专利名称：人类组织因子途径抑制因子突变基因mTFPI、包括该基因的重组载体及其宿主细胞的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体地说涉及组织因子途径抑制因子突变基因、含有该基因的重组载体，及用该载体转化的宿主细胞。
背景技术：
人类组织因子途径抑制因子(Tissue Factor Pathway Inhibitor，TFPI)是组织因子途径的重要抑制因子，作为TF:FVIIa复合物的生理抑制剂对凝血过程有重要的影响作用。TFPI能抑制血栓形成及血管平滑肌细胞增殖等，因此，对血管再狭窄、动脉粥样硬化和心肌梗塞等的发生与发展有减缓作用。此外，动物实验证明，人类TFPI重组蛋白(hrTFPI)对血栓形成、感染性休克、血管再狭窄、内毒素血症和DIC(弥散性血管内凝血)等有防治作用。因此，TFPI有巨大的药用价值，在临床上有广泛的应用前景。
人类TFPI血浆浓度低(54-124ng/ml)，直接从血浆中纯化困难，无法大量获取。为获得足量TFPI用于功能研究及临床应用，国内外已有许多公司和实验室应用基因工程的方法制备TFPI重组蛋白(rTFPI)。然而，TFPI结构复杂，在许多表达体系中都未能实现高产量的表达。利用酿酒酵母表达体系表达TFPI产量很低，约20ug/L。利用哺乳动物细胞表达体系所获得的重组蛋白，产量约2～6mg/L，生物活性较好，但成本太高，不利于工业化生产。
毕赤酵母表达系统是近年来倍受重视的新型嗜甲醇酵母表达体系，它表达外源蛋白产量高，操作简单，利于大规模发酵培养，与酿酒酵母相比，它对外源蛋白的修饰作用更近似于哺乳动物细胞。在毕赤酵母表达体系中，外源基因的表达量主要受转录水平的调控。外源基因的某些序列可能会导致转录提前终止，如TTTTTATA、ATTATTTTATAAA(Pichia Expression Kit)。人类TFPI-cDNA第337-346位碱基序列为TATTTTTATA，使TFPI重组蛋白在毕赤酵母中表达量低下。因此，突变该序列成为提高TFPI重组蛋白在毕赤酵母中产量的前提，对大规模发酵培养获得大量TFPI重组蛋白具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是为提高TFPI重组蛋白的产量，提供一种人类组织因子途径抑制因子突变基因mTFPI。
本发明的第二个目的是提供一种包括有TFPI突变基因mTFPI的重组载体。
本发明的第三个目的是提供一种含有TFPI突变基因mTFPI的转化宿主细胞。
本发明的技术方案概述如下一种TFPI突变基因mTFPI，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列。
一种包括TFPI突变基因mTFPI的重组载体，将序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列用XhoI和EcoRI处理后与pPic9载体(美国Invitrogen公司)，加入T4连接酶，进行连接反应，制成mTFPI-pPic9。
一种含有TFPI突变基因mTFPI的转化宿主细胞，它是将mTFPI-pPic9导入到宿主毕赤酵母菌GS115，成为GS115/mTFPI-pPic9。
本发明中的TFPI突变基因mTFPI特点在于在其他已经报道的TFPI多核苷酸序列的基础上进行了部分核苷酸序列的改变；但他们编码的氨基酸序列相同，即均为野生型的TFPI。
实验证明，与野生型TFPI基因在毕赤酵母中表达的重组蛋白量相比，本发明的TFPI突变基因mTFPI在毕赤酵母中所表达的重组蛋白量有较大提高(见图5mTFPI重组蛋白与TFPI重组蛋白的表达量比较)，从而可以大大降低大规模发酵培养获得该重组蛋白的生产成本。
图1删除野生型TFPI-cDNA分泌信号序列策略图；图2mTFPI-cDNA构建策略图；图3一种含有mTFPI-cDNA重组(克隆)载体及含该重组载体的宿主细胞的构建策略图；图4mTFPI重组蛋白的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱；图5mTFPI重组蛋白与TFPI重组蛋白的表达量比较。
具体实施例方式
制备本发明的一种TFPI突变基因mTFPI、重组载体及其宿主细胞的方法包括如下步骤1.通过PCR扩增将天然TFPI-cDNA序列中含有一段78个碱基的分泌信号肽序列删除，经限制性内切酶部分水解，得到DNA片段，连接到pPic9载体(美国Invitrogen公司)上并转化到大肠杆菌TB1中。提取TFPI-pPic9质粒DNA，用PCR法对TFPI的部分DNA序列进行突变。纯化PCR产物后，用限制性内切酶处理后，连接到pPic9载体上并转化到大肠杆菌TB1，形成的重组质粒为mTFPI-pPic9。
2.提取mTFPI-pPic9质粒DNA，用限制性内切酶将其线性化后，转化到酵母感受态细胞GS115(美国Invitrogen公司)中，获得重组酵母菌GS115/mTFPI-pPic9。
在可使TFPI突变基因mTFPI表达的条件下培养该重组菌，用底物发色法测定TFPI蛋白的活性；并经SDS-PAGE分析，证明TFPI蛋白大量表达。
TFPI突变基因mTFPI核苷酸序列SEQ ID No.1。TFPI突变基因mTFPI全长828bp，和其他野生型的TFPI基因比较，其第337-346位核苷酸序列发生了突变。
根据核苷酸序列SEQ ID No.1，推测表达的TFPI蛋白的氨基酸序列见SEQ ID No.2。该TFPI的氨基酸序列由276个氨基酸组成，分子量为42KDa。通过对本发明涉及的TFPI突变基因mTFPI推导的氨基酸序列与其他野生型TFPI蛋白氨基酸序列进行比对分析，结果表明无任何差别(参见Thomas JG，Roger E，Robin LW，et al.1991.Structure of the humanlipoprotein-associated coagulation inhibitor gene.The Journal of Biological Chemistry.226(8)5036-5041.)下面通过实施例对本发明进行进一步详细说明。应该理解的是，所述的实施例仅仅是用于说明而不是限制本发明。
实施例1构建含TFPI突变基因mTFPI的载体以质粒DNA TFPI-pFastBac(中国医学科学院中国协和医科大学生物医学工程所基因工程实验室构建)为模板，XhoI(gtc agt ctc gag aaa aga gat tct gag gaa gat gaag；含有XhoI酶切位点)，EcoI(gct ata acg aat tca cat att ttt aac；含EcoRI酶切位点)为正反引物进行PCR扩增(见图1删除野生型TFPI分泌信号序列策略图)。经琼脂糖凝胶电泳，用DNA凝胶回收试剂盒(北京鼎国生物技术发展中心)纯化PCR产物。用限制性内切酶XhoI和EcoRI处理PCR产物及pPic9载体，经琼脂糖凝胶电泳，用上述试剂盒回收后，取200ng pPIC9回收产物，与200ng回收的PCR产物，在20μL连接体系中于16℃过夜进行连接反应(连接体系含2ul10x连接缓冲液，1ulT4DNA连接酶)。取连接产物转化E.coli(大肠杆菌)TB1，涂布在LB培养基平板上。提取TFPI-pPic9质粒DNA挑取一单菌落接种于10ml LB培养基中37℃250rpm过夜培养；离心收集菌体，用1ml TE缓冲液(Tris-HCl 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH8.0)重悬，再次离心收集菌体，用GTE缓冲液重悬后加入15ul浓度为10mg/ml的溶菌酶，混匀后30℃水浴30min；然后加入300ul裂解液(0.2N NaOH/1％SDS，新鲜制备)，轻柔地颠倒混匀后静置5min；加入225ul 5M的乙酸钾溶液(3M乙酸钾，2M乙酸，pH 5.5)，混匀后冰浴10min；13000rpm离心15min，取上清，加入2ul 10mg/ml的RNaseA(核糖核酸酶A)溶液，混匀后37℃水浴20min；等体积的酚-氯仿混合液(酚∶氯仿＝24∶1)抽提一次；加入等体积的PEG(聚乙二醇)溶液(13％PEG 8000，0.8M NaCl)混匀，4℃静置30min，13000rpm离心20min，弃上清。沉淀用冰冷的70％的乙醇漂洗两遍，溶于适当体积的TE缓冲液中。用OE-PCR定点突变法，以质粒DNA TFPI-pPic9为模板，以5’Aox(GCA AAT GGC ATT CTGACA TCC)和突变引物m2(tgt ctg att gtt gta gaa gta cct ggt aat ata ac)；3’Aox(GAC TGG TTC CAA TTG ACA AGC)及突变引物m1(tat att acc agg tac ttc tacaac aat cag aca aaa c)为引物，进行两次PCR扩增(见图2删除分泌信号序列的野生型TFPI基因定点突变策略图)。用上述方法纯化PCR产物(mTFPI)，酶切PCR产物并连接到pPic9载体上，并用上述方法转化mTFPI-pPic9到大肠杆菌TB1。
实施例2构建及鉴定重组酵母菌GS115，(酵母菌GS115，美国Invitrogen公司)取50ug提取的质粒DNA(mTFPI-pPic9)用50u Sac1酶切1小时。将质粒用无水乙醇沉淀后，溶于20ul无菌水中。用PEG1000法制备酵母感受态细胞。将50ug DNA直接加入尚处于冷冻状态的感受态细胞中，于37℃水浴5分钟，然后加入1.2mlPEG溶液(40％PEG 1000，0.2M Bicine，pH 8.35)，30℃水浴1h。离心，用1.5ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mM Bicine，pH 8.35)重悬菌体。再次离心，用0.2ml NaCl溶液(0.15M NaCl，10mMBicine，pH 8.35)重悬菌体后涂布于RDB选择平板上，30℃孵育4-6日。从RDB选择平板上挑取克隆接种于10ml YPD培养基中，30℃、250rpm培养18-24小时。用玻璃珠裂解法提取酵母基因组DNA。取5ul酵母基因组DNA作为摸板，以5`Aox和3`Aox.作为正，反引物进行PCR扩增。琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，并根据扩增片段的大小来判断mTFPI-pPIC9质粒是否插入酵母宿主菌基因组中。筛选mTFPI-pPic9质粒已插入的重组酵母菌GS115(图3一种含有mTFPI-cDNA重组(克隆)载体及含该重组载体的宿主细胞的构建策略图)。
实施例3TFPI重组蛋白的诱导表达将阳性克隆接种到10ml YPD培养基中，30℃250rpm培养18h；取100ul菌液接种于10ml BMGY培养基中，30℃250rpm培养至OD600≈3(约16-18h)；离心收集细胞，重悬于30ml BMMY培养基中。加100％的甲醇至终浓度为0.5％，30℃250rpm培养36h，并每隔12h补加甲醇至终浓度为0.5％。并取上清进行生物活性分析及SDS-PAGE电泳(见图4SDS-PAGE分析mTFPI重组蛋白的表达，图中lane1为mTFPI-pPic9-GS115培养上清；lane2为TFPI-pPic9-GS115培养上清；lane3为pPic9-GS115培养上清；lane 4为蛋白分子量标准)。
证明mTFPI重组蛋白在毕赤酵母中的表达量较TFPI重组蛋白的有较大提高(见图5不同TFPI在毕赤酵母菌中的表达)。
SEQ ID No.1gattctgagg aagatgaaga acacacaatt atcacagata cggagttgcc accactgaaa 60cttatgcatt cattttgtgc attcaaggcg gatgatggcc catgtaaagc aatcatgaaa 120agatttttct tcaatatttt cactcgacag tgcgaagaat ttatatatgg gggatgtgaa 180ggaaatcaga atcgatttga aagtctggaa gagtgcaaaa aaatgtgtac aagagataat 240
gcaaacagga ttataaagac aacattgcaa caagaaaagc cagatttctg ctttttggaa 300gaagatcctg gaatatgtcg aggttatatt accaggtact tctacaacaa tcagacaaaa 360cagtgtgaac gtttcaagta tggtggatgc ctgggcaata tgaacaattt tgagacactg 420gaagaatgca agaacatttg tgaagatggt ccgaatggtt tccaggtgga taattatgga 480acccagctca atgctgtgaa taactccctg actccgcaat caaccaaggt tcccagcctt 540tttgaatttc acggtccctc atggtgtctc actccagcag acagaggatt gtgtcgtgcc 600aatgagaaca gattctacta caattcagtc attgggaaat gccgcccatt taagtacagt 660ggatgtgggg gaaatgaaaa caattttact tccaaacaag aatgtctgag ggcatgtaaa 720aaaggtttca tccaaagaat atcaaaagga ggcctaatta aaaccaaaag aaaaagaaag 780aagcagagag tgaaaatagc atatgaagaa atttttgtta aaaatatg 828SEQ ID No.2AspSerGluGluAspGluGluHisThrIleIleThrAspThrGluLeuProProLeuLys15 10 15 20LeuMetHisSerPheCysAlaPheLysAlaAspAspGlyProCysLysAlaIleMetLys25 30 35 40ArgPhePhePheAsnIlePheThrArgGlnCysGluGluPheIleTyrGlyGlyCysGlu45 50 55 60GlyAsnGlnAsnArgPheGluSerLeuGluGluCysLysLysMetCysThrArgAspAsn65 7075 80AlaAsnArgIleIleLysThrThrLeuGlnGlnGluLysProAspPheCysPheLeuGlu85 90 95 100GluAspProGlyIleCysArgGlyTyrIleThrArgTyrPheTyrAsnAsnGlnThrLys105110115120GlnCysGluArgPheLysTyrGlyGlyCysLeuGlyAsnMetAsnAsnPheGluThrLeu125130135140GluGluCysLysAsnIleCysGluAspGlyProAsnGlyPheGlnVlaAspAsnTyrGly145150 155 160ThrGlnLeuAsnAlaVlaAsnAsnSerLeuThrProGlnSerThrLysVlaProSerLeu165170175180PheGluPheHisGlyProSerTrpCysLeuThrProAlaAspArgGlyLeuCysArgAla185190195200AsnGluAsnArgPheTyrTyrAsnSerVlaIleGlyLysCysArgProPheLysTyrSer205210 215 220GlyCysGlyGlyAsnGluAsnAsnPheThrSerLysGlnGluCysLeuArgAlaCysLys225230 235 240LysGlyPheIleGlnArgIleSerLysGlyGlyLeuIleLysThrLysArgLysArgLys245250255260LysGlnArgVlaLysIleAlaTyrGluGluI lePheVlaLysAsnMet265270 27权利要求
1.一种人类组织因子途径抑制因子突变基因mTFPI，其特征是它具有序列表中SEQ IDNo.1所述的核苷酸序列。
2.一种包括权利要求1突变基因的重组载体，其特征是将序列表中SEQ ID No.1所述的核苷酸序列用XhoI和EcoRI处理后与pPic9载体，加入T4连接酶，进行连接反应，制成mTFPI-pPic9。
3.一种含有权利要求1的TFPI突变基因mTFPI的转化宿主细胞，它是将mTFPI-pPic9导入到宿主毕赤酵母菌GS115，成为GS115/mTFPI-pPic9。
全文摘要
本发明公开了一种人类组织因子途径抑制因子突变基因mTFPI、包括该基因的重组载体及其宿主细胞，实验证明，与野生型TFPI基因在毕赤酵母中表达的重组蛋白量相比，本发明的TFPI突变基因mTFPI在毕赤酵母中所表达的重组蛋白量有较大提高，从而可以大大降低大规模发酵培养获得该重组蛋白的生产成本。
文档编号C12N15/67GK1920029SQ20061001565
公开日2007年2月28日 申请日期2006年9月14日 优先权日2006年9月14日
发明者冷希岗, 罗师平, 宋丽萍, 刘兰霞, 余波 申请人:中国医学科学院生物医学工程研究所