专利名称：用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域。本发明涉及一种用于生产琥珀酸的重组质粒 和一种琥珀酸高产基因工程菌。本申请还涉及上述重组质粒以及基因工程菌 的制备方法。本申请同时涉及上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因 工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。
背景技术：
能源和环保是当今世界面临的重要问题。琥珀酸作为一种生物材料，是 最好的石油代替品之一。
琥珀酸(succinic acid)的学名为丁二酸(butanedioic acid),是线性 饱和二元羧酸，可以作为中间化工产品，生成1， 4 一丁二酯、四氢呋喃、 Y-丁内酯和其他四碳化合物。随着催化工艺的发展，琥珀酸还可以转化为 更多的化工产品和医药产品，如由琥珀酸氲化生成的丁二醇可以羧化生成己 二酸，合成可生物降解的聚合物材料琥珀酸聚丁酸酯(PBS)等，这就使得 琥珀酸的市场以平均每年6-10 %的速率增长，预计在未来十多年间琥珀酸的 世界市场将由1997年的1. 5 x 104吨扩增为大约2. 75 x 106吨。
目前，大部分工业用琥珀酸还是通过化学合成的方法生产，化学合成法 生产琥珀酸的原料苯为石油化工产品，并且马来酸酐氢化生成琥珀酸酐再水 合生成琥珀酸的转化过程费用高，会造成大量的污染。随着人们环保意识和 可持续发展意识的提高，发酵法生产琥珀酸成了新的研究热点。 一旦实现了 琥珀H酵大规^莫生产，就可以琥珀酸取代石油化工产品苯及基于石化中间
低。琥珀酸发酵消耗lmol葡萄糖的同时固定lmol C02，消耗了温室效应气体， 因此，发酵法生产的琥珀酸将是一种很好的绿色平台化学品。然而，釆用一 般厌氧瘤胃菌林发酵琥珀酸难度大，底物转化率低，产品价格偏高，因此， 迫切需要寻找或构建一种能代谢多种廉价碳源，发酵条件简单，琥珀酸高产 的新菌抹。与乳酸、乙醇等有机物的发酵研究相比，琥珀酸发酵研究起步较晚，文 献报道也相对较少。综合已有文献来看，菌种研究方面，比较有应用前景的 菌种包括产琥珀酸厌氧螺菌、产琥珀酸放线杆菌和经基因改造的大肠杆菌。 这三种菌都是通过混合酸发酵产能，发酵产物为乙酸、乳酸、琥珀酸等。但 是，琥珀酸厌氧螺菌要求绝对厌氧环境，培养条件苛刻。并且，在低二氧化 碳水平下，产琥珀酸厌氧螺菌发酵葡萄糖以产乳酸为主要产物，而产琥珀酸
放线杆菌则发酵葡萄糖以产乙醇为主要产物；只有在高C02浓度的条件下进 行发酵才以琥珀酸为主要产物，这就需要额外的供气设备，增加产品成本。 相比而言，大肠杆菌培养条件简单，菌林本身有多条琥珀酸生产途径，具有 代谢灵活性，易于改造。对大肠杆菌琥珀酸代谢的研究表明，在以葡萄糖为 底物的混合酸发酵中，琥珀酸生成是通过三羧酸循环的还原臂生成的，由该 途径产生l摩尔琥珀酸伴随着1摩尔二氧化碳的固定。该途径的关4建反应是 将三碳中间物磷酸烯醇式丙酮酸(PEP )转化为四碳化合物草酰乙酸(OAA)。 草酰乙酸随后被苹果酸脱氢酶转化为苹果酸(malate)，由富马酸合酶生成 富马酸，最后由富马酸裂解酶生成琥珀酸。大肠杆菌中催化PEP羧化的酶是 PEP羧化酶(PEPC, Ppc)。同时，在某些情况下，乙醛酸旁路及其它分枝代 谢途径也参与到琥珀酸代谢中，使琥珀酸的产生更具灵活性。PEP羧化酶催 化反应分为三步(如图1),自由能为-30KJmor1，反应是不可逆的。第一步 反应为碳酸氢根和PEP反应生成carboxyphosphate和enolate，第二步反 应为催化第一步产物生成磷酸根、二氧化碳和enolate,第三步反应为催化 二氧化^酸和enolate生成0AA 。可以看出，最初二氧化石灰的固定形式是》友酸 氩根离子，并且反应同化了 1摩尔二氧化碳。碳酸酐酶(CA: carbonic anhydrase)催化二氧化碳形成碳酸氢根的形式，这预示着在大肠杆菌体内 扩增碳酸苷酶将有助于提高二氧化碳的固定速率，有利于增加三羧酸循环的 碳流供应，有利于提高琥珀酸的产量。
目前国内外对大肠杆菌生产琥珀酸的代谢网络主要进行的改造有1、过 量表达大肠杆菌的Ppc酶或表达异源的Rhizobium etli pyc酶；2、使Pfl 酶(丙酮酸-曱酸裂解酶)或Ldh酶(乳酸脱氩酶)失活，以减少碳源流向 其它有机酸；3、过量表达Malic酶(苹果酸酶)。(Applied.and Environmental Microbiology, 1996, 62(5): 1808 ; Applied and Environmental Microbiology, 2000, 66 (5): 1844; Microbiology, 1997 (143): 187; Applied and Environmental Microbiology, 1997， 63 (7): 2695 )。 这些改
造的出发点都是针对PEP的利用，即来源于葡萄糖的碳流的利用；但是，碳 流的另一个来源二氧化碳，也应该受到同样的重视，因为琥珀酸碳骨架的 一半是来源于二氧化碳的。PEPC不能直接利用二氧化石友，C02必须转变为HC(V 的形式才能被利用，且HC03—的存在对PEPC酶活有底物促进作用。虽然C02
作外非极性小分子极易透过质膜，但C02向外渗透形成的溢出通量远远超过
转运系统所能达到的输入通量，并且细胞质内C02转化为HC03—的反应受碳酸 酐酶(CA)催化的C02+H2OHir+ HC(V的制约，这就使得PEPC酶催化 PEP的反应受到HC(V浓度的制约。而在一般细菌培养液中，C02自发形成HC(V 穿膜的量是很小的，因此常在培养基中添加碳酸氢盐提供额外的HC(V。
蓝藻属于原核生物，而本身可以利用C02进行光合自养，是物种进化历程 的一个中间体。生态观测的数据表明，蓝藻在富营养化水体中占优势可能与
它们拥有C02浓缩机制有关。Fridlyand L等认为C02可能通过被动扩散进入 细胞，而后通过包括碳酸酐酶(CA)的组分将C02转变为HC03—，这一步骤导 致蓝藻细胞质内Ci浓度可达25 ~ 60mmol. L-l。 (Biosystems, 1996， 37: 229 )。这就为蓝藻自身进行光合碳同化和PEPC催化生成OAA的三羧酸循环 回补代谢途径提供了丰富的碳源。这说明蓝藻的CA酶比起一般的原核生物 活性更高，在改造大肠杆菌生产琥珀酸时可以发挥更大功效。
虽然大肠杆菌自身亦能产生琥珀酸，但产量相对低。国外虽然已经有过 一些琥珀酸高产基因工程菌构建的报道，但主要是以琥珀酸放线杆菌或野生 型的大肠杆菌K12为出发菌株,采用自发突变的形式筛选或提高Ppc酶或Pyc 酶的拷贝数，并且已经申请了专利保护。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸 高产基因工程菌。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌的 制备方法。本发明的目的还在于提供一种重组质粒以及基因工程菌在制备用 于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。
为了充分利用大肠杆菌本身具有多条琥珀酸代谢途径的优势，同时发挥 外源基因提高二氧化碳利用率的作用，本发明旨在提高本实验室保存的大肠 杆菌BL21(DE3)的琥珀酸产量。BL21是常用的大肠杆菌表达菌抹， 一般配 合以强表达载体来进行目的基因的强表达。本发明提供的重组大肠杆菌 BCCAlll，是含有多拷贝的携带完整蓝藻鱼腥藻(cyanobacterium Anabaena
sp. 7120 )碳酸酐酶基因(CA)的重组质粒的基因工程菌抹BL21 (DE3)。
综上，本发明的基本技术构思是将蓝藻的碳酸酐酶基因克隆到质粒载
体PET-21a上，再将重组后的质粒转入BL21(DE3)中，以达到通过提高蓝藻
碳酸酐酶基因的拷贝数从而提高大肠杆菌BL21(DE3)的C02固定能力，提高
琥珀酸产量的目的。
针对本发明的发明目的，本发明提供如下技术方案
一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是携带有蓝藻鱼腥藻
cyanobacterium Anabaena sp. 7120碳酸酐酶基因的pMD19-T载体(pMD-
ca2 )。
优选地，该重组质粒携带完整的包括蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp. 7120碳酸酐酶基因上下游35个碱基在内的片段。
另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是携带有蓝藻鱼腥藻 cyanobacterium Anabaena sp. 7120碳酸酐酶基因的pMD19-T载体(pMD -cal)。
优选地，该重组质粒是携带完整的包括蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp. 7120碳酸酐酶基因编码序列的pMD19-T载体。
另一方面，本发明提供一种重组质粒，该重组质粒是通过将前述的重组 质粒pMD-cal与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和Sail双酶切，将切 下的蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp. 7120石灰酸酐酶基因片段连接 到质粒pET-21a中而得到的(pMD - cyanoca )。
优选地，所述重组质粒是携带有含有多拷贝的完整蓝藻鱼腥藻 cyanobacterium Anabaena sp. 7120碳酸酐酶基因的pET21a(+)载体。
另一方面，本发明提供一种琥珀酸高产基因工程菌，所述工程菌是通过 将前述任一重组质粒转入原始菌抹大肠杆菌BL21 (DE3)中而得到的。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-ca2的构建方法，所述方 法包括
首先设计引物cal: 5， — CAACCGCAGGGAAATGAG —3， ， ca2: 5，— CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT — 3，；
以蓝藻鱼腥藻cyanobacterium Anabaena sp. 7120的总DNA为模板，进行 PCR扩增，得到一个约830bp的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID N0: l所 示，用于构建所述的重组质粒pMD-ca2， 830bp中包含CA基因上下游35个碱基 在内的序列。
经测序证实其包含具体序列如序列表中SEQ ID NO: 2所示的鱼腥藻7120
碳酸酐酶的基因片段(795bp);
纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到所述重组质粒。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pMD-cal的构建方法，所述方
法包括
利用设计的引物ca3: 5， — AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC — 3，，划线处为 BamHI酶切位点；ca4: 5， 一 GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC —3，，划线处为 Sall酶切位点；以质粒pMD-ca2为模板，进行PCR扩增，得到一个约795bp 的片段，其具体序列如序列表中SEQ ID N0: 2所示，其为CA基因序列795bp， 用于构建所述的重组质粒pMD-cal和下述的重组质粒pET 一 cyanoca,经测序 证实为碳酸酐酶基因的编码序列，连接到pMD-T载体，得到质粒pMD-cal。
另一方面，本发明提供一种前述重组质粒pET-cyanoca的构建方法，所 述方法包括将前述方法得到的质粒pMD-cal与大肠杆菌质粒pET-21a分别 用BamHI和Sail双酶切，将鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因片段插入质粒 pET-21a的酶切位点处，构建出所述重组质粒。
另一方面，本发明提供一种所述琥珀酸高产基因工程菌的制备方法，将 前述任一重组质粒转入原始菌株大肠杆菌BL21 (DE3)中，即得到所述基因工 程菌。
另一方面，本发明提供一种前述任一重组质粒在制备用于基因工程发酵 生产琥珀酸的生物产品中的应用。
另 一方面，本发明提供一种所述基因工程菌在制备用于基因工程发酵生 产琥珀酸的生物产品中的应用。
另 一方面，本发明提供一种使用所述基因工程菌来发酵多种碳源来生产 琥珀酸的方法，所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导 剂时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段培养而 生产琥珀酸。
优选地，所述碳源为葡萄糖，和/或所述诱导剂为乳糖和IPTG(异丙1^ 代-P - D-半乳糖苷)。
在本发明的一个优选的实施方式中，将pMD-cal质粒与大肠杆菌质粒 pET-21a分别用BamHI和Sail双酶切，将切下的小片段连4妄到质粒pET-21a 中，得到重组质粒pET-cyanoca;
在本发明的一个优选的实施方式中，提供一种琥珀酸高产基因工程菌，
其以蓝藻(cyanobacteri咖Anabaena sp. 7120)的总DM为模板，用引物 cal和ca2扩增，得到完整的包括CA基因上下游35个碱基在内的片段，与 pMD19-T质粒载体连接，得到重组质粒pMD-ca2;再以pMD-ca2为模版，用 引物ca3和ca4扩增得到两端有BamHI和Sail酶切位点的CA基因的编码区 序列，将PCR产物与pMD19-T质粒载体连接，得到重组质粒pMD-cal;将 pMD-cal质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和Sail双酶切，将切下 的小片段连接到质粒pET-21a中，得到重组质粒pET-cyanoca;重组质粒 pET-cyanoca转入原始菌抹BL21 (DE3)中，得到一4朱基因工程菌BCCAlll。所 述引物为cal: 5 ， 一 CAACCGCAGGGAAATGAG — 3 ， ， ca2: 5 ， _ CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3，。
在本发明的一个优选的实施方式中，提供一种构建琥珀酸高产基因工程 菌BCCAlll的方法，是将含有完整鱼腥藻7120^碳酸酐酶基因的重组质粒转 入大肠杆菌BL21 (DE3)中,得到基因工程菌BCCAlll。
在本发明的一个进一步优选的实施方式中，提供所述重组质粒为 pET-cyanoca，大概构建过程如下所述
首先"^L计引物cal: 5， 一 CAACCGCAGGGAAATGAG — 3， ， ca2: 5，一 CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT—3， 以cyanobacterium Anabaena sp. 7120的总 DNA为模板，进行PCR扩增，得到一个约830bp的片段，经测序证实其包含 鱼腥藻7120碳酸酐酶的基因片段(795bp);纯化PCR产物，连接到pMD19-T 载体上(购于TaKaRa公司)，得到质粒pMD-ca2;为了在碳酸肝酶基因两端 分别加上BamHI和Sail酶切位点，利用i殳计的引物ca3: 5， _ AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC — 3，(划线处为BamHI酶切位点)，ca4: 5，一 GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC —3，(划线处为Sail酶切位点)，以pMD-ca2 为模板，进行PCR扩增，得到一个约795bp的片段，经测序证实为碳酸酐酶 基因的编码序列，连接到pMD-T载体(购于TaKaRa公司),得到质粒pMD-cal; 纯化PCR产物，然后用BamHI和SalI双酶切质粒pMD-cal和pET-21a，将 其795bp片段插入质粒pET-21a的酶切位点处，构建出pET-cyanoca。重组 质粒pET-cyanoca构建过程如图2所示。质粒pET-21a购于Novagen公司。
本发明产生如下的技术效果
本发明的菌抹和质粒能够提高原始大肠杆菌BL21 (DE3)的琥珀酸产量，获 得生长速率提高、具有更高琥珀酸产量的重组基因工程菌。
通过对比实验证明，构建出来的工程菌相对于原始菌来说，在生物量的
积累速率上，在不同浓度IPTG或乳糖的诱导下以及在单纯厌氧发酵和先有 氧，后无氧的双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大的提高。表明这抹工程菌存 在着一定的应用潜力。
下面结合附图对本发明作进一步的说明
图1是PEPC酶的三步催化反应机制及CA酶的催化反应机理示意图； 图2是质粒pET-cyanoca的构建过程示意图3是重组大肠杆菌质粒BamHI和SalI双酶切电泳图，其中，M: XDNA
双酶切marker; 1# 、 2#、 3#: pMD-cal; 4#、 5#、 6#:质粒pET隱cyanoca; 图4是BL21 (DE3)与BCCA111的生长速率曲线比较结果； 图5是BL21 (DE3)与BCCA111在不同浓度IPTG诱导下的琥珀酸产量
比较结果；
图6是BL21 (DE3)与BCCA111在双阶段培养时的琥珀酸产量比较结
果；
图7是BCCA 111在双阶段#卜料发酵时的琥珀酸产量试验结果。
具体实施例方式
下面结合具体实施方式
，进一步阐述本发明。但这些实例仅限于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施方式中未注明具体实验条件 的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件。
一、 培养基的配制
LB培养基成份为每升水中含有5g酵母粉，10g胰蛋白胨和10gNaCl。固 体培养基为液体基中加入1.5。/。的琼脂粉。为了增加培养基的选择性，氨千青 霉素(Amp)的使用浓度是50ug/ml。
二、 cyanobacterium Anabaena sp. 7120总DNA的提取
用SDS-蛋白酶K裂解菌体(蓝藻鱼腥藻菌cyanobacteri咖Anabaena sp.7120,购于中国科学院水生生物研究所菌种保藏中心)，十六烷基三曱 基溴化铵(CTAB)沉淀细胞碎片和多糖，再用异丙醇沉淀来提取总DNA。其 中使用的蛋白酶K是一种非特异性、枯草杆菌蛋白酶相关的丝氨酸蛋白酶， 具有很高的比活性。EDTA等鳌合剂或SDS等去垢剂不能使蛋白酶K失活，该 酶在较广的pH范围内(pH 4-12. 5)均有活性。
1) 取单菌落接种于100ml含氮培养基BG11中，在合适的温度下培养8 天。BG11为已知的蓝藻通用培养基，配方为1000ml含NaN03 1.5g， K2HPO40.03g， MgS04.7H20 0.075g, CaCl2.2H20 0.036g，柠檬酸和柠檬酸铁 铵0.006g， EDTA O.OOlg， Na2C03 0.02g，痕量金属溶液1ml (H3B03 2.86g/L，MnCl2.4H20 1.81g/L， ZnS04.7H20 0.222 g/L, NaMo04.5H20 0.39g/L,CuSO4.5H2O 0.079 g/L, Co(N03)2.6H20 0.0494 g/L), pH 7.5。
2) 取20ml菌液于离心管中，13,000 rpm离心2min,弃上清。
3) 沉淀重悬于1. Oml 0. 85% NaCl中。
4) 室温13, 000 rpm离心2min,弃上清。
5) 沉淀重悬于550jul lxTE (Tris-HCl/EDTA緩沖液，配方为lOmmol /dm. 3. Tris-HCl， l画l/dm. 3. EDTA， pH值8. 0)中。
6 )加17 ja 1溶菌酶(35mg/ml), 37。C温育30 min。
7) 加3jul蛋白酶K (20mg/ml)， 37。C温育30 min。
8) 加30jul 10%十二烷基磺酸钠SDS， 37。C温育30 min。
9) 加100jil 5M NaCl充分混匀。
10) 力。80jil CTAB/NaCl溶液，混匀，65。C水浴10 min。
11) 加等体积(0. 7-0. 8ml )氯仿/异戊醇(24: 1 ),轻轻振荡混匀。 12 )室温，13, 000 rpm离心10 min。
13) 将上清液转移到一新1.5ml离心管中，加入等体积酚/氯仿/异戊醇 (25:24:1 )轻轻振荡混匀。
14) 重复第12)步。
15 )将上清液转移到一新1. 5ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇(24: 1) 轻轻振荡混匀。
16)重复第12)步。
17 )将上清液转移到一新1. 5ml离心管中，加入0. 6体积异丙醇，混匀 后室温静置60 min。
18) 20°C 13,000 rpm离心20 min。
19) 弃上清，加500jnl 70°/。乙醇，轻轻颠倒数次(洗盐)。
20) 4°C 15,000 rpm离心20 min。
21) 重复洗盐两次。
22) 倒置离心管，干燥DNA沉淀10-15min。
DNA沉淀溶于30|u 1 1 xTE緩冲液(Tris-HC1/BDTA緩冲液，配方为 10咖ol/dm3. Tris-HCl， lmmol/dm3. EDTA， pH值8. 0), —20。C保存备用。
三、 重组质粒pMD-cal的酶切分析 用碱裂解法提取质粒DNA。
取2 ja 1质粒DNA,用BamHI和Sail双酶切。混合均勻，稍稍离心使溶液 聚集到管底。37°C，反应2小时。酶切反应体积如下
灭菌的去离子水 13 质粒DNA pMD-cal 2 |i 1
10 x酶切緩沖液T购于TaKaRa， 330mM Tris-乙酸(pH 3 p 1 7. 9)，100mM乙酸镁，5mM二硫苏糖醇，660mM乙酸钾
限制酶BamHI 1 ji 1
限制酶SalI lMl 总体积 20|dl
酶切完毕后上样电泳4b验，电泳见图3。
四、 重组质粒pET - cya加ca的构建
pET-21 a质粒的酶切体系按如下配比组成:_
pET-21a质粒 5pl 限制酶SalI lpl 限制酶BamHI 1 ju 1
酶切缓沖液T购于TaKaRa， 330mM Tris-乙酸(pH 3 ju 1 7.9)，100mM乙酸镁，5mM二硫苏糖醇，660mM乙酸钾
灭菌水 lO]Lll
总体积
20jul
酶切反应37。C进行3小时后，电泳检验酶切程度。用DNA回收试剂盒回 收酶切后的质粒。使用小牛碱性磷酸酶CIAP (浓度0. OIU/ L )进行脱末端
去磷酸化。反应按如下配比组成:_
酶切回收的pET21 a质粒 4 0 m 1
lOxCIAP緩沖液购于TaKaRa，lOmM Tris-HCl (pH 5 1 8.0)，50mM KCl， ImM MgCl2， 0. ImM ZnCl2, 50%甘油
ciap (0. OIU/jjL) 5jul
合计
50ju 1
以上成份混合后在37。C反应30分钟后，再加入0. OlU/juL的CIAP5y 1，
继续在30。C反应30分钟后加入300 ju 1的反应终止液。反应终止液的成份是 1O咖ol/L Tris-HCL (pH7. 5), lmmol/L EDTA (pH7. 5) ， 200mmol/L NaCl， 0. 5% SDS。然后用酚氯仿抽提，再用乙醇沉淀回收得到末端脱磷pET21a质粒。 用碱裂解法提取pMD-cal重组质粒，BamHI和Sail双酶切，反应体系如下
pMD-cal质粒 5 |a 1 限制酶SalI
P艮制酶BamHI 1 ju 1
酶切緩沖液T购于TaKaRa， 330niM Tris-乙酸(pH 3jul 7.9)，100mM乙酸镁，5mM二硫苏糖醇，660mM乙酸钾
灭菌水_lOjn 1
合计 20jul
酶切反应在37。C进行3小时后，凝胶电泳并回收795bp的条带，此即为 ca插入片段。该片段与处理好的pET-21a载体按如下的方法混和后进行连接 反应。
pET-21a载体 CA片段
连接緩沖液DNA Ligation Mix<Mighty Mix> 购于Takara公司
合计_8jul
连接反应在16。C进行4小时后用于转化反应。
五、 DNA连接产物的转化反应与阳性克隆的筛选
感受态细胞用CaC12法制备。选取大肠杆菌BL21 (DE3)制成感受态细胞， 用热击法进行转化反应，热击的反应条件是42。C热击90秒。热击后加入800 /iL的LB培养基LB培养基的成分(每1000ml) Trypton: 10g，酵母提取 物5g， NaCl 10g， pH7. 0-7. 237。C活化45分钟后涂于含100 |i g/ml氨卡 的LB平板上37。C过夜培养。挑取单菌落培养后碱液裂解法小量提取质粒， 用BamHI和SalI双酶切分析，其结果如图3所示。表明用BL21(DE3)为宿主 菌得到了阳性克隆。克隆所选用的方法是双酶切，这样克隆方向确定，保证 了克隆基因的读码框方向正确。
六、 重组菌的生长特征及稳定性分析
原始菌BL21(DE3)不具有氨千抗性，质粒载体上有氨节抗性基因。本基因 工程菌能在浓度为100jug/ml的氨爷平板上正常生长，表明重组质粒已经转
ly 1 4 n 1
入于原始菌抹BL21(DE3)中。挑取30个这样的菌落接种于含有100ug/ml 的氨节平板上，在该平板上没有质粒的菌则不能生长。结果经过24h的培养， 平板上长出了 27个菌落，说明该菌在没有任何的选择性压力的条件下仍十 分稳定，稳定性达90%。
七、 重组菌BCCAlll的生长速率
挑取平板培养的BCA111单菌落，接入20毫升的加有氨节lmg的LB培养 基中。30°C, 150转/分培养12小时后，再按1%的接种量将其接入500毫 升的加有氨苄25mg的LB培养基,30°C, 150转/分培养，在1. 5h时加入IPTG (异丙基硫代-P - D-半乳糖苷)0. 2mM。同时设立相同培养条件下的原始 菌抹BL21(DE3)作为对照。每隔1小时取样测定菌体的OD值，见图4。可以 看出在加入IPTG诱导后第6h开始，重组菌4朱的生长速率加快了，且指数生 长末期的菌体生物量增多，可能是因为重组菌的C02吸收速率增加，菌体碳 流的供应容易从而促进了生物量的积累加快。当然，在加入IPTG诱导后的4 个小时内，因为菌体要过量表达ca酶，菌体生长速率有所降低。
八、 工程菌BCCA111在不同浓度IPTG和乳净唐-秀导下的琥珀酸产量
当菌体生长OD值为0. 2 ~ 0. 4时，加入IPTG或乳糖诱导，使诱导物的终 浓度为0. lmM~2mM。此时的培养基为LB培养基，葡萄糖浓度为20g/L。完 全厌氧培养60h，采用HPLC的方法检测最终琥珀酸产量。同时设立相同条件 下培养的原始菌株BL21(DE3)作为琥珀酸产量对照。图5显示的是分别用 0. lmM、 0. 5mM、 lmM、 1. 5mM、 2mM IPTG诱导BCCA111发酵60h琥珀酸产量的 变化，由图5可以看出虽然诱导物浓度存在差异，但是工程菌BCCAlll的琥 珀酸产量在不同浓度的IPTG诱导下都高于原始菌BL21 (DE3)。
九、 工程菌BCCA111在双阶段培养下的琥珀酸产量 构建的工程菌株先150rpm， 37。C培养2h后加入诱导剂乳糖或IPTG诱导
CA表达；6h后加入灭菌葡萄糖储液使其终浓度为30g/L，静置摇瓶进行无氧 发酵。其间用NaOH调节发酵液的pH值使其保持在pH7. 5处，并间或补加Amp， 以防止质粒丢失。图6显示的是诱导剂为lmM乳糖时，发酵72h内每隔12h 检测到的琥珀酸产量的变化。至发酵终点，琥珀酸产量为20. 6g/L,比起原 始菌抹产量5. 2g/L提高了三倍多。
十、工程菌BCCA111在双阶段培养并补料流加时的琥珀酸产量 在加有5L发酵液的6LBioHo II发酵罐中进4亍补料发酵。加入100ml培 养6h的种子培养基到5L发酵液中，种子培养基和发酵培养基均加入IPTG
至终浓度0. 5mM,种子培养基为LB培养基。发酵培养基为LB培养基加葡萄 糖，初始葡萄糖浓度为40g/L,另加无机盐K2HP043. Og/L， K跳l. Og/L, (NH4)2S041. Og/L, CaCl2 0.2 g/L, MgCl20. 2 g/L, pH 7.5。当发酵过禾呈中4企 测葡萄糖浓度低至5g/L时，补加葡萄糖使其浓度保持为5g/L。间或补加Amp, 以防止质粒丢失。图7显示的是发酵60h内每隔12h检测到的琥珀酸产量的 变化。至发酵终点72h，琥珀酸浓度达到68g/L,这使琥珀酸的产量比起原始 BL21(DE3)菌林提高了 13倍以上。 序列表
<110>中国科学院过程工程研究所
〈120>用于生产琥珀酸的重组质粒、基因工程菌、其制法及用途 〈130> DIC07110080 <160> 2
〈170> Patentln version 3.3
<210> 1 〈211> 830 <212> DNA
<213> 蓝藻鱼腥藻(cyanobacteri咖Anabaena sp. 7120) 〈400> 1
caaccgcagg g犯atgagta gtactttata tcgaaggcaa ctactgaaat tattgggtat 60
gagtgtcttg ggaacctcat tttctagttg tgtcacatct ccagctaggg caaaaacggt 120
aaactgggga teitatcggca aagtaggccc agagcattgg ggtgagcttt cccctgactt 180
tgccctttgc c犯ataggca gaaaacaaac gccgattgat ttgcagattg cagatgtgaa 240
agatgtccac agcagcagtc aagatttgtt agttaccaat tatcagccaa cggcattaca 300
cctaatcaac aacggtaaaa cagtccaagt caactatcaa ccaggcagtt atctcaagta 360
tgctcaccaa aaatttgagc tgcttcagtt tcactttcat cacttcagcg aacatcgggt 420
tgatgggaaa ttatatgata tggaactcca tttagttcac cggagtaaat ctggcgactt 480
agccgttatg ggtattttct tgcaagcagg agcatttaac ccgacgctgc aaattatctg 540
ggatgccaca cctcaaaacc aagg犯caga caaaagaata gaggatataa atatagacgc 600
ttcccaattt ctcccagcac aacacagatt ttttacttat "tctggctctc tgacaacccc 660
accctgttca gaaaatgttc "tctggtgcgt aatggcgaca cctatcgaag cctctcctgc 720
acagatagct aagtttagtc aaatgtttcc ccaaaacgca cgtccagtgc aacctctcaa 780 cgEitcgcctei gttatcgaag ccatttaaaa tttttctgtc aacttccccg 830
<210> 2
<211> 795
<212> DNA
<213> 蓝藻鱼腥藻(cyanobacterium Anabaena sp. 7120)
<400> 2
atgagtagta ctttatatcg aaggcaacta ctgaaattat tgggtatgag tgtcttggga 60
acctcatttt ctagttgtgt cacatctxca gctagggcaa aaacggtaaa ctggggatat 120
atcggcaaag taggcccaga gcattggggt gagctttccc ctgactttgc cctttgccaa 180
ataggcagaa aacaaacgcc gattgatttg cagattgcag atgtgaaaga tgtccacagc 240
agcagtcaag atttgttagt taccaattat cagccaacgg cattacacct aatcaacaac 300
ggtaaaacag tccaagtcaa ctatcaacca ggcagttatc tcaagtatgc tcaccaaaaa 360
tttgagctgc ttcagtttca ctttcatceic ttcagcgaac atcgggttga tgggaaatta 420
tatgeitatgg a^ctccattt agttcaccgg agtaaatctg gcgacttagc cgttatgggt 480
attttcttgc aagcaggagc atttaacccg acgctgcaaa ttatctggga tgccacacct 540
caaaaccaag gaacagacaa aagaatagag gatataaeLtgL tageicgcttc ccaeitttctc 600
ccagcacaac acagattttt tacttattct ggctctctga caaccccacc ctgttcagaa 660
aatgttctct ggtgcgtaat ggcgacacct atcgaagcct ctcctgcaca gatagctaag 720
tttagtcaaa tgtttcccca犯acgcacgt ccagtgcaac ctctcaacga tcgcctagtt 780
atcgaagccei tttaa 79权利要求
1、一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒携带完整的包括序列表中SEQ ID NO:2的DNA片段的上下游35个碱基在内的片段；优选地，该重组质粒是携带有序列表中SEQ ID NO:1的DNA片段的pMD19-T载体。
2、 一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是携带有序列表中S E Q ID NO: 2的DNA片段的pMD19-T载体，是以权利要求1所述的质粒为模版扩增 得到的。
3、 一种重组质粒，其特征在于，该重组质粒是通过将权利要求2的重组质 粒与大肠杆菌质粒pET-21a分別用BamHI和Sail双酶切，将切下的序列表 中S E Q I D N0: 2的DNA片l更连接到质粒pET-21a中而得到的。
4、 一林琥珀酸高产基因工程菌，其特征在于所述工程菌是通过将权利要 求1-3中任一项的重组质粒转入原始菌抹大肠杆菌BL21 (DE3)中而得到的。
5、 权利要求1的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括 首先设计引物cal: 5， 一 CAACCGCAGGGAAATGAG — 3， ， ca2: 5，一 CGGGGAAGTTGACAGAAAAAT — 3，；以cyanobacterium Anabaena sp. 7120的总DNA为模板，进行PCR扩增，得 到一个约830bp的片段，经测序证实其包含序列表中S E Q I D N0: 2的 DNA片段；纯化PCR产物，连接到pMD19-T载体，得到所述重组质粒pMD-ca2。
6、 权利要求2的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括 利用设计的引物ca3: 5， 一 AACCGCGGATCCATGAGTAGTAC — 3，,划线处为BamHI 酶切位点；ca4: 5， 一 GGACAGAGTCGACTTAAATGGCTTC —3，，划线处为Sail 酶切位点；以权利要求5的方法得到的质粒为模板，进行PCR扩增，得到序 列表中S E Q I D N0: 2的DNA片段，经测序证实为碳酸酐酶基因的编码 序列，连接到pMD19-T载体，得到质粒pMD-cal。
7、 权利要求3的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述方法包括将权 利要求6的方法得到的质粒与大肠杆菌质粒pET-21a分别用BamHI和Sail 双酶切，将序列表中S E Q I D N0: 2的DNA片革殳插入质粒pET-21a的酶 切位点处，构建出所述重组质粒。
8、 权利要求4的琥珀酸高产基因工程菌的制备方法，其特征在于权利要求1-3中任一项的重组质粒转入原始菌林大肠杆菌BL21 (DE3)中，即得到所 述基因工程菌。
9、 权利要求l-3中任一项的重组质粒或权利要求4的基因工程菌在制备用 于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的应用。
10、 使用权利要求4的基因工程菌来发酵多种碳源来生产琥珀酸的方法，其 特征在于所述方法包括在生长过程中生物量的积累及加入不同的诱导剂 时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段培养而生 产琥珀酸；优选地，所述碳源为葡萄糖，和/或所述诱导剂为乳糖和IPTG。
全文摘要
本发明公开了一种用于生产琥珀酸的重组质粒和一种琥珀酸高产基因工程菌。本申请还公开了上述重组质粒以及基因工程菌的制备方法。本申请同时公开了上述重组质粒以及基因工程菌在制备用于基因工程发酵生产琥珀酸的生物产品中的用途。使用本发明的重组质粒构建出来的基因工程菌的稳定性高，相比较原始菌株BL21(DE3)，生长速率提高，在加入不同浓度诱导剂，即乳糖或IPTG时，在完全厌氧或先有氧积累菌体量，再无氧进行酸发酵的双阶段发酵时琥珀酸产量都有很大提高。
文档编号C12P7/46GK101381740SQ200710121399
公开日2009年3月11日 申请日期2007年9月5日 优先权日2007年9月5日
发明者强 李, 李望良, 丹 王, 苏志国, 邢建民 申请人:中国科学院过程工程研究所