)如（40)所述的应用，其中，所述极性有机溶剂为乙醇。
[0072] (43)如（40)~（42)中任一项所述的应用，其中，所述前导粒子是含有阳离子性物 质的前导粒子，所述脂双层膜是以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或 脂肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0073] (44) -种组合物在制备癌症或炎症疾病的治疗剂中的应用，所述组合物含有复合 粒子及被覆该复合粒子的脂双层膜，
[0074] 所述复合粒子以含有阳离子性物质的前导粒子和RNA为构成成分，所述RNA含有 与肿瘤或炎症相关的靶基因mRNA的连续15~30个碱基的序列（序列X1)及与该序列互补 的碱基的序列（互补序列X/)，与序列X1及互补序列X/的碱基键合的糖的总计1~90% 为在2'位上被修饰基团取代的核糖，
[0075] 其中，该脂双层膜为以中性脂质及水溶性物质的脂质衍生物、脂肪酸衍生物或脂 肪烃衍生物为构成成分的脂双层膜。
[0076] (45)如（43)或（44)所述的应用，其中，所述阳离子性物质为选自N-[1 一（2， 3-二油酰丙基）]一N，N，N-三甲基氯化铵、N- [1 一（2,3 -二油酰丙基）]一N，N-二 甲基胺、N- [1 一（2, 3 -二油基氧基丙基）]一N，N，N-二甲基氣化钱、N- [1 一（2, 3 - 双十四烷氧基丙基）]一N，N-二甲基一N-羟乙基溴化铵及30 -[N-（N'，N' 一二甲 基氨基乙基）氨基甲酰基]胆固醇中的一种以上。
[0077] (46)如（43)~（45)中任一项所述的应用，其中，所述水溶性物质的脂质衍生物、 脂肪酸衍生物或脂肪烃衍生物为聚乙二醇一磷脂酰乙醇胺。
[0078] (47)如（43)~（46)中任一项所述的应用，其中，所述中性脂质为卵黄卵磷脂。
[0079] (48)如（40)~（47)中任一项所述的应用，其中，所述RNA是具有利用RNA干涉 (RNAi)抑制该靶基因表达的作用的RNA。
[0080] (49)如（40)~（47)中任一项所述的应用，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因 是与血管新生相关的基因。
[0081] (50)如（40)~（47)中任一项所述的应用，其中，所述与肿瘤或炎症相关的靶基因 是血管内皮生长因子、血管内皮生长因子受体、纤维芽细胞生长因子、纤维芽细胞生长因子 受体、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子受体、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子 受体、Kruppel样因子、Ets转录因子、核因子及低氧诱导因子中任一种的基因。
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