一种牛抑制素α亚基成熟肽基因及重组表达蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，具体地说，设及一种牛抑制素a亚基成熟肤基 因，牛祀T32a(+)-ma化巧tide重组载体和祀T32a(+)-ma化巧tide-E.COliBL2UDE3)工程 菌的构建、重组蛋白质的诱导表达方法和纯化方法、W及制备多克隆抗体和免疫性检测的 方法。
【背景技术】
[0002] 超数排卵是胚胎移植的关键技术之一，目前常用的超排药物主要是FSH，但由于超 排是一项复杂的生理过程，加之F甜生产厂家批号不同W及动物个体的差异，致使生产中 FSH超排效果不稳定。同时，由于FSH在体内半衰期较短，需要频繁注射给药。与FSH法超 排相比，采用抑制素免疫进行超排处理不仅提高排卵率，而且提供了更多的可移植胚胎， 同时避免了激素残留问题。
[0003] 抑制素是一种糖蛋白类激素，主要来源于动物性腺中，自20世纪80年代W来，先 后在许多动物的卵泡液和精液中发现抑制素的存在，并分离成功。目前认为其主要生理功 能是在下丘脑一垂体一性腺轴中起重要的调控作用，反馈性的抑制垂体FSH的释放，调控 动物的生殖活动。近年来，人们利用各种来源的抑制素或人工合成的抑制素片段为免疫原 主动或被动免疫雌性动物，均发现不同程度的提高排卵数和产仔数。抑制素的生理作用是 可W抑制体内FSH合成和分泌，并可通过复杂的反馈调节机制从而调节机体体液水平，从 而对卵巢上卵泡发育起到调控作用。因此，对动物体进行免疫抑制素可W在体内产生抗抑 审懷抗体，从而中和内源性抑制素，使FSH的合成和分泌不受抑制，从而增加血液中FSH的 含量，而且抑制素免疫可W直接阻止排卵前FSH的降解，相对上升了FSH水平，提高排卵数。 现有技术中，重组抑制素试验均诱导出包涵体蛋白，包涵体蛋白在后续试验操作中需要对 蛋白进行复性处理，且复性后的蛋白无天然活性，运大大增加了试验难度与成本。
【发明内容】
[0004] 本发明从牛卵巢中提取牛抑制素成熟肤基因序列，进行载体构建，通过优化诱导 表达抑制素重组可溶性蛋白的最适宜表达条件，使得可溶性蛋白表达量大。此外，本发明克 服了现有技术中其他重组抑制素均诱导出包涵体蛋白的缺陷，使得诱导出的可溶性蛋白在 蛋白纯化时不需复性处理，且蛋白构象具有天然活性，运大大降低了技术难度与成本，更有 利于产业化。本发明制备的牛抑制素重组a亚基重组蛋白质具有较好的反应原性。本发 明制备的牛抑制素重组a亚基抗体具有较高的免疫原性。
[0005] 本发明的一个目的是提供一种从牛卵巢中提取的牛抑制素a亚基成熟肤基因， 其多核巧酸序列是SEQIDNO:1。并且提供了该基因编码的牛抑制素a亚基成熟肤重组 蛋白质，其氨基酸序列是SEQIDNO:2。
[0006] 本发明的再一个目的是提供一种含有牛抑制素a亚基成熟肤基因的表达载体、 构建该基因表达载体的方法W及利用该表达载体转化的重组基因工程菌。
[0007] 本发明的第=个目的是提供牛抑制素a亚基成熟肤重组表达蛋白质的高效诱导 表达方法、纯化该重组蛋白质的方法。
[0008] 本发明的第四目的是提供牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白在兔体内制备多克隆 抗体、确定最佳免疫剂量及免疫次数的方法。
[0009] 本发明上述发明目的是通过下面的技术方案实现的：
[0010] 一方面，本发明从牛卵巢中提取出牛抑制素a亚基成熟肤基因，其多核巧酸序列 是SEQIDNO:1。提供了该基因编码的牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白质，其氨基酸序列 是沈QIDNO:2。
[0011] 另一方面，本发明构建了含有牛抑制素a亚基成熟肤基因的表达载体，其包含由 SEQIDNO:1的405个核巧酸组成的牛抑制素成熟肤基因matP巧tide和祀T32a(+)载体， 该牛Inhibin成熟肤基因matP巧tide位于祀T32a(+)载体的BamHI和化oil限制性内 切酶酶切位点之间。
[0012] 第=方面，本发明提供了一种含有上述牛抑制素成熟肤基因表达载体的构建方 法，包括W下步骤：
[001引（1)根据Bostaurusinhibin,alpha(INHA)基因序列用Primer5. 0 软件设计InhibinmatP巧tide编码基因引物，引物序列如下：
[0014]上游引物：Pl:5,-cgggatcccgctccacgcccccactg-3，（沈QIDNO:3)
[0015]下游引物：P2 :5，-ccgctcgagaatcccttagatgcaagcaca-3，（沈QIDNO:4)
[0016] 似提取牛卵巢卵泡周边组织RNA并反转录成cDNA，W此为模板。利用引物Pl和 P2进行PCR扩增。
[0017] (3)将步骤（2)扩增得到的RT-PCR产物连接到PMD19-T载体，转化到感受态细胞 宿主菌进行克隆，用菌落PCR方法筛选阳性菌落，用质粒PCR方法筛选阳性重组质粒，测序 结果正确的阳性重组质粒命名为InhibinpMD19-T-matP巧tide质粒；
[001引 （4)用限制性内切酶BamHI和)(holI分别对InhibinpMD19-T-matP巧tide质 粒和祀T32a(+)质粒进行双酶切，分别回收Inhibinma化巧tide片段和祀T32a(+)线状载 体；
[001引 巧）将Inhibinma化巧tide片段连接到祀T32a(+)线状载体，转化到感受 态宿主菌，用质粒PCR、质粒双酶切筛选阳性重组质粒，得到重组表达载体Inhibin pET32a(+)-matpeptide。
[0020] 在本发明优选的实施方案中，所述感受态宿主菌是原核生物，优选是E.coliBL21 感雙态宿主菌。
[0021] 在本发明优选的实施方案中，上述含有牛抑制素a亚基成熟肤基因表达载 体构建方法的步骤似中包括反转录成CDNA与PCR扩增2个反应。反转录体系为， Oligod灯）40yLDEPC水 420yLRRI20yL5XBufferfOOyLdNTPSOyLM-MLV40yL。 [002引更优选地，上述PCR扩增体系如下，建立25 反应体系：模板2.Oyl,Es Mixl2y1，上下游引物各lul，d地209y1。反应条件为：94°C预变性2min，94°C变性30s， 60°C退火30s，72°C延伸30s，25个循环；最后72°C延伸2min，4°C保持lOmin。扩增产物与 SXLoadingBuffer按5 :1的比例混合，于1%琼脂糖凝胶中进行电泳（电泳条件：电压 150V，电泳时间20min)，电泳结束后在凝胶成像仪上检测目的条带并拍照观察。
[0023] 在本发明优选的实施方案中，上述含有牛抑制素a亚基成熟肤基因表达载体构 建方法的步骤（3)中将扩增得到的RT-PCR产物连接到PMD19-T载体，转化到E.COliD册a 感受态细胞宿主菌进行克隆。
[0024]更优选地，上述连接反应体系为cDNA加1，T4DNA连接酶0.加1，PMD19T载体 0. 5yl，PMD19TSolutionl5yll6°C连接过夜。阳性菌落PCR鉴定方法为将连接产物转化 D册a感受态细胞，涂布于含有AMP的LB平板培养基，待平板表面干后倒置，于37°C过夜培 养至白色菌落出现。用黄色枪头挑取白色菌落接种于新的LB固体平板上做划线培养，培养 6个小时后做菌落PCR。挑取跑出菌落PCR条带的菌落接种于含Amp(lOOmg/ml)LB液体培 养基中37°C，190rpm过夜培养，至菌体出现浑浊。本发明在克隆过程中创新了菌落PCR鉴 定运一方法，应用此方法可显著提高试验效率，缩短试验时间，有利于阳性菌落的筛选。
[0025] 在本发明优选的实施方案中，上述步骤（4)中所述双酶切的10y1体系为：取重组 质粒3y1，BamHI与XholI各1y1，肥BBuffers. 15y1，37摄氏度酶切过夜。
[0026] 在本发明优选的实施方案中，上述步骤巧）中所述将InhibinmatP巧tide片段 连接到祀T32a(+)线状载体后转化到E.COli化21宿主菌的IOyL连接体系为：目的片 段matp巧tidecDNA6yL，pET32a(+)线状载体2yL，10XT4BufferlyL，TクNA连接酶 lyL。反应条件为：16°C连接过夜。
[0027]更具体地，上述含有牛抑制素成熟肤表达载体构建方法的步骤（3)、步骤巧）中所 述转化的方法包括如下步骤：
[0028] (1)将使用的E.COli畑5a感受态细胞放在冰浴中化后，取连接产物于之前已预 冷的1.5血灭菌离屯、管中，加入50yLE.COliD册a感受态细胞，轻轻混匀，置冰浴30min。
[0029] 似在精确42°C下热休克90s，迅速取出并置冰浴2min，随后加入950yL已平衡 至室溫的LB液体培养基，37°C15化pm振荡培养Ih。
[0030] (3)将振荡培养过后的菌液W3000巧m离屯、5min，弃去大部分的上清液，留200yL 上清液悬浮细胞沉淀，涂布于LB平板培养基，待平板表面干后倒置，于37°C过夜培养至白 色菌落出现。
[0031] 上述构建含有牛抑制素a亚基成熟肤基因表达载体构建方法的步骤（3)、步骤 (5)中所述重组质粒鉴定方法中的质粒PCR25yL反应体系为：EsMix12. 5 ^^上下游引 物各1.OyL模板DNAL5yL灭菌双蒸水9.OyL。扩增条件为，94°C预变性2min，94°C变 性30s，60°C退火30s，72°C延伸30s，25个循环；最后72°C延伸2min，4°C保持lOmin。
[0032] 第四方面，本发明提供了牛抑制素a亚基成熟肤重组表达蛋白质即牛Inhibin pET32a(+)-matpeptide重组蛋白质的制备方法。重组表达载体InhibinpET32a(+)-mat P巧tide经转化到宿主菌、IPTG诱导表达、目的蛋白质的纯化与鉴定后得到牛抑制素a亚 基成熟肤重组表达蛋白质牛InhibinpET32a(+)-matP巧tide重组蛋白质。所述牛抑制素 曰亚基成熟肤重组表达蛋白质牛InhibinpET32a(+)-matP巧tide重组蛋白质的制备方法 包括W下步骤：
[0033] 1)重组表达载体InhibinpET32a(+)-ma1:peptide转化到宿主菌；
[0034] 2)进行IPTG诱导表达；
[0035] 3)牛抑制素a亚基成熟肤重组表达蛋白质的纯化。
[0036] 在牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白质的纯化之前进行重组蛋白的可溶性分析， 在牛抑制素a亚基成熟肤重组蛋白质的纯化之后进行重组蛋白浓缩与蛋白浓度的测定。 对重组蛋白进行western鉴定。
[0037] 在本发明的优选实施方案中，上述步骤1)重组载体转化到宿主菌包括：将重组 载体祀T32a(+)-matP巧tide转化到E.coliBL21 (DE3)宿主菌中得到牛祀T32a(+)-mat P巧tide-E.COIiBL21 〇)E3)工程菌，转化方法同构建含有牛抑制素表达载体方法的步 骤巧）中所述转化方法相同，所用宿主菌为E.coliBL2UDE3)感受态细胞；转化得到牛 pET32a(+)-matP巧tide-E.coliBL2UDE3)工程菌经质粒PCR、北京诺赛科技有限公司测序 得到鉴定正确的祀T32a(+)-matP巧tide-E.coliBL21(DE3)基因工程菌。