羊草Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因序列及其克隆和应用的制作方法

专利名称：羊草Na⁺/H⁺反向转运蛋白基因序列及其克隆和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及羊草(v4"ewra/epWMm c/ /脱rae)中Na"7H+反向转运蛋白基因爿dVHA7的 克隆、重组及耐盐性功能的分析和应用，属于分子生物学和生物技术领域。(二) 背景技术高浓度的盐引起植物体内的离子失衡和高渗胁迫，导致植物发育不良，生长缓慢特别 是降低农作物产量。严重的盐胁迫或渗透胁迫会引起植物体内的第二胁迫——氧化胁迫的 发生，甚至导致植物死亡。因此，盐胁迫受到人们的广泛关注，提高作物的耐盐性亦愈来 愈受到人们的重视。在高盐下，植物通过产生胁迫蛋白和可溶性渗透调节物质来减轻盐胁 迫造成的毒害。早期的耐盐基因工程主要集中在清除自由基和增加渗透调节物质两个方 面，转基因植株的耐盐能力有所提高，但效果不太明显。最近，定位在质膜和液泡膜上的 Na+ZH+反向转运蛋白基因从许多植物中分离出来。研究结果表明质膜上的Na+ZH+反向转运 蛋白负责Na+的外排，从而保持植物细胞内低Na+水平。而液泡膜上的Na+ZH+反向转运蛋 白则负责Na"的液泡区域化，维持细胞内的离子均衡。这大大促进了耐盐基因工程方面的 研究工作并取得突破性进展。Blumwald等利用基因工程手段在番茄和油菜中过量表达Na+ 反向转运蛋白基因，得到了世界上第一批真正意义上的耐盐植株，参见于张虹霞等人于 2001年《自然生物技术》中的转基因抗盐番茄植株叶中积累盐而果实中不积累盐，19: 765-768 (Hong-Xia Zhang， Eduardo Blumwald， 2001, Nature biotechnology, 19:765-768)。(三) 发明内容本发明的目的是提供羊草编码液泡型Na7H+反向转运蛋白的全长cDNA，并提供将该 基因导入受体植物，获得具有高耐盐能力的转基因植物。 技术方案1.从羊草中分离出编码液泡型Na+AT反向转运蛋白的全长cDNA: 从羊草叶片中提取总RNA，然后将总RNA反转录成cDNA。根据其它植物中的Na7H+反 向转运蛋白中保守的氨基酸序列，设计两条上游一条下游兼并引物正向引物l: 5'-tt(tc) aa(tc) gc(tc) gg(gt) U(tc) ca (ag) gt-3' 正向弓l物2: 5'-aca ga(tc) tc(tg) gt(tc) tgc ac (ct) tt-3' 反向弓l物5'-ga(tc) aa(ca) ggg aa(gt) ac(ga) aat gc-3'结果扩增到一个617bp的DNA片段。经过3'和5'末端快速扩增获得全长的cDNA 为2022bp，包括起始密码子前的上游序列和多聚A尾巴。开放阅读框部分为1611bp，由 此推得具537个氨基酸的一段序列，将此氨基酸序列在国际基因库中进行比较，表明与 已发表的大麦(〃oi^/ei/z 7 raJgare)、长禾惠偃麦草(7Xi/ (9AK^〃/H e2o/ ga t〃/n)禾口小麦(7>i^'c"/z 的Na+Ai+反向转运蛋白的氨基酸同源性都为94%,表明经过上述克隆步骤得到 了编码^+/11+反向转运蛋白的基因，该基因序列及其编码的氨基酸序列如下 序列表(l)SEQ ID NO 1的信息(a) 序列特征*长度2022碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b) 分乎类型cDNA(c) 假设否(d) 反义否(e) 最初来源羊草(f) 序列描述SEQ IN NO. 1ATGGGGTTCGAAATAGTGACGGCGCAGCTGGCGCGGCTGAGCGGCGCGCTGGGCACCTCG——60 GGGCTGTGCACGGGCGTGGTGATCCTGCTGACCACCAAGGGGAAGAGCTCGCACGTGCTC---240 GTTGGGACGATGATTTCGTTTTTCACAATATCTCTTGCTGCCATTGCGATATTCAGCAAG—-420—600 —660 :---720 —780 —840 --900 :—-960 -1020GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT--1080AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200 GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCAACGCGATA--1260-1320 -1380 -1440 -1500CACTAC亇ACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG--1560CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGMGA--1680:--1740 -1800AACAGGAAGATGAACCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860-1920「--1980ATCCTGCCAAAAMAAAAMAAAAAAAAAMAMAAAAMAA--------------------2022(2) SEQINN0.2的信息 (a)序列特征*长度537氨基酸 *类型氨基酸 *链型单链*拓扑结构线性 (b)分子类型蛋白质 (C)序列描述FLGVFSGLLSAYIIKKLYIGRHSTDREVAL丽LMAYLSYMLAELLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTVSSRVTTNVHVG-5372. 构建具有上述基因序列的表达载体根据上述序列，设计构建表达载体的引物正向引物5'—CGGTCTAGAATGGGGTTCGAAATAGTGAC—3' 反向引物5'-TATGAGCTCTCATCCCACGTGTACATTCG-3'以叶片的总RNA反转录的.cDNA为模板，进行PCR扩增出含全长编码框的序列，先连 接到pMD18-T载体上，进行测序鉴定。然后用Zfel和5"a/1切下该片段，插入到表达载 体PBI121的35S启动子的下游。3. 将构建好的表达载体通过冻融法转入农杆菌EHA105.4转化烟草NC89，在含卡那霉素的LB固体培养基上筛选，将筛选出的抗性苗在100mM、 200mM和300mM氯化钠的培养基上培养。实验结果表明，与野生型'相比，含有本发明编码 *+川+反向转运蛋白的基因转基因植株仍能正常生长，耐盐性高达200mM，具较高的耐盐 能力。5.转化酵母盐敏感突变株RIOO(由Dr. Rajini Rao, Johns, Hopkins University, U.S.A.提供)在选择培养基上筛选转化子，将筛选出的阳性转化子在含400慮氯化钠的选择培养基上培 养。实验结果表明」cAm7对酵母盐敏感突变株有补偿作用，转力cAKW的酵母盐敏感突变株的耐盐能力大大增强。根据上述技术，从羊草中分离出编码液泡型Na7H+反向转运蛋白的基因」cyV"n，该基因过量表达能导致转基因烟草具较高的耐盐性。将该基因与特异启动子连接，对其表达 进行时空和胁迫诱导进行调控，将更具有针对性，具有非常重要的经济效益和社会效益.

图1是野生型和转JcMft7基因植株的光合速率的测定结果柱状图；横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示光合速率值；W代表野生型，T代表转基因植株。图2是野生型和转基因植株的叶绿素含量的测定结果柱状图；横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示叶绿素含量；W代表野生型，T代表转基因植株。图3是^^^7基因对酵母盐敏感突变体的补偿作用图；横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示600nm处的光吸收值；control代表野生型酵母菌株K601 (由Dr. Rajini Rao,Johns Hopkins University, U.S.A.提供)，R100/pYES2代表转pYES2 (空载体)的酵母菌株，R100/pYES2 AcNHXl代表转^cMH7基因的酵母菌株。 具体实施方式
实施例l:羊草Na+ZH"反向转运蛋白基因的克隆方法1. 总RNA的提取采用RNAeasy mini kit (promoga公司产品)提取总RNA。2. cDNA第一条链的合成取2微克总RNA,加入5x反应缓冲液4 |il， 10mM脱氧核 糖核酸(dNTP) 2|_d，核糖核酸酶抑制剂(40-200u/nl) 0.5 |_U，引物T26(10 pmol/^l) 1 |_U，反转录酶(10u/|al) 2pl， 42。C反应60分钟，85°C IO分钟终止反应。3. PCR反应聚合酶链式反应(PCR)试剂与条件为首先将下列试剂混在一起10x反应缓冲液 5lOmM脱氧核苷酸混合物(dNTP) 1 ^正向引物(lOpM) 2 |al反向引物(10(M) 2|J模板cDNA 1 ^TaqDNA聚合酶 0.5^1总体积 50 ^PCR反应条件为94°C 5分钟，然后进入下列循环94°C 1分钟，55°C 1分钟，72°C 1.5分钟，共30个循环，最后72。C延伸5分钟。4.基因克隆取2|il PCR与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产 品pMD18-T Vector system说明书进行。然后连接产物转化大肠杆菌DH5a菌株，在表面 涂有5_溴—4—氯—3 —吲哚—(—d—半乳糖苷)和X—gal的含氨苄青霉素(100微克/毫 升)的lb平板上生长过夜。挑取白色菌落，在lb液体培养基中培养过夜。5. 质粒DNA的提取碱法提取质粒DNA。6. 序列测定本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。7.3'禾口5'序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行8.同源检索禾i」用BLAST软件将分离出的序列与基因银行中的序列进行比较。实施例2:.羊草Na+/H+反向转运蛋白基因^4cA^X^^/if/定，本工作在上海生工生物工程技术服务有限公司进行。7. 3'禾口5'序列的分离按Clontech公司的SMART RACE cDNA Amplification Kit说明书进行羊草Na+7H+反向转运蛋白基因JcAKX/及其编码蛋白氨基酸序列如下 (l)SEQIDNOl的信息(a) 序列特征*长度2022碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b) 分子类型cDNA(c) 假设否(d) 反义否(e) 最初来源:羊草(f) 序列描述SEQINNO.lATAATCAAGAAGTTATACATAGGAAGGCATTCTACTGACCGTGAGGTTGCACTTATGATG—-780 GTATTCTTCTGTGGTATTGTGATGTCACATTATACCTGGCATAACGTGACAGTGAGCTCA—-900GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT—1080AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200 GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCMCGCGATA--1260AAGCCTCTGATCCGGTTCCTGCTGCCCGCGTCGAGTGGCGCCACCTCGGAGCCCTCATCA--1380CTCCCCATCGTCAGGCCGTCCAGCCTCCGGATGCTCCTCACCAAGCCGACCCACACCGTC—1500 CACTACTACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG—1560CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGAAGA--1680'TAACTCAGAAGGCCGACGGCCCTCTGATGATGGTTCAGATGAACGGTTGGTTGCGGCACC—1800 AACAGGAAGATGMCCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860ATCCTGCCMAAAAAAAMAAAAAMAAAAAAAAMAAAAAA--------------------2022(2) SEQINN0.2的信息 (d)序列特征*长度537氨基酸 *类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(e) 分子类型蛋白质(f) 序列描述FLGVFSGLLSAYIIKKLYIGRHSTDREVAL醒LMAYLSYMLAELLDLSGILTVFFCGIVMSHYTWHNVTVSSRVTTNVHVG—537实施例3:表达载体的构建1.根据分离出的羊草Na+ZH+反向转运蛋白基因NHXl的核苷酸序列,设计引物 正向引物5'-CGGTCTAGMTGGGGTTCGMATAGTGAC-3' 反向引物5'陽TATGAGCTCTCATCCCACGTGTACATTCG-3' 以叶片的总RNA反转录的cDNA为模板，进行聚合酶链式反应。2. 取2ialPCR与pMD18-T载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后转化大肠杆菌DH5ot菌株，在表面涂5-溴一4—氯一3 —吲 哚一p—D—半乳糖苷和X—gal的含氨苄青霉素(100微克/毫升)的LB平板上生长过夜。 挑取白色菌落，在LB液体培养基中培养过夜。碱法提取质粒DNA,进行序列测定。3. 用^^I和& /I两个限制性内切酶将该基因从pMDl8-T载体上切下,与相同酶酶切的 PBI121连接。连接产物转化DH5a细胞，然后在含氨苄青霉素的LB固体平板上培养，对 菌落进行PCR鉴定和质粒DNA的酶切分析。4. 将构建好的表达载体通过冻融法转化农杆菌EHA105。 实施例4:基因耐盐性分析1. 种植烟草NC89。2. 挑取鉴定好的农杆菌单克隆于含50毫克/升卡那霉素的LB液体培养基中，28。C振荡培养。 '3. 3000rpm离心5分钟，农杆菌沉淀用10XMS培养基悬浮。4. 将烟草叶片切成小块，放入上述悬浮液浸泡10分钟。5. 侵染后的叶片切块置于分化培养基(lxMS盐，3。/。蔗糖，pH5.8,4.5g/L卡拉胶，)上共 培养2天，然后转入选择培养基(lxMS盐，3。/。蔗糖，pH5.8,4.5g/L卡拉胶，卡那霉素100毫 克/升，头孢青霉素250毫克/升)筛选，得到抗性植株。6. 将抗性植株移入花盆，每两天浇含10mmolL"，100mmolL人200mmolL"和300 mmolL—i氯化钠的l/2Hoagland营养液，20天后测定野生型和转基因植株的光合速率和叶绿 素含量。实验结果表明转化烟草，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基 因可用于植物的遗传转化,提高植物的耐盐能力。实施例5:羊草Na7H+反向转运蛋白基因^cMZW对酵母盐敏感突变株的补偿作用1. 将克隆到的全长cDNA亚克隆到pMD18-T载体中，构建成pMD18-T-AcNHXl 。2. 将pMD18-T-AcNHXl和酵母表达载体pYES2经^a/z^/和历'/2t////酶切，回收目的条 带，在连接酶作用下，构建成pYES2-GhNHXl表达载体。3. 挑取YPD平板上的酵母菌株K601(野生型)和R100(盐敏感突变株)单菌落与5mlYPD 培养液中，30。C振荡培养过夜，再稀释10倍，振荡培养6小时，3000rpm离心5分钟收 集菌体，用1.5mlTE重悬菌体。4. 分别取O. lml上述菌液、3pig pYES2-AcNHXl质粒和O. 6mlTE-liOAC-PEG溶液于一 L5ml离心管中，30。C振荡培养30分钟，42。C热激15分钟，3000rpm离心20秒收集菌体， 重悬于0.5ml重蒸水中，取200nl涂布于选择培养基上，30。C培养2-4天。5. 转化子接种到选择培养液中，30。C振荡培养48小时，测定600nm处的光吸收。 实验结果表明将该基因转入盐敏感酵母突变株RIOO，能在一定程度上恢复其抗盐能力。
权利要求
1. 一个克隆的羊草Na+/H+反向转运蛋白基因，其特征在于它具有如下所示的核苷酸序列ATGGGGTTCGAAATAGTGACGGCGCAGCTGGCGCGGCTGAGCGGCGCGCTGGGCACCTCG----60GACCACGCGTCCGTGGTCTCCATCAACCTCTTCGTGGCGCTGCTCTGCGCCTGCATCGTC---120CTCGGCCACCTCCTCGAGGAGAACCGCTGGCTCAACGAGTCCATCACCGCCCTCATCATC---180GGGCTGTGCACGGGCGTGGTGATCCTGCTGACCACCAAGGGGAAGAGCTCGCACGTGCTC---240GTCTTCAGCGAGGACCTCTTCTTCATATACCTCCTCCCTCCCATCATCTTCAACGCCGGT---300TTCCAGGTGAAGAAGAAGCAGTTCTTCCGGAATTTCATGACAATCACACTATTTGGTGCT---360GTTGGGACGATGATTTCGTTTTTCACAATATCTCTTGCTGCCATTGCGATATTCAGCAAG---420ATGAACATTGGGACACTGGACGTATCAGATTTTCTTGCAATTGGAGCTATCTTTTCCGCG---480ACAGATTCCGTCTGCACTTTACAGGTTCTGAATCAGGATGAGACGCCCTTTTTGTACAGT---540CTAGTTTTCGGGGAAGGTGTTGTGAACGACGCCACATCAGTCGCGCTTTTCAACGCGCTC---600CAGAACCTTGATCCTAACCACATCGACGCAATCGTCATTCTCAAGTTCTTGGGGAATTTC---660TGCTACTTATTCGTGTCAAGCACCTTCCTTGGAGTGTTTTCTGGATTGCTCAGTGCATAC---720ATAATCAAGAAGTTATACATAGGAAGGCATTCTACTGACCGTGAGGTTGCACTTATGATG---780CTCATGGCCTACCTCTCATATATGCTAGCTGAGCTGCTTGATTTGAGTGGCATCCTCACT---840GTATTCTTCTGTGGTATTGTGATGTCACATTATACCTGGCATAACGTGACAGTGAGCTCA---900AGAGTTACAACAAAGCATGCGTTCGCAACCTTGTCCTTCATCGCTGAGACTTTTCTCTTC---960CTTTATGTTGGGATGGATGCACTGGATATTGAGAAATGGAAATTTGCTAGTGACAGCCCT--1020GGCAAATCCATTGGAATAAGCTCAATTTTGCTAGGGTTGGTTCTGGTGGGAAGAGCTGCT--1080TTTGTCTTCCCGCTCTCATTCTTGTCCAACTTAACAAAGAAGACGGCTCTCGAGAAAATA--1140AGCTGGAGGCAGCAAGTCGTAATATGGTGGGCCGGGCTGATGAGAGGAGCTGTGTCGATT--1200GCTCTTGCTTACAATAAGTTTACAAGATCTGGTCACACGCAGCTGCACGGCAACGCGATA--1260ATGATCACCAGCACCATCACTGTCGTTCTGTTTAGCACCATGCTGTTTGGCATATTGACA--1320AAGCCTCTGATCCGGTTCCTGCTGCCCGCGTCGAGTGGCGCCACCTCGGAGCCCTCATCA--1380CCGAAGTCCCTGCACTCTCCTCTCCTCACAAGCATGCTAGGCTCGGACCTGGAGCCGGCT--1440CTCCCCATCGTCAGGCCGTCCAGCCTCCGGATGCTCCTCACCAAGCCGACCCACACCGTC--1500CACTACTACTGGCGCAAGTTTGACGACGCGCTGATGCGCCCGATGTTCGGTGGGCGCGGG--1560TTCGTGCCCTACTCCCCAGGATCACCCACCGATCCGAATGTACACGTGGGATGAACGTCG--1620CGAAGAAACAACGCAGAAGCCATTACGGCTTCAGAAGGCACTTGAACCGTGACATGAAGA--1680GAAGGAATCACTACAGCTTCAGAAGAAGGCAAAGTTTCCGGTAATATTATAGTGTTTGGC--1740TAACTCAGAAGGCCGACGGCCCTCTGATGATGGTTCAGATGAACGGTTGGTTGCGGCACC--1800AACAGGAAGATGAACCCTAGTAACGGTGATGCGAGTATCATCGCCTTATAGGTTACGACG--1860AGCCTGTACATTTTTGTATGTAGATTAACAAGCCATTGTATCCTATGAGATCTCCGCTAG--1920CAGGCAGGTGTCTGACCTCCTGCGTCTACCCTTACTTAATCTCCTAATGGATTGGTGTGT--1980ATCCTGCCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA--------------------2022
2.根据权利要求1所述的基因，其特征在于该基因编码如下所示的氨基酸序列的蛋白质:SSLRMLLTKPTHTVHYYWRKFDMLMRPMFGGRGFVPYSPGSPTDPNVHVG-537
3.根据权利要求1所述的基因的应用，其特征在于该基因在植物中表达，能有效地提高植物的 耐盐性。4根据权利要求3所述的基因的应用，其特征在于该基因在烟草中表达，能有效地提高烟草的 耐盐性。5根据权利要求1所述的基因的应用，其特征在于该基因在酵母菌盐敏感突变株R100中表达， 能在一定程度上恢复其抗盐能力。
全文摘要
本发明公开了羊草Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因序列及其克隆和应用。属于分子生物学领域。根据其它植物中发表的Na⁺/H⁺反向转运蛋白的氨基酸序列，设计引物，利用反转录-聚合酶链式反应，从羊草中首次分离出编码液泡型Na⁺/H⁺反向转运蛋白的基因。将该基因转入盐敏感酵母突变体，能在一定程度上恢复其抗盐能力。进一步构建正义表达载体，转化烟草，转基因植株具有较高的耐盐性，耐盐性可达200mM。该基因可用于植物的遗传转化，提高植物的耐盐能力。
文档编号C12N15/10GK101260404SQ200810050629
公开日2008年9月10日 申请日期2008年4月23日 优先权日2008年4月23日
发明者李校堃, 李海燕, 源 江, 鑫 王, 越 许, 嘉 郭, 峰 魏 申请人:吉林农业大学