高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种农杆菌介导的病毒诱导基因沉默技术用于高效快速抑制狗牙根 内源基因表达的方法，属于基因工程和生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 狗牙根(切nodon dactylon化.）Pers.)是禾本科虎尾草亚科狗牙根属植物，是一 种重要的暖季型草坪草、牧草及水上保持植物，具有耐旱、耐盐、耐践踏、病虫害少、生长快、 草层厚等诸多优点，广泛用于暖溫带、亚热带及热带的运动场草坪、公园和道路绿化带、河 道和山坡等护坡草坪和放牧草地建设，在草坪和牧草生产中具有十分重要的地位。
[0003] 对狗牙根抗逆、发育相关重要基因的功能进行深入研究能够为基因工程育种和分 子辅助育种提供重要的候选基因和理论依据。然而目前所建立的农杆菌浸染和基因枪轰击 介导的狗牙根遗传转化方法均步骤繁琐且效率低下，严重阻碍了在狗牙根植物体内进行相 关基因功能的验证。病毒诱导的基因沉默技术利用病毒感染植物后植物对病毒RNA序列进 行特异性识别和降解的机制，将目标基因序列融入病毒序列中，使感染重组病毒的植物体 内目标基因 mRNA也被识别和降解，是一种高效抑制基因表达的技术方法。目前已有多个病 毒诱导基因沉默载体得到构建，成功用于烟草、番茄、棉花、拟南芥、水稻、二穗短柄草等植 物的基因沉默实验。然而截至目前，仍未有狗牙根病毒诱导基因沉默技术的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种高效快速抑制狗牙根内源基因表达的方法，通过如下 技术方案实现。
[0005] (1)狗牙根目的基因片段的克隆。
[0006] 在已知狗牙根目的基因序列情况下，设计PCR扩增目的基因片段的上下游引物，设 计原则保证PCR扩增产物长度大于lOObp，同时在上下游引物5'端分别添加限制性内切酶 Mlu巧日化cl的识别碱基序列ACGCGT和TTAATTAA。提取狗牙根RNA，逆转录成cDNA，使用高保 真酶PCR扩增获得目的基因片段。电泳、切胶回收预期大小的PCR产物，连接平末端PCR产物 克隆载体，转化大肠杆菌D册α，涂布抗性平板，挑取克隆，用载体自带引物PCR鉴定获得阳性 克隆后，测序确认PCR产物的正确性。
[0007] 在狗牙根目的基因序列未知情况下，可W根据目的基因在其它物种的同源基因序 列设计简并引物先从狗牙根cDNA中PCR扩增获得部分基因序列，测序确认序列正确性后遵 照上述方法获得目的基因片段。
[000引（2)病毒诱导基因沉默载体的构建。
[0009]提取上述测序验证的含有狗牙根目的基因片段的PCR产物克隆载体质粒和水稻东 格鲁杆状病毒基因沉默载体pRTBV-MVIGS质粒，使用Mlul和化cl两个限制性内切酶于37°C 酶切8小时；电泳、切胶回收目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切片段，使用T4 DNA连接酶将摩 尔比为3:1的目的基因和pRTBV-MVIGS载体酶切回收片段进行连接，连接条件为16°C8小时； 将连接产物转化大肠杆菌D册α，涂布卡那霉素抗性平板，挑取克隆，使用载体酶切位点两侧 序列设计的引物RTBV-F(序列：GGATCCGGGCCCTTAATTA)和RTBV-R(序列： AGGCTGGAGGCATAAACGC)进行菌落PCR，对克隆进行鉴定。
[0010] (3)农杆菌浸染狗牙根植株。
[0011] 将连接狗牙根目的基因片段的PRTBV-MVIGS质粒转化农杆菌EHA105,涂布卡那霉 素和利福平双重抗性平板，挑取克隆，使用RTBV-F和RTBV-R引物进行菌落PCR检测。将PCR鉴 定阳性克隆按1:100比例扩大培养于含卡那霉素和利福平的LB培养基，28°C培养过夜至 OD60Q约为3。将培养液倒入离屯、管，4000 g、4°C离屯、10分钟收集菌体。用浸染缓冲液（10 mM 吗口林乙横酸，10 mM氯化儀，5 mM氯化巧，300 mM乙酷下香酬，pH 5.6)重悬菌体，使0〇6日日达到 1.5,倒入烧杯中，室溫静置3小时。将光照16小时/黑暗8小时、28°C条件下培养7天的狗牙根 幼苗从化agland培养基中取出，用清水洗去培养基，转移至含有农杆菌浸染液的烧杯中，用 滤网盖住狗牙根幼苗使其浸没于液面下。将烧杯放入连有真空累的真空室中，抽真空5分钟 后，将幼苗取出，用清水洗去粘附的浸染液，重新转移至化agland培养基中，于光照16小时/ 黑暗8小时、28°C条件继续培养21天。将含农杆菌的浸染废液用高溫蒸汽灭菌后再予W丢 弃。
[0012] (4)基因表达丰度的分子检测。
[0013] 将未浸染的培养28天的狗牙根植株W及浸染后继续培养21天的狗牙根植株从 化agland培养基中取出，剪下其叶片，提取其RNA，逆转录成cDNA。设计检测目的基因表达的 PCR引物，避开第（1)步中PCR扩增目的基因区段，使用实时定量PCR获得目的基因在对照植 株和浸染病变植株的Ct值。同时使用狗牙根内参基因肌动蛋白（actin)的检测引物对内参 基因 actin在对照植株和浸染病变植株的表达量进行分析，获得响应的Ct值，用2 算法 计算获得目的基因在对照植株和浸染病变植株中相比actin基因的相对表达量。
[0014] 本发明的技术优势及有益效果在于。
[0015] (1)相比花费昂贵的基因枪轰击法W及耗时长且步骤繁琐的农杆菌介导的愈伤组 织转化方法，本发明所提供的方法能够在4周内高效的将狗牙根内源基因的表达进行沉默， 通过观察基因沉默植株相比对照植株的表型，可W快速地分析表达被沉默基因的功能。
[0016] (2)相比已知的农杆菌介导的病毒诱导基因沉默方法，本发明所提供的方法使用 真空累辅助农杆菌浸染狗牙根叶片，相比注射器直接注射叶片提高了农杆菌浸染效率。在 浸染液配方中，本发明提供的方法新加入了5 mM的氯化巧，也极大的提高了浸染效率。
[0017] (3)与狗牙根cDNA文库相结合，使用本发明所提供的方法可W快速高通量地筛选 与抗逆性和生长发育相关的未知狗牙根基因，为分子标记辅助育种和基因工程育种提供大 量的候选基因。
【附图说明】
[0018] 图1为狗牙根两个品种八氨番茄红素脱氨酶基因表达被抑制的表型照片。
[0019] 图2为狗牙根两个品种八氨番茄红素脱氨酶基因表达被抑制的定量PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0020] 下述实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方 法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生 化试剂商店购买得到。实施例中的定量实验，均设置Ξ次重复实验，结果取平均值。
[0021]实施例1狗牙根八氨番茄红素脱氨酶基因沉默导致植株叶片白化。
[00。]国审狗牙根品种'阳江'狗牙根和美国进日品种' common '狗牙根:江苏省中国科学 院植物研究所草业研究中屯、。pRTBV-MVIGS质粒：印度德里大学南方校区植物分子生物学系 (参考文南犬：Purkayastha A, Mathur S, Verma V, Sharma S, Das 邑 upta I. Virus- induced gene silencing in rice using a vector derived from a DNA virus. Planta, 2010，232: 1531-1540)。大肠杆菌D册a和农杆菌EHA105:江苏省中国科学院植物 研究所草业研究中屯、。
[0023] 一、狗牙根八氨番茄红素脱氨酶基因 （phytoene desaturase,PDS)的克隆。
[0024] 使用天根生化科技(北京）有限公司的RNAprep植物总RNA提取试剂盒提取'阳江' 狗牙根叶片的总RNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。使用宝生物(大连)有限公司的逆 转录试剂盒将狗牙根总RNA逆转录为cDNA，操作步骤按试剂盒自带说明书进行。
[0025] 根据NCBI已登录的植物PDS基因的核巧酸序列设计扩增狗牙根PDS基因的简并引 物PDS-F-290/PDS-R-980，如表1所示，PCR扩增获得狗牙根PDS基因中间区段。电泳，切胶回 收PCR产物，连接全式金(北京)生物技术有限公司的祀ASY-Blunt Simple载体，得到连接产 物，转入大肠杆菌D册α中，抗性筛选挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克 隆质粒进行测序。
[0026] 表1.引物列表
采用RACE PCR的方法获取狗牙根全长PDS基因序列，具体步骤如下： 1、 根据测序获得的狗牙根PDS基因的中间区段核巧酸序列设计扩增狗牙根PDS基因全 长的巢式P(：R引物5 ' -PDS-1/5 ' -PDS-2和3 ' -PDS-1/3 ' -PDS-2 W及接头引物曰(1曰口1〇'- oligodT、adapto;r-l 和 adapto;r-2，如表 1 所示； 2、 3'RACE使用接头引物adaptor-oligodT进行拟转录，使用宝生物（大连)有限公司的 逆转录试剂盒按试剂盒自带说明书进行。5'RACE先使用基因特异性引物5'-PDS-l进行逆转 录，反应条件同上，接下来加入化L 10Xbuffer，lyL dATP和lyL末端脱氧核巧酸转移酶 [宝生物(大连