耐热纤维素酶基因、重组工程菌、耐热纤维素酶及应用的制作方法

专利名称：耐热纤维素酶基因、重组工程菌、耐热纤维素酶及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及来源于闪烁杆菌属(Fenz/ctojbacteA7'um)细菌的耐热 纤维素酶基因、耐热纤维素酶、重组载体、生产耐热纤维素酶的基因工程菌，以及该耐热纤维 素酶在纤维加工等领域的应用。
背景技术：
纤维素是一种纤维状、坚韧的、水不溶的物质，广泛存在于植物的细胞壁中。纤维素无 疑是地球上最丰富的有机化合物。自然界纤维素主要来源有棉花、麻、树木、野生植物等等， 此外还有很大一部分来源于各种植物的茎杆，如麦秆、稻草、高粱秆、甘蔗渣等等。纤维素是 植物的主要支持物。与淀粉一样，纤维素也是一种多糖，其分子量介于5.0x104到4.0"09 之间，大致相当于8.0x10、1.0x10"个葡萄糖残基。纤维素分子由许多p-D-葡萄糖分子以p (1—4)糖苷键连接而成的直链。直链间彼此平行，链间葡萄糖的羟基之间极易形成氢键，使 得完整的纤维素具有高度不溶于水的性质。
纤维素不能被大多数动物消化，这是因为纤维素是葡萄糖单元通过(3 (1—4)糖苷键连接 构成的，而大多数动物体内只有水解a糖苷键的水解酶。 一些动物可以借助消化道内的共生 微生物来消化纤维素，例如反刍动物(牛、羊、骆驼等等)，有一个瘤胃结构，瘤胃中的微生 物可以分泌纤维素酶，帮助反刍动物消化纤维素类的食物。
大量的纤维素酶来源于微生物。纤维素酶可以分为内切纤维素酶、外切纤维素酶和p-葡 萄糖苷酶，三类纤维素酶彼此协同作用，可以有效地水解天然纤维素。开发和使用高效、廉价 的纤维素酶制剂，是对纤维素进行利用的关键。目前工业上使用的纤维素酶大多是来源于真菌 发酵的产物，是一种中温条件下发挥作用，同时含有三类纤维素酶的混合酶制剂，水解纤维素 的效率不够好；同时，在现有的纤维素酶应用领域(例如织物处理、洗涤、柔化、人造丝加工、 纸张处理等)中，使用传统的混合型纤维素酶制剂，可能会对纤维主体结构造成不必要的损伤， 不利于控制水解纤维素的工艺过程，所以，单一组分或者按比例使用多种单一组分的纤维素酶， 尤其是使用单一的内切纤维素酶组分，对于有效控制和改善生产工艺具有非同寻常的意义。
来源于嗜热菌的耐热纤维素酶，或者称为嗜热纤维素酶，由于具有较高的酶活力和热稳 定性，日益被人们所关注，成为纤维素酶基础研究和开发新型纤维素酶制剂的热点。
关于嗜热酶，自1985年第一种嗜热酶即Taq DNA聚合酶被成功地用于聚合酶链式反应 (PCR)后，生长在特殊高热环境下的微生物正日益引起人们的重视。许多具有水解酶活性 的嗜热酶(thermophilic enzyme, 55 - 80°C)相继得到了开发，并在许多领域发挥了重要作用。 近年来，人们从海底热流的嗜热性古细菌中分离得到超级嗜热酶(hyperthermophilic enzyme,
80- 113°C)，为现代酶工程技术展现了新的应用前景。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟 的优点，如催化效率高和底物专一性强，而且酶的稳定性极好。因而它可以克服中温酶 (mesophilic enzyme, 20 - 55°C)及低温酶(psychrophilic enzyme, -2 - 20°C)在应用过程 中常常出现的生物学性质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应过程得以实现，这将极大地 促进生物技术产业的发展，从而带动技术水平和生活质量的提高。
利用嗜热酶作为生物催化剂有如下优点(1)酶制剂的制备成本降低。因为嗜热酶的稳 定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持活性。(2)加快了动力
学反应。随着反应温度的提高，分子运动速度加快，酶催化能力加强。(3)对反应器冷却系 统的要求标准降低，因而减少了能耗。(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超 过70'C),很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对产物的污染。由于嗜热酶的高温反应活 性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、制革、石油开采及废 物处理等方面都有广泛的应用潜力。
分离自热喷泉等自然极端热环境的闪烁杆菌属(Fe/v/Gto办acte勿/n)细菌，属于嗜热真细 菌，从闪烁杆菌属细菌中分离得到的嗜热酶多具有很好的酶学性质和应用潜力。对多节闪烁杆 菌(Ferv/'cto6acteram noctost/m)基因组的分析，我们发现在此菌的基因组中可能包含几种 嗜热的纤维素酶基因。应用分子生物学技术，我们对其中一个纤维素酶基因进行了克隆和表达， 表达蛋白具有很高的水解羧甲基纤维素钠的活力，进一步的酶学研究证实，这一蛋白是一种性 质优良的耐热内切纤维素酶。
由于嗜热菌人工培养困难，生长周期较长，纤维素酶的含量很低，因此不利于直接利用 嗜热菌来生产耐热纤维素酶。将耐热纤维素酶基因转入可快速繁殖、培养条件简单的常温宿主 内，可有效地解决这些问题。

发明内容
本发明的目的之一是提供一种耐热纤维素酶基因；
本发明的目的之二是提供由上述耐热纤维素基因构建的重组质粒和重组工程菌； 本发明的目的之三是提供一种利用上述工程菌制备的稳定性好、耐热性强的耐热内切纤维 素酶(FnCel5A);
本发明的第四个目的是提供上述耐热纤维素酶在纤维素加工领域及诸如工农业、医药及科 学研究中的应用。
本发明的主要内容包括嗜热细菌(FeAv/cfo6acte〃'umnocfosu/nstrain Rt17-B1)的培养、 基因组的提取、用PCR方法钓取目的基因、重组质粒的构建、重组质粒在宿主菌中的表达、 工程菌的发酵培养、耐热纤维素酶的收获、提取、纯化、活力测定及性质研究。
我们所研究的耐热纤维素酶属于嗜热酶，它的基因来自于嗜热真细菌(FeAv/GtobactenY;m noctost/m strain Rt17-B1 )。
我们将来自嗜热真细菌(Fen//cfo6acten'um nodosum strain Rt17-B1)的耐热纤维素酶前 体蛋白基因(基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，由其编码的耐热纤维素酶前体蛋白的 氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示)，去除信号肽序列后的耐热纤维素酶成熟蛋白基因(其核 苷酸序列如SEQ ID NO 3所示，由其编码的耐热纤维素酶成熟蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N04所示)装载在pET-11a (Novagen公司产品，质粒图谱参见图2A,克隆/表达区域的核 酸序列参见图2 C)或pET-15b (Novagen公司产品，质粒图谱参见图2 B，克隆/表达区域 的核酸序列参见图2 D)载体上，得到两个重组质粒pCel5A和pNHCel5A，然后转入到大 肠杆菌E co//'strain BL21-CodonPlus (DE3)-RIL (Stratagene公司产品)宿主中，得到两株 工程菌BLR Cel5A和BU=nNHCel5A。这两种工程菌经发酵培养、纯化得到了大量表达的耐 热纤维素酶，分别为耐热纤维素酶成熟蛋白fnCel5A (其氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示) 和蛋白N-末端加有His，tag的耐热纤维素酶重组蛋白FnNHCel5A (其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示，对应的耐热纤维素酶重组蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO 5所示)。
本发明所涉及的工程菌(BLFnCel5A、 BLFnNHCel5A菌株)的特征与大肠杆菌 (￡sc/jen'cWaco//') BL21菌株基本相同，具体描述如下
(1) 菌体形态特征直杆状，菌体大小为(1."M.5)[jmx2.0 6.0tJm,单个或成对。革兰氏 阴性。以周生鞭毛运动或不运动，可参见图七；
(2) 培养特征兼性厌氧，具有呼吸和发酵两种代谢类型。在营养琼脂上的菌落光滑、 低凸、湿润、灰色、表面有光泽、全缘，在生理盐水中容易分散；
(3) 生理生化特征化能有机营养；氧化酶阴性，乙酸盐可以作为唯一碳源利用，柠檬 酸盐不能利用；葡萄糖和其它糖类发酵产生丙酮酸，在进一步转化为乳酸、乙酸和甲酸，甲酸 部分可被甲酸脱氢酶分解为等量的C02和H2。
进一步，经过基因重组、突变、序列拼接、嵌合等手段获得的衍生体、变异体，其基因中 含有与SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 3或SEQ ID NO 5所示的核苷酸序列有60%以上的同源 性，进一步优选至少为80。/。同源性，更优选至少为90%同源性，甚至更优选至少为95%的同 源性。
进一步，经过分子生物学、基因工程等手段获得的衍生蛋白、变异体蛋白，其氨基酸序列 与SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4或SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列有60%以上的同源性， 进一步优选至少为80%同源性，更优选至少为90%同源性，甚至更优选至少为95%的同源性。
如氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示的耐热纤维素酶重组蛋白与氨基酸序列如SEQ ID NO 4所示的耐热纤维素酶成熟蛋白具有93%的同源性。
我们所获得的耐热纤维素酶FnCel5A、 R NHCel5A ( FnNHCel5A具备与FnCel5A相同 的性质，只是活力稍稍低一些)，能在高温条件(70~80°C)下高效催化反应，而且酶的稳定
性非常好，运用到生产中，有储运成本低、加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低等 优点。同时，f/ Cel5A、 F/ NHCel5A是具有单一内切酶活性的耐热纤维素酶，在纤维素加工 领域具有广泛的应用。
另外，该重组耐热纤维素酶在很多领域也都具有非常可观的应用潜力。例如可以应用 到水解植物来源的纤维素，将纤维素转化成可供发酵的糖类，或者转化成燃料乙醇等有价值的 化工产品。也可以将该重组耐热纤维素酶，应用到洗涤剂、废水处理、动物饲料等方面，或者 应用在纺织工业、再生纸生产、植物有效成分提取、果汁加工等工业中。


图1: PCR产物电泳图2: pET-11a与pET-15b质粒结构示意图； 图3:重组质粒pCel5A构建过程； 图4:重组质粒pNHCel5A构建过程；
图5: DNA电泳图6:编码FnCel5A的基因DNA测序结果； 图7:工程菌BLFnCel5A菌体形态； 图8:耐热纤维素酶SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳带； 图9:耐热纤维素酶FnCel5A最适催化反应温度曲线； 图10:耐热纤维素酶FnCel5A最适催化反应pH值曲线； 图11:耐热纤维素酶F/ Cel5A在70'C下热稳定性曲线； 图12:耐热纤维素酶FnCel5A在75'C下热稳定性曲线； 图13:耐热纤维素酶FnCel5A在80'C下热稳定性曲线。
如图1所示，泳道1为DL2000DNA Marker (购自TaKaRa生物公司)电泳结果，泳道 2为FnCel5A成熟蛋白序列基因扩增产物电泳结果；
如图2所示，其中A图为pET-11a质粒图谱；B图为pET-15b质粒图谱；C图为pET-11a 质粒中克隆/表达区域核酸序列示意图；D图为pET-15b质粒中克隆/表达区域核酸序列示意图。
如图5所示，泳道1代表质粒载体pET-11a线形DNA形式与编码FnCel5A的基因DNA 片断(约1kb)的电泳结果；泳道2代表质粒载体pET-15b线形DNA形式与编码R Cel5A 的基因DNA片断(约1kb)的电泳结果；泳道3代表DL2000 DNA Marker (Takara公司产 品)的电泳结果，作为一个标准的谱来对比衡量一同电泳的DNA的大小。
如图6所示，其中A为R Cel5A的基因5'-端正向测序结果，B为FnCel5A的基因3'-端 反向测序结果；
如图8所示,泳道1代表工程菌BLFnCel5A菌体破碎后的上清液，泳道2代表BLFnCel5A 菌体破碎后上清液60°C 10 min处理后的沉淀，泳道3代表泳道1样品6CTC 10 min处理后的 上清液，泳道4代表F/iNHCel5A经过Ni-NTA亲和层析后的蛋白带，泳道5代表FnCel5A
经过离子交换层析后的蛋白带。
具体实施方式
实施例1:
1、嗜热细菌(Fenz/ctobacten'um noctost;m strain Rt17-B1)的培养
嗜热细菌(多节闪烁杆菌，FeAv/cto/ acte"'t/mAJOctoswr7Rt17-B1)的来源DSM5306<
ATCC 35602 < B.K.C. Patel, Rt17-B1. Hot spring; New Zealand
培养条件是DSMZ Medium 144培养基，70°C，厌氧培养，具体操作为.-
根据DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH
German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)提供的培养基配方，配制细菌培养
DSMZ 144号培养基高温厌氧细菌培养基
NH4CI NaCI
MgCI2'6H20
KH2P04
K2HP04
微量元素溶液(详见下文)
FeS04*7H20
刃天青(Resazurin)
维生素溶液(详见下文)
Na2S'9H20
酵母抽提物
水解蛋白胨
葡萄糖
补加蒸馏水至1000.000 ml 培养基在100%氮气中配置，
0.900 g 0.900 g
0.400 g
0.750 g
1.500g 9.000 ml 3.000 mg 1 ■ mg 5,000 ml 1.000 g
3.000 g
10.000 g
5.000 g
葡萄糖单独灭菌，最终pH值7.2 ~ 7.4。
微量元素溶液:
次氮基三乙酸
12.800 g
FeCI2'4H20 0.200 g
MnCI2'4H20 O，g
CoCI2'6H20 0.170 g
CaCI2'2H20 0.100 g
ZnCI2 0.100 g
CuCI2 0,020 g
H3B03 0,010 g
Na2Mo04'2H20 0,010 g
NiCI2'6H20 0.026 g
NaCI 1.000 g
Na2Se03'5H20 0.020 g
补加蒸馏水至1000.0 ml
最初配制时，溶解次氮基三乙酸，并用KOH调节至pH 6.5。
维生素溶液
生物素(维生素H) 2.000 mg
叶酸(维生素B ) 2.000 mg
维生素Be 10.000 mg
硫胺(维生素B1) *21"120 5.000 mg
核黄素 5.000 mg
烟酸(尼克酸) 5.000 mg
D-泛酸钙 5.000 mg
维生素B^ 0.100 mg
p-氨基苯酸 5.000 mg
硫辛酸 5.000 mg
补加蒸馏水至1000.0 ml
将来自DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)的多节闪烁杆菌(Fen//'cto/)acterfi//r7 nodost/m Rt17-B1 DSMZ编号DSM 5306)，参照文献(Patel BK, et al. Fervidobacterium nodosum new-genus new-species, a new chemoorganotrophic caldoactive anaerobic bacterium. Arch. Microbiol. 141:63-69， 1985.)进行培养。培养过程可以概括为
(1)按DSMZ提供的配方，配制DSMZ 144号培养基(高温厌氧细菌培养基)，培养基 在115 °C、 15 min的条件下进行高温蒸汽灭菌处理；
(2〉按V/V-200:1向培养基中加入10%Na2S溶液；
(3) 向培养基中通入N2 (3 min以上)；
(4) 按1%的接菌量，接入Fe/v/'ctabacten'i/mnoctosum Rt17-B1种子菌液，然后密闭；
(5) 在6(TC条件下培养，直至达到理想的菌体密度。
2、 基因组的提取
将上面获得的多节闪烁杆菌(FeAV/'oto/jacte〃u/77 noctosw/w Rt17-B1 DSMZ编号DSM 5306)的细菌培养物于10,000 rpm离心l分钟，倒尽上清液，收集菌体沉淀，用细菌基因组 DNA提取试剂盒(本例中使用的是TIANGEN公司生产的细菌基因组DNA提取试剂盒，the bacteria genomic DNA purification kit),按照产品说明书提取基因组DNA，备用。
3、 目的基因的钓取 (1)引物设计
嗜热细菌Fe/vWobacten'mn noctosu/n strain Rt17-B1的全基因测序工程己经完成 (Project ID: 16719 at US DOE Joint Genome Institute [Complete]),己在因特网上公布 (Genbank编号CP00071)。通过网上数据库分析，在其基因组中含有几段可能编码纤维素 酶的基因。我们选择了其中一个可能的纤维素酶基因(序列区域是1698601~1699632,具体 序列参见序列表SEQ ID N01，在本专利中，我们称之为耐热纤维素酶前体蛋白基因)作为 研究对象。
SEQ ID NO 1基因序列预计编码343个氨基酸，其编码的耐热纤维素酶前体蛋白的氨基 酸序列如SEQ ID NO 2所示，通过SignalP 3.0软件网上分析服务 (httD:〃www.cbs.dtu.dk/services/SianalPA,预测蛋白N-^的24个氨基酸是信号肽序列，去除 这个信号肽序列后得到耐热纤维素酶成熟蛋白，它的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0 4所示， 对应编码这个耐热纤维素酶成熟蛋白的基因序列如序列表SEQ ID NO 3所示。
通过Pfam网站数据分析服务(^1 :/尔{301」3!16113.0「9)，预测这段基因编码是一个属于糖 基水解酶家族5 (glycosyl hydrolase family 5)成员的纤维素酶。根据Henrissat提出的糖基 水解酶命名法，我们把该酶的成熟蛋白命名为FnCel5A (氨基酸序列如序列表SEQ ID NO 4 所示)，把成熟蛋白N-端加有His*Tag的重组蛋白定名为NHFnCel5A (氨基酸序列如序列表 SEQIDN0 6所示)Cel表明该基因编码的水解酶的最适底物是纤维素，"5"表示该基因编码 的水解酶是属于糖基水解酶第5家族，"A"表示该基因是本实验从Fe/v/cto/)acten》m nodosum 中获得的第一个属于糖基水解酶第5家族的纤维素酶，Fn是Fen//'ctobacten'um noctostm 的 简写，NH表明在酶蛋白N-端加有His'Tag小肽。
根据该基因的序列特点，以及序列对应的表达蛋白的信号肽序列和成熟蛋白序列特点，我 们设计了两段带有限制性酶切位点的引物(上游引物CAG CGC CAT ATG GAC CAA AGT GTGAGTAA,划线部分为A/cte I酶切位点；下游引物GAC GTC GGA TCC TTA TTT TCC
AAG TGC Ag,划线部分为SamH I酶切位点)，委托大连TaKaRa生物公司合成这一对引物 用于钓取耐热纤维素酶成熟蛋白基因(该基因编码的耐热纤维素酶成熟蛋白的氨基酸序列参见 SEQIDN0 4)，钓取目的基因釆取PCR扩增的方法。 (2)目的基因(SEQ ID NO 3)的PCR扩增和纯化
在50pl Pfu或TaKaRa Ex Taq反应体系中(配制方法参见试剂说明书)，以上文所述的 F. noctosum Rt17-B1基因组DNA为模板，上游引物CAG CGC CATATG GAC CAA AGT GTG AGT AA和下游引物GAC GTC GGATCC TTA TTT TCC AAG TGC Ag两条引物作为扩增引 物，通过PCR的方法进行扩增。
PCR反应条件预变性95'C 10分钟热循环条件是95°C 1分钟，60'C 1分钟，72'C 1 分钟，反应进行30个循环；最后在72'C保温延伸10分钟。按照这样的实验设计，通过PCR 扩增的该基因全长是960bp,用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，结果如图1中泳道2 所示。证实得到目的基因的DNA扩增产物后，使用PCR产物纯化试剂盒(购自杭州维特捷 公司的PCR清洁试剂盒)对扩增产物进行DNA纯化，.20'C保存，备用。
4、重组质粒的构建
(1)表达成熟耐热纤维素酶蛋白的pCel5A重组质粒的构建(图3)
将PCR扩增后的耐热纤维素酶基因产物DNA纯化，纯化后的DNA依次用限制性内切酶 8an7HI和A/ctel进行酶切反应，实验操作参照TaKaRa产品说明书。酶切完毕，加入适量载 样液(6X上样缓冲液，30mMEDTA、 36%甘油、0.05%二甲苯青、0.05%溴酚蓝，与核酸溶 液按1: 5混合)，在1.0%的琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝胶回收试剂盒(购自杭州维特 捷公司DNA凝胶回收试剂盒)回收酶切后的DNA片段，为编码耐热纤维素酶基因的DNA片 断。
应用同样的方法酶切pET-11a质粒，然后用碱性磷酸酶(CAP)处理质粒，在0.8%琼脂 糖凝胶中检测线性质粒，并提纯(应用DNA凝胶回收试剂盒(购自杭州维特捷公司DNA凝 胶回收试剂盒)回收酶切后的DNA片段)酶切后的质粒。
将上述回收的编码耐热纤维素酶基因的DNA片断和酶切后的pET-11a质粒混合，在16'C 应用T4 DNA连接酶进行连接反应。将连接后的质粒转入大肠杆菌XL菌株中，在含有 50-100mg/L抗生素氨苄青霉素(Amp)的固体琼脂平皿上进行涂布，37'C静止培养12小时 左右，直至出现阳性克隆的单菌落，选取单克隆细胞菌落，在加有氨苄青霉素抗生素的液体培 养基中振荡培养过夜。用质粒提取试剂盒提出质粒，再用限制性内切酶Wcte I和8amH I水解 质粒，然后经琼脂糖电泳验证，结果参见图5所示，从图中泳道1的结果我们可以看到，经 过双酶切后，重组质粒重新被酶切成原pET-11a质粒和编码F/ Cel5A的基因DNA，其结果与 图1泳道2的结果相同，证明提取的质粒是我们所需的、连接有耐热纤维素酶基因片段和表 达载体的质粒。对耐热纤维素酶基因进行测序，结果与根据SEQ ID NO 3设计的结果一致， 证明得到了含有耐热纤维素酶目的基因的重组质粒pCel5A。
(2) 表达N-端加有His，Tag肽段的耐热纤维素酶重组蛋白的pNHCel5A重组质粒的构建(图4) 操作基本与上面的pCel5A构建过程相同，只是使用的载体由pET-11a换成了 pET-15b。
(3) 测序
构建后的重组质粒pCel5A和pNHCel5A,委托上海生工生物公司进行序列测定。在对 本发明相应基因进行测序时，该所用的测序仪器为ABI PRISM 3730 ,测序试剂为 BigDye terminator v3丄ABI公司对仪器的性能说明为正常情况下，除了开始约10至30 个碱基，在650bp以内可以达到98.5%以上的准确率， 一般只有进行正反链(基因正向和反 向，或者称基因的5'-端和3'-端)同时测序，在两个序列完全吻合的情况下，才能确保所得序 列100%可靠。
如图2C和图2D，对pET-11a和pET-15b质粒中克隆/表达区域核酸序列的示意，耐热 纤维素酶基因正向插入到A/cte I和8a/77H I酶切位点之间，可以应用引物T7 promoter primer #69348-3对插入基因的5'-端进行扩增、测序反应，对插入的耐热纤维素酶基因的5'-端进行 正向测序，得到基因的正向序列测序结果；应用引物T7 terminator primer #69337-3对插入 基因的3'-端进行扩增、测序反应，对插入的耐热纤维素酶基因的3'-端进行反向测序，得到基 因的反向序列测序结果。测序结果如图6所示，其中图6 (A)是从基因5'-端正向测序得到的 结果，应用分析软件 Chromas 1.62 ( Technelysium Pty Ltd ， http:〃www.technelvsium.com.au/chromas.html)査看测序结果，图6 (A)所示的测序谱图 是从基因的启动密码子ATG开始的，也就是基因插入的酶切位点A/ofe I所识别的序列CATATG 的后3个核苷酸序列开始的，得到的基因5'-端核苷酸正向序列如图6A所示。图6 (B)是从 基因3'-端反向测序得到的结果，所示的测序谱图是从基因的终止密码子TAA的互补序列TTA 开始的，得到的核苷酸序列如图6B所示，这是基因的反向序列，借助序列分析软件，例如 FastPCR Professional (Primer Digital Ltd),按照核苷酸碱基互补原则，得到基因3'-端序列 的正向阅读结果。双向测序的结果经过拼接，得到基因序列与SEQIDN0 3序列一致，SEQ IDN0 3序列是源自SEQIDN01序列并且编码F/ Cel5A成熟蛋白的序列。这样的结果就证 实了两个重组质粒所含的基因序列，可以分别表达SEQ ID NO 4所述氨基酸序列的成熟蛋白 FnCel5A，以及该成熟蛋白N-端加有His4ag肽段的重组蛋白F/ NHCel5A (其氨基酸序列表 如SEQ ID N06所示)。
(4) 重组质粒pCel5A和pNHCel5A所编码表达的耐热纤维素酶蛋白的异同。
将耐热纤维素酶成熟蛋白基因序列SEQ ID NO 3，分别插入到pET-11a和pET-15b的克 隆/表达区域(参见图2C、D)中的A/ctel和8amH l两个酶切位点之间，构成了重组质粒pCel5A 和pNHCel5A。
参照pET-11a和pET-15b的克隆/表达区域序列结构特点，表达蛋白的序列将是rbs后面 第一个甲硫氨酸(Met,对应密码子为atg)到SEQ ID NO 3中的最后一个终止密码子(tea)。 这样，pCel5A可以编码表达的蛋白是FnCel5A成熟蛋白，氨基酸序列如SEQ ID N0 4所示； 而pNHCel5A可以编码表达的重组蛋白，是SEQ ID NO 4编码的成熟蛋白f"Cel5A的N-端加有His'Tag肽段的重组蛋白FnNHCel5A，其氨基酸序列如SEQ ID NO 6所示。
F/ Cel5A和F/ NHCel5A两种耐热纤维素酶的基因序列基本相同，不同的是为了方便应用 镍亲和层析(Ni-NTAAgarose)对重组蛋白进行分离、纯化，FnNHCel5A的N-端加有与镍亲 和层析材料有亲和作用的His，Tag肽段。两种耐热纤维素酶的蛋白序列有93%同源性，都为 耐热纤维素酶，两者的性质基本相同。进一步的，按照理论预测，与FnCel5A序列(SEQ ID N04)有95。/o以上、90%以上、80%以上、甚至60%以上同源性的蛋白，也有着与FrtCel5A 相同或相近的纤维素酶的性质。
5、重组质粒在宿主细菌(&co//'sfra/A7BL21-CodonPlus(DE3)-RIL)中的表达
将含有目的基因的重组质粒转入宿主菌中，宿主菌首选大肠杆菌(& co/Z)，最佳的选择 是￡. co/,' sfra//7 BL 21-CodonPlus (DE3)-RIL。转化有目的基因的￡. co// s的/力BL 21-CodonPlus (DE3)-RIL感受态细胞，在含有氨苄青霉素的固体平皿上进行涂布筛选，挑取 阳性转化菌，置于5ml含氨苄青霉素的液体培养基中，液体培养基的选择可以是实验室经常 使用的2YT、 LB培养基，37'C振荡培养过夜；次日，按1 %的接种量取0.1ml饱和菌液加入 到10ml新鲜液体培养基中，37'C继续振荡培养直到A咖为0.6 1时，加入异丙基硫代p-D-半乳糖苷(IPTG),终浓度为1 mmol/L， 28。C振荡培养12-16小时，离心(10,000 rpm,1 min) 收集菌体，进行15。/oSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，得到的电泳图显示在目的分子量附近有蛋白 带，而且蛋白含量非常大同时，菌体沉淀用5-20倍体积的蒸馏水重悬，超声波破碎后，得 到的菌体破碎液(内含表达的蛋白)，以羧甲基纤维素钠盐(CMC)作为底物，将的5^11% (w/v) CMC置于水浴锅中预热15min。加入5yl酶液(即菌体破碎液)，与底物充分混匀， 保温5min;立即将样品放入冰水浴中4'C 12000 rpm离心1min,取1ml DNS试剂加入500pl 反应液；沸水浴5min,冷水冷却至室温。每管加蒸馏水稀释到10ml，读取As2Q的吸光度值， 根据葡萄糖标准曲线计算^^应体系中产生的葡萄糖浓度。通过检测反应体系中一定时间内生成 的还原糖的量来分析表达蛋白的纤维素酶活力。还原糖的生成量采用DNS法进行测量，实验 操作参照文献(Miller Gl_ (1959) Use of dinitrosalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar, a'otechno/ B/oeng Symp 5:193-219)。酶蛋白浓度的测定采用Bradford检测 法。经过测定，两种重组菌株都可以大量表达具有纤维素酶活力的蛋白，说明得到了两种可以
表达纤维素酶蛋白的重组工程菌菌株，分别是宿主菌中载有pCel5A重组质粒的工程菌 BLFnCel5A，可以表达耐热纤维素酶成熟蛋白(定名为FnCel5A);还有宿主菌中载有 pNHCel5A重组质粒的工程菌BLFnNHCel5A，可以表达N-端加有His'Tag肽段的重组耐热 纤维素酶蛋白(F/ NHCel5A)。
挑取本发明所涉及的工程菌少许，置于5 ml含氨苄青霉素的液体培养基中，液体培养基 的选择可以是实验室经常使用的2YT、 LB培养基，也可以是工业发酵用培养基(如麦芽汁培 养基、玉米浆培养基等),37'C振荡培养过夜;次日，按1 %的接种量将饱和菌液加入到100-200 ml新鲜液体培养基中，37'C继续振荡培养直到A6oo为0.6 1时，加入异丙基硫代P-D-半乳 糖苷(IPTG)，终浓度为1 mmol/L， 28'C振荡培养12-16小时，离心(6,000 rpm, 4'C, 15 min) 收集菌体。表达的耐热纤维素酶蛋白以可溶蛋白的形式存在于菌体细胞中，破碎细胞即可得到 耐热纤维素酶的粗酶产物。
6、 工程菌发酵及目的蛋白的诱导表达
挑取工程菌少许，置于50ml含氨苄青霉素的液体培养基中，液体培养基的选择可以是实 验室经常使用的2xYT (配制每升培养基，应在900ml去离子水中加入16g胰化蛋白胨、10g 酵母提取物、5gNaCI，用5mol:1NaOH (约0.2ml)调pH值至7.0，用去离子水定容至1L， 在1.05kg/crr^高压下蒸汽灭菌20min)、 LB (配制每升培养基，应在950ml去离子水中加入 10g胰化蛋白胨、5g酵母提取物、10gNaCI，用5mo卜L"NaOH (约0.2ml)调pH值至7.0, 用去离子水定容至1L，在1.05kg/crT^高压下蒸汽灭菌20min)培养基，也可以是工业发酵用 培养基(如麦芽汁培养基、玉米浆培养基等)，37'C振荡培养过夜，制成种子液；将初步放大 的种子液以1 %的比例接入2 L的液体培养基中，37 'C 180 rpm/min条件下空气摇床培养， 待菌体生长到对数期时(A咖为0.6 1)加入IPTG至终浓度达到1 mM，并降低摇床的温度 为28°C ，对菌体进行诱导使其产生大量的目的蛋白，同时避免产生酶蛋白的包涵体,培养12-16 小时后即可收获菌体。
7、 其他耐热纤维素酶的表达方法
除了用上述的方法表达耐热纤维素酶外，也可以采取其他生物技术手段进行表达。
可以通过将编码耐热纤维素酶蛋白的基因整合至宿主染色体上. 一般认为整合后DNA序 列可以在细胞中更加稳定地维持。
宿主细胞不只局限于大肠杆菌细胞，也可以将耐热纤维素酶的基因载入到其他类型的宿主 细胞中，来表达纤维素酶基因。宿主细胞可以是高等生物，例如动物、植物的细胞'但优选其 为微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适当细菌的例子是革兰氏阳性细菌，如枯草芽胞杆菌，乳酸杆菌，地衣芽胞杆菌，短芽
孢杆菌，嗜热脂肪芽胞杆菌，嗜碱芽胞杆菌，解淀粉芽胞杆菌，凝结芽胞杆菌，环状芽胞杆菌， 灿烂芽胞杆菌，巨大芽胞杆菌，苏云金芽胞杆菌，浅青紫链霉菌或鼠灰链霉菌等；或者是革兰 氏阴性细菌，如大肠埃希氏菌，假单孢菌等。通过例如原生质体转化，或通过以本身己知的方 式使用感受态细胞即可实现细菌的转化。
酵母细胞可以有利地选自糖酵母属或裂殖酵母属的种，例如酿酒酵母；也可以选择毕赤酵 母、假丝酵母等酵母细胞。
真菌可以是属于曲霉属的种，例如米曲霉或黑曲霉；也可以是木霉属的种，例如里氏木霉。 上述生物体或细胞，载有本发明涉及的耐热纤维素酶基因后，同样也可以表达、产生本发 明所涉及的耐热纤维素酶蛋白；这样的生物体就成为了能表达、生产耐热纤维素酶的基因工程 菌、基因工程真核细胞、基因工程原核细胞、基因工程动物、基因工程植物、基因工程微生物 等。
实施例2:耐热纤维素酶的纯化流程图
(1) 粗酶液的获得
将上面描述的用IPTG诱导表达，培养12-16小时后的工程菌培养液6,000 rpm离心15 分钟，菌体沉淀用5-20倍体积的蒸馏水重悬，超声波破碎；将破碎液于60'C加热处理10-30 分钟，离心除去变性的大肠杆菌杂蛋白以及细胞碎片(12,000 rpm, 5 min),收集上清得粗酶 液。对应样品应用SDS-PAGE (15%)蛋白电泳进行检测，结构如附8中泳道1~3所 示泳道1是工程菌BLFnCel5A菌体破碎后的上清液，在大肠杆菌BL21菌体蛋白的背景下， 在与理论计算的FnCel5A蛋白质同等分子量大小的位置上，有一条蛋白含量非常大的蛋白电 泳带，这就是大量表达的目的蛋白FnCel5A;泳道2是BLFnCel5A菌体破碎后的上清液经过 60'C、 10min处理后的沉淀，可以看到除了耐热纤维素酶FnCel5A以外的其他绝大多数的大 肠杆菌BL21菌体内蛋白的电泳带，这说明通过60'C、 10min的热处理以后，菌体破碎液中 除了耐热纤维素酶FnCel5A以外，其他绝大多数杂蛋白通过热沉淀被除去了；泳道3是工程 菌BLFnCel5A菌体破碎后的上清液经过6(TC、 10min处理后，除去沉淀部分后的上清液， 可以看到通过热处理，以沉淀的形式除去了大量的杂蛋白后，目的蛋白即耐热纤维素酶 FnCel5A的含量得到明显的提高，热处理起到了初步纯化蛋白的目的。
(2) 离子交换层析
载有pCel5A质粒的工程菌BLFnCel5A，表达耐热纤维素酶的成熟蛋白(FnCel5A)，应 用离子交换层析(q Sepharose Fast Flow)对耐热纤维素酶进行分离、纯化。应用SDS-PAGE (15%)电泳检测蛋白的纯度，结果如图8中泳道5所示，此时已经基本上看不到其他杂蛋 白的电泳带了，电泳图中只有大量的耐热纤维素酶FnCel5A的电泳带，说明经过分离、纯化 后的耐热纤维素酶FnCel5A蛋白，已经非常纯了，达到了电泳纯的纯度级别。 (2) 亲和柱层析
载有pNHCel5A质粒的工程菌BLFnNHCel5A，可以表达N-末端含有His，Tag的重组蛋 白(R)NHCel5A),应用镍亲和层析(Ni-NTA Agarose)对重组蛋白进行分离、纯化。应用 SDS-PAGE (15%)电泳检测重组蛋白的纯度，结果如图8中泳道4所示。此时已经基本上 看不到其他杂蛋白的电泳带了，电泳图中只有大量的耐热纤维素酶F/7NHCel5A的电泳带，说 明经过分离、纯化后的耐热纤维素酶F/7Cel5A蛋白，已经非常纯了，达到了电泳纯的纯度级 别。
实施例3:重组耐热纤维素酶的性质
本发明涉及到的耐热纤维素酶FnCel5A和FnNHCel5A具有基本相同的性质，但也存在 细微的差别，下面主要以FnCel5A对耐热纤维素酶的性质进行表述
(1) 水解羧甲基纤维素(CMC)的纤维素酶活性
以羧甲基纤维素钠盐(CMC)作为底物，应用本发明的耐热纤维素酶对一定浓度的CMC 水溶液，在一定的理化条件下进行反应， 一定时间后通过检测反应体系中生成的还原糖的量来 分析纤维素酶的活力。还原糖的生成量采用DNS法迸行测量，实验操作参照文献(MillerGL (1959) Use of dinitrasalicyclic acid reagent for determination of reducing sugar. 8/'oe叩Symp 5:193-219)。酶蛋白浓度的测定采用Bradford检测法。
酶活力单位(U)的定义每分钟催化分解底物产生1 pmol还原糖所需的酶量为1U。 酶比活力的定义每mg或每g蛋白质所含的酶活力(U/mg或U/g)。 实验测定本发明所涉及到的纤维素酶，在高温下表现出很高的水解CMC的活力(比活 力在800U/mg以上)，通常认为水解CMC的活力常用于表征内切(3-1，4-葡聚糖酶 (Endo-p-1，4-glucanase, EC 3.2.1.4)活力，所以初步确定本发明所涉及的酶是耐热内切纤维 素酶。
(2) 耐热纤维素酶最适反应温度 反应温度是影响酶催化活力的重要因素，尤其是耐热酶在高温下的反应活力远远高于低
温。以CMC作为酶催化反应底物，我们考察了耐热纤维素酶在pH 7.0的磷酸缓冲液中不同 温度对酶活力的影响。在37'C-95'C的温度范围内测定耐热纤维素酶的比活，结果如图9所示， 当温度达到8(TC时，该酶表现出最大催化活力。
(3) 耐热纤维素酶的最适pH 环境pH值影响酶分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶的催化活力。以
CMC作为底物，测定耐热纤维素酶在pH4-8范围内的比活，以pH为横坐标，相对酶活为纵
坐标作图，结果如图10所示。结果表明，该酶的最适pH为5.8。
(4) 耐热纤维素酶的热稳定性 将纯化的酶溶于pH5.8的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液中，置于70'C、 75'C和8(TC下保温一
定时间，然后测定其残留的酶活力，结果分别如图11、图12和图13所示。结果表明，在开 始保温的阶段里，酶活力都有所提高，这可能因为嗜热酶是使用工程菌在中、低温条件下表达 的，提高温度保温一段时间后有利于嗜热酶的再折叠和激活；耐热纤维素酶在70'C、 75'C保 温7天后损失的活力很少，8CTC保温6小时内活力降低的不多，这说明该酶的热稳定性较高。
(5) 金属离子对酶活力的影响
测试了 9种无机离子(Zn2+、 Mg2+、 Co2+、 Ni2+、 Ca2+、 Ba2+、 Na+、 NH4+、 Mn2+ )在 浓度分别为5 mmol/L时对酶活力的影响，测活温度是80'C，使用的缓冲液是pH5.8柠檬酸 盐-磷酸盐缓冲液。以不加这些金属离子的对照酶液的比活力作为100%，加入金属离子后的 相对比活力列于下面表1中，结果表明Ca2+、 NH4+、 Mn&对耐热纤维素酶有轻微的激活作用， 其他离子对酶活力有抑制作用，Z一+对酶活力有很显著的抑制作用。
表1.金属离子对酶活力的影响
添加试剂反应浓度相对活力(％)标准偏差
无-1001.62
5mM10483.7
CaClj5mM102.624.02
NH4C15mM100.223.45
MgCy5mM95.83.6
BaOj5mM93.292.21
NaCl5mM93.296.5
叫045mM87.473.21
5mM79.084.85
NiCl25iriM72.662.7
ZnC^5mM3.130.76
Triston-1005mM98.84.7
EDTA,0.25。/。 ( WV )75.591.61
SDS0.25% ( W/V)2.42.4 附本发明所涉及耐热纤维素酶基因核苷酸序列表和由该基因表达的耐热纤维素酶氨基酸序列表 (1) SEQ ID NO. 1 耐热纤维素酶前体蛋白基因核苷酸序列表 <110>吉林大学
<120>耐热纤维素酶基因、重组工程菌、耐热纤维素酶及应用
<160> 6
<210〉 1
<211〉 1032 <212〉腿
<213〉真细菌(Fervidobacterium nodosum)
<220〉
<221> CDS
<222> (1)…(1032)
<400> 1
ATGAAGAAAAAAATATTGAATGTTTTGCTTGGTTTTGCTTTAATTTTT
MetLysLysLyslieLeuAsnValLeuLeuGlyPheAlaLeuliePhe
151015
CTTATGAATGGTAATTGCAAAGCTGACCAAAGTGTGAGTAATGTTGAT
LeuMetAsnGlyAsnCysLysAlaAspGinSerValSerAsnValAsp
202530AAAAGTAGTGCTTTTGAATATAATAAAATGATTGGACATGGGATAAAC
LysSerSerAlaPheGluTyrAsnLysMetlieGlyHisGlylieAsn
354045
ATGGGGAATGCTTTAGAAGCCCCTGTAGAAGGTTCTTGGGGAGTTTAT
MetGlyAsnAlaLeuGluAlaProValGluGlySerTrpGlyValTyr
505560ATTGAGGATGAATATTTTAAAATAATAAAAGAAAGAGGCTTTGATTCT
lieGluAspGluTyrPhetyslielieLysGluArgGlyPheAspSer
65707580
GTAAGGATTCCTATCAGATGGTCTGCACACATTTCTGAGAAGTATCCT
ValArglieProlieArgTrpSerAlaHislieSerGluLysTyrPro
859095
TACGAAATTGATAAATTCTTTTTAGACAGAGTGAAACACGTTGTCGAT
TyrGlulieAspLysPhePheLeuAspArgValLysHisValValAsp
100105110
GTCGCGTTGAAGAATGATTTGGTTGTAATAATCAATTGTCATCATTTC
ValAlaLeuLysAsnAspLeuValValIelieAsnCysHisHisPhe
105120125
GAGGAATTATATCAAGCCCCTGATAAATATGGTCCTGTATTAGTTGAA
GluGluLeuTyrGinAlaProAspLysTyrGlyProValLeuValGlu
130135140
ATTTGGAAACAAGTTGCCCAAGCTTTTAAAGATTATCCAGACAAATTG
lieTrpLysGinValAlaGinAlaPheLysAspTyrProAsplysLeu
145150155160
TTCTTTGAAATATTTAACGAACCAGCTCAAAATTTGACTCCGACTAAG
PhePheGluliePheAsnGluProAlaGinAsnLeuThrProThrLys
165170175
TGGAATGAGCTTTATCCAAAAGTTTTAGGTGAA'ATTCGAAAAACGAAT
TrpAsnGluLeuTyrProLysValLeuGlyGlulieArgLysThrAsn
180185190
CCATCAAGAATTGTAATTATAGACGTTCCAAATTGGTCGAACTACAGC
ProSerArglieVallielieAspValProAsnTrpSerAsnTyrSer
195200205
TACGTAAGAGAGTTAAAGCTTGTTGATGATAAAAATATAATTGTTTCA
TyrValArgGluLeuLysLeuValAspAspLysAsnlielieValSer
210215220
TTCCATTATTACGAACCTTTTAATTTTACTCACCAAGGTGCTGAATGG
PheHisTyrTyrGluProPheAsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrp
225230235240
GTTAGTCCAACGCTTCCAATTGGCGTTAAATGGGAAGGAAAAGATTGG
ValSerProThrLeuProlieGlyValLysTrpGluGlyLysAspTrp
245250255
GAAGTGGAACAGATTAGAAATCATTTCAAATATGTTAGTGAGTGGGCA
GluValGluGinlieArgAsnHisPheLysTyrValSerGluTrpAla
260265270
AAGAAAAACAATGTTCCGATATTTTTAGGTGAGTTTGGCGCATATTCA
LysLysAsnAsnValProliePheLeuGlyGluPheGlyAlaTyrSer
275280285
AAAGCAGATATGGAATCACGGGTGAAATGGACCAAAACTGTTAGGAGA
LysAlaAspMetGluSerArgValLysTrpThrLysThrValArgArg
290295300
ATCGCTGAAGAATTCGGATTTTCGCTTGCATATTGGGAATTTTGTGCG
lieAlaGluGluPheGlyPheSerLeuAlaTyrTrpGluPheCysAla305310315
GGG TTCGGGTTGTACGATAGATGGACA AAA ACA TGG ATAGAACCT
Gly PheGlyLeuTyrAspArgTrpThr Lys Thr Trp lieGluPro
325330335
ACT ACCTCTGCACTTGGAAAATAA(1032)
Thr ThrSerAlaLeuGlyLys
340
320
(2) SEQ ID NO. 2 耐热纤维素酶前体蛋白氨基酸序列表
<210〉 2 <211> 343 <212> PRT
<213>真细菌(Fervidobacterium nodosum) <220>
<222> (l)... (343) <400> 2
MetLysLysLyslieLeuAsnVal LeuLeuGlyPheAlaLeuliePhe
151015
LeuMetAsnGly 20AsnCysLysAls Asp 25GinSerValSerAsn 30ValAsp
LysSerSer 35AlaPheGluTyrAsn Lys 40MetlieGlyHis 45GlylieAsn
MetGly 50AsnAlaLeuGluAla 55Pro ValGluGlySer 60TrpGlyValTyr
lieGluAspGluTyrPheLyslie lieLysGluArgGlyPheAspSer
65707580
ValArglieProlieArgTrpSer AlaHislieSerGluLysTyrPro
859095
TyrGlulieAsp 100LysPhePheLeu Asp 105ArgValLysHisVal 110ValAsp
ValAlaLeuLysAsnAspLeuVal VallielieAsnCysHisHisPhe
105120125
GluGlu 130LeuTyrGinAlaPro 135Asp LysTyrGlyPro 140ValLeuValGlu
lieTrpLysGinValAlaGinAla PheLysAspTyrProAspLysLeu
145150155160
PhePheGluliePhe 165AsnGluPro AlaGin 170AsnLeuThrProThr 175Lys
TrpAsnGluLeu 180TyrProLysVal Leu 185GlyGlulieArgLys 190ThrAsn
ProSerArg 195lieVallielieAsp V3I 200ProAsnTrpSer 205AsnTyrSer
TyrValArgGluLeuLysLeuV3I AspAspLysAsnlielieValSer
210215220
PheHisTyrTyrGluProPheAsn PheThrHisGinGlyAlaGluTrp
225230235240
ValSerProThrLeu 245ProlieGly ValLys 250TrpGluGlyLysAsp 255Trp
GluValGluGin 260lieArgAsnHis Phe 265LysTyrValSerGlu 270TrpAla
LysLysAsnAsnValProliePhe LeuGlyGluPheGlyAlaTyrSer
275280285
LysAlaAspMetGluSerArgVal LysTrpThrLysThrValArgArg
290295300
lieAlaGluGluPheGlyPheSer LysAlaTyrTrpGluPheCysAla
305310315320
GlyPheGlyLeuTyrAspArgTrp ThrLysThrTrplieGluProLeu
325330335
ThrThrSerAla 340LeuGlyLys*
(3) SEQ ID NO. 3 耐热纤维素酶成熟蛋白基因核苷酸序列表
<210> 3 <211> 963 <212> DNA
<213>真细菌(Fervidobacteri咖nodosum)
<220〉
<221〉 CDS
<222> (l)... (963)
<400> 3
ATG GAC CAA AGT GTG AGT AAT GTT GAT AAA AGT AGT GCT TTT GAA TAT
MetAspGinSerValSerAsnValAspLysSerSerAla Phe GluTyr
151015AATAAAATGATTGGACATGGGATAAACATGGGGAATGCT TTA GAAGCC
AsnLysMetlieGlyHisGlylieAsnMetGlyAsnAla Leu GluAla
202530
CCTGTAGAAGGTTCTTGGGGAGTTTATATTGAGGATGAA TAT TTTAAA
ProValGluGlySerTrpGlyValTyrlieGluAspGlu Tyr PheLys
354045ATAATAAAAGAAAGAGGCTTTGATTCTGTAAGGATTCCT ATC AGATGG
lielieLysGluArgGlyPheAspSerValArgliePro lie ArgTrp
505560TCTGCACACATTTCTGAGAAGTATCCTTACGAAATTGAT AAA TTCTTT
SerAlaHislieSerGlu匕ysTyrProTyrGlulieAsp Lys PhePhe
65707580
TTAGACAGAGTGAAACACGTTGTCGATGTCGCGTTGAAG AAT GATTTG
LeuAspArgValLysHisValValAspValAlaLeuLys Asn AspLeu
859095
GTTGTAATAATCAATTGTCATCATTTCGAGGAATTATAT CAA GCCCCT
ValVallielieAsnCysHisHisPheGluGluLeuTyr Gin AlaPro
100105110
GATAAATATGGTCCTGTATTAGTTGAAATTTGGAAACAA GTT GCCCAA
AspLysTyrGlyProValLeuValGlulieTrpLysGin Val AlaGin
105120125
GCTTTTAAAGATTATCCAGACAAATTGTTCTTTGAAATA TTT AACGAA
AlaPheLysAspTyrProAspLysLeuPhePheGlulie Phe AsnGlu
130135140
CCAGCTCAAAATTTGACTCCGACTAAGTGGAATGAGCTT TAT CCAAAA
ProAlaGinAsnLeuThrProThrLysTrpAsnGluLeu Tyr ProLys
145150155160
GTTTTAGGTGAAATTCGAAAAACGAATCCATCAAGAATT GTA ATTATA
ValLeuGlyGlulieArgLysThrAsnProSerArglie Val lielie
165170175
GACGTTCCAAATTGGTCGAACTACAGCTACGTAAGAGAG TTA AAGCTT
AspValProAsnTrpSerAsnTyrSerTyrValArgGlu Leu LysLeu
180185190
GTTGATGATAAAAATATAATTGTTTCATTCCATTATTAC GAA CCTTTT
ValAspAspLysAsnlielieValSerPheHisTyrTyr Glu ProPhe
195200205
AATTTTACTCACCAAGGTGCTGAATGGGTTAGTCCAACG CTT CCAATT
AsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrpValSerProThr Leu Prolie
210215220
GGCGTTAAATGGGAAGGAAAAGATTGGGAAGTGGAACAG ATT AGAAAT
GlyValLysTrpGluGlyLysAspTrpGluValGluGin lie ArgAsn
225230235240
CATTTCAAATATGTTAGTGAGTGGGCAAAGAAAAACAAT GTT CCGATA
HisPheLysTyrValSerGluTrpAlaLysLysAsnAsn Val Prolie
245250255
TTTTTAGGTGAGTTTGGCGCATATTCAAAAGCAGATATG GAA TCACGG
PheLeuGlyGluPheGlyAlaTyrSerLysAlaAspMet Glu SerArg
260265270
GTGAAATGGACCAAAACTGTTAGGAGAATCGCTGAAGAA TTC GGATTT
ValLysTrpThrLysThrValArgArglieAlaGluGlu Phe GlyPhe
275280285
TCGCTTGCATATTGGGAATTTTGTGCGGGGTTCGGGTTG TAC GATAGA
SerLeuAlaTyrTrpGluPheCysAlaGlyPheGlyLeu Tyr AspArg
290295300
TGGACAAAAACATGGATAGAACCTCTTACTACCTCTGCA CTT GGAAAA
TrpThrLysThrTrplieGluProLeuThrThrSerAla Leu GlyLys
305310315320
TAA (963)
(4) SEQ ID NO. 4 耐热纤维素酶成熟蛋白氨基酸序列表
<210〉 4 <211> 320 <212> PRT
<213>真细菌(Fervidobacteri咖nodosum) <220>
<222> (l)... (320) <400> 4
Met Asp Gin Ser Val Ser Asn Val Asp Lys Ser Ser Ala Phe Glu Tyr
15 10 15
Asn Lys Met lie Gly His Gly lie Asn Met Gly Asn Ala Leu Glu Ala
<formula>formula see original document page 20</formula>TAT CAAGCCCCTGATAAATATGGT CCT GTATTAGTTGAAATTTGGAAA
Tyr GinAlaProAspLysTyrGly Pro ValLeuValGlulieTrpLys
130135140CAA GTTGCCCAAGCTTTTAAAGAT TAT CCAGACAAATTGTTCTTTGAA
Gin ValAlaGinAlaPhe匕ysAsp Tyr ProAspLysLeuPhePheGlu
145150155160
ATA mAACGAACCAGCTCAAAAT TTG ACTCCGACTAAGTGGAATGAG
lie PheAsnGluProAlaGinAsn Leu ThrProThrLysTrpAsnGlu
165170175
tatccaaaagttttaggtgaa att cgaaaaacgaatccatcaaga
Leu TyrProLysValLeuGlyGlu lie ArgLysThrAsnProSerArg
180185190
ATT GTAATTATAGACGTTCCAAAT TGG TCGAACTACAGCTACGTAAGA
lie VallielieAspValProAsn Trp SerAsnTyrSerTyrValArg
195200205
GAG TTAAAGCTTGTTGATGATAAA AAT ATAATTGTTTCATTCCATTAT
Glu LeuLysLeuValAspAspLys Asn lielieValSerPheHisTyr
210215220TAC GAACCTTTTAATTTTACTCAC CAA GGTGCTGAATGGGTTAGTCCA
Tyr GluProPheAsnPheThrHis Gin GiyAlaGluTrpValSerPro
225230235240
ACG CTTCCAATTGGCGTTAAATGG GAA GGAAAAGATTGGGAAGTGGAA
Thr LeuProlieGlyValLysT卬Glu GlyLysAspTrpGluValGlu
245250255
CAG ATTAGAAATCATTTCAAATAT GTT AGTGAGTGGGCAAAGAAAAAC
Gin lieArgAsnHisPheLysTyr Val SerGluTrpAlaLysLysAsn
260265270
AAT GTTCCGATATTTTTAGGTGAG TTT GGCGCATATTCAAAAGCAGAT
Asn ValProliePheLeuGlyGlu Phe GlyAlaTyrSerLysAlaAsp
275280285
ATG GAATCACGGGTGAAATGGACC AAA ACTGTTAGGAGAATCGCTGAA
Met GluSerArgValLysTrpThr Lys ThrValArgArglieAlaGlu
290295300
GAA TTCGGATTTTCGCTTGCATAT TGG GAATTTTGTGCGGGGTTCGGG
Glu PheGlyPheSerLeuAlaTyr Trp GluPheCysAlaGlyPheGly
305310315320
TTG TACGATAGATGGACAAAAACA TGG ATAGAACCTCTTACTACCTCT
Leu TyrAspArgTrpThrLysThr Trp lieGluProLeuThrThrSer
325330335
GCA CTTGGAAAATAA(1023)
Ala LeuGlyLys*
340
(6) SEQ IDNO. 6 耐热纤维素酶重组蛋白氨基酸序列表
<210> 6
<211> 340
<212> PRT
<213〉真细菌(Fervidobacteriura nodosum)
<220>
<222〉 (l)...(340)
<400〉 6
Met GlySerSerHisHisHisHis His HisSerSerGlyLeuValPro
151015
Arg GlySerHisMetAspGinSer Val SerAsnValAspLysSerSer
202530
Ala PheGluTyrAsnLysMetlie Gly HisGlylieAsnMetGlyAsn
354045
Als LeuGluAlaProValGluGly Ser TrpGlyValTyrlieGluAsp
505560
Glu TyrPheLyslielieLysGlu Arg GlyPheAspSerValArglie
65707580
Pro lieArgTrpSerAlaHislie Ser GluLysTyrProTyrGlulie
859095
Asp LysPhePheLeuAspArgVal Lys HisValValAspValAlaLeu
100105110
Lys AsnAspLeuValVallielie Asn CysHisHisPheGluGluLeu
105120125
Tyr GinAlaProAspLysTyrGly Pro ValLeuValGlulieTrpLys
130135140
Gin ValAlaGinAlaPhe匕ysAsp Tyr ProAspLysLeuPhePheGlu
145150155160
lie PheAsnGluProAlaGinAsn Leu ThrProThrLysTrpAsnGlu
165170175
Leu TyrProLysValLeuGlyGlu lie ArgLysThrAsnProSerArg
180185190
lieVallie 195lieAspValProAsn 200TrpSerAsnTyrSer 205TyrValArg
GluLeu 210LysLeuValAspAsp 215LysAsnlielieVal 220SerPheHisTyr
TyrGluProPheAsnPheThrHisGinGlyAlaGluTrpValSerPro
225230235240
ThrLeuProlieGly 245ValLysTrpGluGly 250LysAspTrpGluVal 255Glu
GinlieArgAsn 260HisPheLysTyrVal 265SerGluTrpAlaLys 270LysAsn
AsnValPro 275liePheLeuGlyGlu 280PheGlyAlaTyrSer 285LysAlaAsp
MetGlu 290SerArgValLysTrp 295ThrLysThrValArg 300ArglieAlaGlu
GluPheGlyPheSerLysAlaTyrTrpGluPheCysAlaGlyPheGly
305310315320
LeuTyrAspArgTrp 325ThrLysThrTrplie 330GluProLeuThrThr 335Ser
AlaLeuGlyLys 340*
权利要求
1.一种如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的耐热纤维素酶前体蛋白基因。
2、 一种如SEQIDN0 2所示氨基酸序列的耐热纤维素酶前体蛋白。
3、 一种如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐热纤维素酶成熟蛋白基因。
4、 含有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐热纤维素酶成熟蛋白基因的重组质粒，其特 征在于为重组质粒pCel5A。
5、 含有权利要求4所述重组质粒的耐热纤维素酶工程菌，其特征在于为在大肠杆菌￡. co//中表达的工程菌。
6、 一种如SEQ ID NO 4所示氨基酸序列的耐热纤维素酶成熟蛋白。
7、 含有SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的耐热纤维素酶重组蛋白基因的重组质粒，其特 征在于为重组质粒pNHCel5A。
8、 含有权利要求7所述重组质粒的耐热纤维素酶工程菌，其特征在于为在大肠杆菌E. co//中表达的工程菌。
9、 一种与SEQ ID N0 4所示氨基酸序列具有90"/o以上同源性的耐热纤维素酶重组蛋白。
10、 如权利要求9所述的与SEQ ID NO 4所示氨基酸序列具有90%以上同源性的耐热纤 维素酶重组蛋白，其特征在于是为如SEQ ID NO 6所示氨基酸序列的耐热纤维素 酶重组蛋白。
11、 权利要求6所述的耐热纤维素酶蛋白在纤维素加工领域的应用。
12、 权利要求9或10所述的耐热纤维素酶重组蛋白在纤维素加工领域的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程领域，具体涉及来源于闪烁杆菌属(Fervidobacterium)细菌的耐热纤维素酶基因、重组载体、纤维素酶基因工程菌、耐热纤维素酶及应用。我们获得的耐热纤维素酶(FnCel5A、FnNHCel5A)能在高温条件(70～80℃)下高效催化反应，而且酶的稳定性非常好，运用到生产中，有储运成本低、加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低等优点。同时FnCel5A、FnNHCel5A是具有单一内切酶活性的耐热纤维素酶，在纤维素加工领域具有广泛的应用。也可以将该重组耐热纤维素酶应用到洗涤剂、废水处理、动物饲料等方面，或者应用在纺织工业、再生纸生产、植物有效成分提取、果汁加工等工业。
文档编号C12N1/21GK101372693SQ20081005090
公开日2009年2月25日 申请日期2008年7月1日 优先权日2008年7月1日
发明者雁 冯, 张作明, 王校楠, 王玉国, 郑柏松 申请人:吉林大学