用于抑制alas1基因表达的组合物与方法
【专利说明】用于抑制ALAS1基因表达的组合物与方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请是对于2013年3月15日提交的美国申请号13/835,613的部分继续申请， 并且还要求了对于2012年4月10日提交的美国临时申请号61/622, 288的优先权。上述 申请各自的全部内容以其整体结合在此。 发明领域
[0003] 本发明涉及特异性抑制ALAS1基因的表达。
[0004]发明背景
[0005] 遗传性卟啉症是血红素生物合成途径（在此还称作卟啉途径）中特异性酶的活性 缺乏导致的一类失调。卟啉途径中酶的缺乏导致血红素的不充分生产并且导致卟啉前体和 卟啉的累积，高浓度的卟啉前体和卟啉对组织是有毒的。
[0006] 遗传性卟啉症中，急性间歇性卟啉症（AIP，例如，常染色体显性AIP)、杂斑卟啉症 (variegate porphyria, VP，例如，常染色体显性VP)、遗传性粪卩卜啉症（粪卩卜啉症或HCP, 例如，常染色体显性HCP)、以及5'氨基乙酰丙酸（还称作S -氨基乙酰丙酸或ALA)脱水 酶缺乏卟啉症（ADP，例如，常染色体隐性ADP)被分类为急性肝性卟啉症并且表现为可能危 及生命的急性神经性发作。这些急性发作特征是自主神经、外周神经和中枢神经症状，包括 急性腹痛、高血压、心动过速、便秘、运动无力、瘫痪、以及抽搐。如果治疗不得当，接着可能 发生四肢瘫痪、呼吸道受损、以及死亡。多种因素，包括细胞色素P450-诱导药物、饮食、以 及激素变化可能通过增加肝5' -氨基乙酰丙酸合酶1 (ALAS1，血红素生物合成途径的第一 以及限速酶）的活性促成急性发作。在急性卟啉症，例如，AIP、VP、HCP以及ADP中，各自 的酶缺乏导致肝产生并累积一种或多种物质（例如，吓啉和/或卟啉前体，例如，ALA和/ 或PBG)，这种或这些物质可能是神经毒的并且可能导致发生急性发作。参见，例如，巴望尼 (Balwani，M)和戴斯尼克（Desnick，R. J.)，血液（Blood)，120 :4496-4504, 2012。
[0007] 目前用于急性神经性发作的疗法是静脉给药氯化血红素（Panhematin?,灵北公 司（Lundbeck)或Normosang?，科懋公司（Orphan Europe))，这为ALAS1的负反馈抑制提 供了外源血红素，并且由此降低了 ALA和PBG产生。氯化血红素用于在急性发作期间进行 治疗或用于预防发作，特别是对于患有急性卟啉症并在她们的月经周期中伴随激素变化经 历频繁发作的女性。虽然患者总体上响应良好，但是它的效果缓慢，典型地花费二到四天或 更久来使得ALA和PBG浓度朝向正常水平标准化。因为静脉内氯化血红素代谢迅速，通常 需要三至四次输注以有效治疗或预防急性发作。此外，重复输注可能导致铁超负荷以及静 脉炎，这可能危害外周静脉通路。尽管通过原位肝移植可治愈，这一手术具有显著的发病率 和死亡率并且可用的肝供体是受限的。因此，需要更有效、作用快速且安全的替代性治疗方 案。如果此类治疗可以通过皮下给药而递送，将是特别有益的，因为这将排除对输注和旷日 持久的住院治疗的需求。
[0008] AIP，还称作胆色素原脱氨酶（PB⑶）缺乏，或羟甲基胆素合酶（HMBS)缺乏，是最 常见的急性肝性卟啉症。这是由HMBS基因突变引起的一种常染色体显性失调，这一突变 将导致该酶的活性降低，例如，正常活性的一半。预先通过同源重组产生具有约30%野 生型HMBS活性的AIP小鼠模型。如同人类患者一样，当给予生P卜啉药（porphyrinogenic drugs)，如苯巴比妥时，这些小鼠增加肝ALAS1活性并且累积大量的血浆和尿ALA与PBG。 因此，将它们用作对用于急性肝性卟啉症的新颖疗法的效力进行评估的优异模型。
[0009] 发明概沭
[0010] 本发明描述了用于调节ALAS1基因表达的方法和iRNA组合物。在某些实施例中， 使用ALAS1-特异性iRNA降低或抑制ALAS1基因的表达。这样的抑制可以有用于治疗与 ALAS1表达相关的失调，如P卜啉症。
[0011] 因此，在此描述的是多种组合物和方法，如在细胞或在受试者中（例如，在哺乳动 物如人类受试者中），实现ALAS1基因RNA转录本的RNA-诱导的沉默复合体（RISC)-介导 的切割。还描述了多种组合物和方法，用于治疗与ALAS1基因的表达相关的失调，像卟啉 症，例如，X-连锁的铁粒幼细胞贫血（XLSA)、ALA脱水酶缺乏卟啉症（Doss卟啉症或ADP)、 急性间歇性卟啉症（AIP)、先天性红细胞生成性卟啉症（CEP)、迟发性皮肤卟啉症（PCT)、遗 传性粪卟啉症（粪卟啉症、或HCP)、杂斑卟啉症（VP)、红细胞生成性原卟啉症（EPP)、或婴 儿暂时性红细胞卟啉症。在一些实施例中，该失调是急性肝性卟啉症，例如，ALA脱水酶缺 乏卟啉症（ADP)、AIP、HCP、或VP。在某些实施例中，该失调是ALA脱水酶缺乏卟啉症（ADP) 或 AIP。
[0012] 在实施例中，该B卜琳症是肝性B卜琳症，例如，是选自以下各项的B卜琳症：急性间歇 性卟啉症（AIP)遗传性粪卟啉症（HCP)、杂斑卟啉症（VP)、ALA脱水酶缺乏卟啉症（ADP)、 和肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，吓啉症是纯合的显性肝性卟啉症（例如，纯合的 显性AIP、HCP、或VP)或肝性红细胞生成性卟啉症。在实施例中，吓啉症是双卟啉症（dual porphyria)〇
[0013] 如在此使用的，术语" iRNA"、"RNAi "、" iRNA剂"、或"RNAi剂"是指包含如在此定 义的术语RNA，并且例如，经由RNA-诱导的沉默复合物（RISC)路径介导RNA转录本的靶向 切割的一种试剂。在一个实施例中，如在此所述的iRNA实现ALAS1在细胞或哺乳动物中表 达的抑制。
[0014] 包含在在此表征的组合物中的iRNA包含具有RNA链（反义链）的dsRNA，该RNA 链具有一个区域，例如，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24个核苷酸的长度， 该区域基本上与ALAS1基因（例如，小鼠或人ALAS1基因）的mRNA转录本（在此还称作 "ALAS1-特异性iRNA"）的至少一部分互补。可替代地，或组合地，iRNAs包含具有RNA链 (反义链）的dsRNA，该RNA链具有一个区域，该区域是30个或更少个核苷酸，通常是19-24 个核苷酸的长度，该区域基本上与ALAS1基因（例如，人ALAS1基因的变体1或2)的mRNA 转录本的至少一部分互补（在此还称作"ALAS1-特异性iRNA"）。
[0015] 在实施例中，在此描述的iRNA(例如dsRNA)包括一个反义链，该反义链具 有基本上与人ALAS1的一个区域互补的一个区域。在实施例中，人ALAS1具有序列 NM_000688.4(SEQ ID N0:1)或 NM_000688.5(SEQ ID N0:382)。
[0016] 在其他实施例中，iRNA包含具有RNA链（反义链）的dsRNA，该RNA链具有一个区 域，该区域基本上与根据表2、3、6、7、8、9、14、15、18或20中任意一个的ALASlmRNA的一部 分互补。在一个实施例中，iRNA包含具有RNA链（反义链）的dsRNA，该RNA链具有一个区 域，该区域基本上与ALASlmRNA的一部分互补，例如人ALASlmRNA(例如，如在SEQIDNO:1 或SEQIDNO:382 中提供的人ALASlmRNA)。
[0017] 在一个实施例中，用于抑制ALAS1基因表达的iRNA包含至少两个彼此互补的序 列。iRNA包括具有第一序列的有义链和具有第二序列的反义链。反义链包含基本上与编 码ALAS1转录本的mRNA的至少一部分互补的核苷酸序列，并且该互补区域是30个或更少 个核苷酸和至少15个核苷酸长度。总体上，iRNA长度是19个至24个核苷酸。
[0018] 在一些实施例中，iRNA是19个至21个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA是 19-21个核苷酸长度并且使一种脂质配制品，例如，脂质纳米颗粒（LNP)配制品（例如， LNP11 制剂）。
[0019] 在一些实施例中，iRNA是21个至23个核苷酸长度。在一些实施例中，iRNA 是21-23个核苷酸长度并且处于共轭物的形式，例如，共轭至如在此描述的一种或多种 GalNAc衍生物。
[0020] 在一些实施例中，iRNA是从约15至约25个核苷酸长度，并且在其他实施例中，该 iRNA是从约25至约30个核苷酸长度。一旦与表达ALAS1的细胞接触，靶向ALAS1的iRNA 抑制ALAS1基因的表达至少10 %、至少20 %、至少25 %、至少30 %、至少35 %或至少40 %或 更多，如通过如本文所述的方法分析时。在一个实施例中，在稳定的核酸脂质颗粒（SNALP) 中配制靶向ALAS1的iRNA。
[0021] 在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包含选自由表2、3、6、7、8、9、14、 和15的有义序列组成的组的dsRNA的第一序列以及选自由表2、3、6、7、8、9、14、和15的相 应反义序列组成的组的第二序列。
[0022] 在一个实施例中，在此表征的iRNA(例如，dsRNA)包含选自由表2、3、6、7、8、9、 14、 15、18、和20的有义序列组成的组的dsRNA的第一序列以及选自由表2、3、6、7、8、9、14、 15、 18、和20的相应反义序列组成的组的第二序列。在一个实施例中，在此表征的iRNA(例 如，dsRNA)具有选自以下如在本文实例中披露的那些的有义和/或反义序列：AD-58882、 AD-58878、AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、AD-59129、AD-59124、AD-58874、 AD-59125、AD-59105、AD-59120、AD-59122、AD-59106、AD-59126、以及 AD-59107。在实施例 中，iRNA(例如，dsRNA)具有选自以下那些的有义和/或反义序列：AD-58882、AD-58878、 AD-58886、AD-58877、AD-59115、AD-58856、以及 AD-5