专利名称：导入AcInv反义基因培育抗低温糖化马铃薯品系的方法
技术领域：
本发明涉及一种重组DNA及其构建，并以农杆菌为介导转化马铃薯品种，培育马铃薯块茎抗低温糖化品系的方法。具体地说，本发明涉及一种包含有拟南芥(Arabidopsis thaliana)rd29A启动子(rd29A promoter)和马铃薯普通栽培种(Solanumer tuberosum，2n＝4X)酸性转化酶(acidinvertase，AcInv)cDNA反向序列，能够在植物细胞中受低温诱导转录或表达酸性转化酶反义基因的植物表达载体构建，并以农杆菌为介导转化马铃薯普通栽培种(2n＝4X)，培育马铃薯块茎抗低温糖化品系的方法。
背景技术：
马铃薯为重要的粮菜兼用和工业原料作物，是世界四大作物之一。由于其耐瘠薄、高产稳产、适应性广、营养成分全和产业链长，而受到全世界的高度重视。根据国际马铃薯中心(CIP)的粗略估计，全世界用于直接食用的马铃薯不及总产量的1/2，其余都用于深加工。在一些发达国家，马铃薯加工所占比重一般都在70％，甚至有的国家高达80％以上，并有一系列配套的加工型品种。虽然我国马铃薯种植面积占全世界马铃薯播种面积的近1/4，总产约占1/5，其栽培面积和总产均居世界首位(张长生.面向21世纪的中国马铃薯产业一马铃薯产业与西部开发.哈尔滨，哈尔滨工程大学出版社，2000，10-13)，但加工业一直比较落后，加工比重还不到总产量的20％，丰富的资源优势未得到充分开发利用，马铃薯生产效益仍然较低。要保持我国马铃薯生产的优势，必须以加工业为支撑，通过产品的深加工增值来带动马铃薯产业的发展。
用于加工的马铃薯原料品种要求比一般粮菜兼用型品种高，不但要高产、抗病，而且对块茎外观及内含物还有严格的要求，其中块茎干物质含量和还原糖含量是加工型品种的两项重要指标。一般要求作为加工原料的品种其块茎比重要大于1.080，干物质含量在20％以上。用于油炸薯片、薯块的品种，其块茎还原糖(主要是葡萄糖、果糖)含量应小于0.1％(鲜重)，上限不超过0.3％(樊民夫，高艮奎.面向21世纪的中国马铃薯产业—马铃薯产业与西部开发.2001，84-87)。
由于我国传统的马铃薯消费习惯是用于鲜食，品种选育也以高产、抗病为主要目标，育成品种大多为粮菜兼用型，淀粉含量多在12％～16％之间，适于加工的高淀粉品种奇缺。近年来，通过引进和自育筛选出了一些高淀粉含量的品种，基本上满足了加工企业的要求。但这些品种还原糖含量普遍偏高，尤其在低温贮藏条件下块茎的还原糖含量增高，严重影响到加工产品质量。因此，选育低还原糖含量和抗低温糖化的品种已成为当前马铃薯育种工作的一项紧迫任务。
马铃薯块茎还原糖含量高低既由遗传因素控制，又受贮藏条件的影响。在诸多环境因素中低温是造成还原糖含量增加的主要影响因子。用于加工的马铃薯块茎收获后，一般都要经过一段贮藏期，在此期间因病害侵袭、抽芽和失水易造成腐烂损失。控制窖藏损失的措施有喷施促休眠化学药剂或采用低温贮藏方法。由于化学药剂处理会造成残毒，一般禁止使用；利用农民地窖贮藏，随具有方便、安全和成本低的突出优点，但由于地窖贮藏利用的是自然低温，在严冬季节常低于10℃，往往会引起块茎还原糖含量的增加，即所谓的冷糖化(cold-sweetening)。发生糖化的块茎用于淀粉加工则出粉率较低；用作油炸食品原料时，则在高温油煎过程中发生非酶促的迈拉尔德反应(Maillar-typereaction)，即细胞中还原糖与自由氨基酸发生反应生成褐色并带有苦味的物质，严重影响到食品的风味和观感(Shailenberger et al..J.Agric.FoodChem.，1959，7274-277；Pressy et al..Arvh.Biochem.Biophys.，1966，133667-674；Samotus et al..Potato Res.，1974，1764-81；Eileen.PlantPhysiol.，1991335-341；Vayda et al..Potato Genetics，CBA InternationPress，Oxon UK，1994250-251)。因此，控制块茎中的还原糖含量，对提高其加工产品的品质是极为重要的。
一般降低块茎还原糖含量的措施有两种一是回暖(reconditioning)，二是品种选育(Samotus et al.，Potato Res.，1994，1764-81)。回暖是指低温窖藏下的块茎出窖后，再在10℃以上环境中放置一段时间，使体内还原糖通过自身呼吸消耗掉(Bruton et al..Eur.Potato J.，1969，1281-95)，从而降低块茎中还原糖含量。实施回暖措施不但需要一定的场地设施和增加生产工序，而且会造成原料无谓的消耗，必然会增加生产成本，一般难于被加工企业所采用。相对而言，通过育种途径培育低还原糖含量和低温下还原糖不升高的品种，利用自然低温地窑贮藏，根据加工企业的需求按计划供给原料，则可使加工企业生产成本大幅度下降。应当说这是解决块茎低温糖化最为经济有效的措施。
虽然马铃薯块茎还原糖含量高低在品种间存在较大的差异，通过育种途径有可能培育出还原糖含量低的品系。但遗憾地是，利用低还原糖无性系与普通品种杂交，其后代分布倾向于高还原糖亲本，低还原糖后代所占比率极低，通过常规育种方法来选育还原糖含量及块茎抗低温糖化的品种，将是极其困难和非常耗时的(Eileen et al..Plant Physiol，1991，335～341)。于是，人们企图通过基因工程技术来控制低温糖化代谢过程，培育块茎低还原糖含量和抗低温糖化的品系。
分子生物学研究表明，反义RNA(antisense RNA)技术是控制特定基因(靶基因)表达的一条有效途径。反义RNA技术成功应用的第一件事例是耐贮性番茄品种的培育。目前这一技术已应用到瓜菜花卉保鲜、某些人类疾病的控制等方面，其成功的事例也越来越多，这就启迪我们采用反义RNA技术来抑制块茎低温糖化过程中的关键酶基因，以培育块茎低还原糖含量和抗低温糖化的品种。
根据马铃薯块茎中糖类转化机制，在淀粉降解代谢过程中，尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(uridine diphosphate glucose pyrophosphorylase，UGPase)和转化酶(invertase)是两个重要的酶(Bruton et al..Eur.Potato J.，1969，1281-95；Samotus et al..Potato Res.，1974，1764-81)。1993年，Zrenner克隆并构建了UGPase反义基因植物表达载体，通过遗传转化获得的转基因植株中UGPase活性受到明显抑制，其活性较对照下降了95％～96％。但遗憾的是，剩余的UGPase活性仍使淀粉——还原糖转化过程照常进行，说明控制UGPase活性并不能有效地降低低温糖化代谢过程(Zrenner et al..Planta，1993，190247-252)。转化酶包括中性转化酶(nautral invertase)和酸性转化酶(acid invertase，AcInv)，其作用都是催化蔗糖降解产生己糖。中性转化酶在生长的植株体内含量较高，其作用与合成代谢密切相关，而在冷藏块茎中的含量波动很小，活性也很低，几乎与冷藏块茎低温糖化作用无关(Zrenner et al..Planta，1996，198246-252)。AcInv则与块茎冷糖化作用密切相关，Pressey的研究指出低温贮藏块茎中AcInv具有最大活性(Pressey.Arvh.Biochem.Biophys.，1966，133667-674)。低温糖化代谢过程中，AcInv催化蔗糖水解为转化糖的反应是不可逆的。生化代谢调控理论认为，一般催化不可逆反应的酶往往是影响整个代谢途径的限速酶，也是代谢调控的关键部位，所以，AcInv被认为是低温糖化代谢过程中的关键酶。据此我们认为，抑制AcInv活性有可能成为控制块茎低温糖化的突破口。
到目前为止，有关AcInv的分子生物学研究报道较少。Zhou等最早从低温贮藏块茎中克隆了AcInv cDNA全长序列(Plant Physiol.，1994，106397-398)。此后，Zrenner等构建了由花椰菜花叶病毒35S启动子(cauliflower mosaic virus 35S promoter，CaMV 35S)驱动的AcInv反义基因植物表达载体，转化马铃薯品种得到转基因植株，其块茎在低温贮藏条件下虽然可溶性糖(蔗糖、葡萄糖和果糖)总量没有变化，但还原糖/蔗糖的比率下降(Planta，1996，198246-252)，说明对AcInv基因的反义抑制可有效地控制蔗糖的降解。但CaMV 35S启动子是一种组成型表达启动子，在植物的任何组织、任何条件下都会启动它所控制的基因表达。这种表达模式不但在能量代谢上是一种无谓的浪费，还有可能对植物的生长发育产生不利影响。在生产上，马铃薯多以块茎作为繁殖材料，种薯萌发过程中体内贮藏的淀粉必须转化为可溶性糖才能被新生组织和器官所利用，其中转化酶的作用是非常重要的。尽管有研究指出，在马铃薯块茎萌发和植株生长期，以中性转化酶的作用为主，但并未排除AcInv的作用(Isherword.Phytochemistry，1976，1533-41)。如果在正常生长期，植株体内的AcInv作用仍受到抑制，也许对生长发育产生负面影响。由于块茎发生糖化的环境诱导因子是低温，如果将AcInv反义基因置于低温诱导启动子之下，在正常温度条件下使反义基因的转录停止或转录水平极低，则对内源性AcInv活性影响甚微或不产生影响；一旦块茎处于低温条件下，低温诱导型启动子则驱动AcInv反义基因的转录，抑制内源性AcInv基因的转录或表达，使AcInv引起的糖化作用降低到最低，这样就有可能防止块茎发生低温糖化。
鉴于以上考虑，我们研究的总体思路是设计一种低温诱导的AcInv反义基因表达模式，使转基因植株中AcInv反义基因在正常温度条件下处于一种沉默状态，而在低温贮藏条件下高效转录，以抑制块茎内源性AcInv基因的表达，达到抗低温糖化的目的。
到目前为止，从植物中分离鉴定出的低温诱导启动子主要有油菜的bn115、拟南芥的rd29A、cor15A和adh、小麦的wes120和玉米的mlip15等基因启动子，其中rd29A启动子在植物基因表达调控方面的作用被人们所重视(Yamaguchi-Shinozaki et al..Plant Cell，1994，6251-264)。许多研究结果表明，rd29A启动子在低温下可驱动它所控制的基因转录和翻译，此外它还受干旱、高盐渗透胁迫或外源脱落酸(ABA)的诱导而上调所控制基因的表达(Xiong et al..Plant Physiol.，1999，119205-212)。因此，我们选用了rd29A启动子控制的AcInv反义基因表达模式。
利用遗传转化技术把外源基因导入植物细胞，并整合到基因组中是植物基因工程的主要环节。目前，植物遗传转化的方法主要有农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法、超声波法、电激法和激光微束导入法等，其中农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的遗传转化系统是目前研究最多、机理最清楚、技术方法最成熟、应用最广泛的转化系统，第一批能表达外源基因的转基因植物就是通过根癌农杆菌介导法获得的，迄今所获得的近200种转基因植物中，有80％是利用根癌农杆菌转化系统产生的(李卫等.科学通报，2000，45(8)798-807)。利用基因工程技术培育马铃薯品种的研究中，以农杆菌介导的遗传转化成功的事例也最多，但也存在基因型依赖性和转化效率不高的问题，如何进一步提高转化效率仍然是当前需要解决的主要问题。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种低温诱导型启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体的构建方法，即构建含有rd29A启动子(rd29A promoter)，它可受低温诱导驱动马铃薯普通栽培种(Solanum tuberosum，2n＝4X)酸性转化酶(AcInv)cDNA反向序列转录和表达的载体，转化马铃薯普通栽培种获得转基因植株，其块茎在正常温度条件下AcInv反义基因不转录，而受低温诱导时应高效转录，以抑制内源性AcInv基因的表达，从而提高块茎抗低温糖化的能力，降低块茎还原糖含量。
本发明的另一个目的是提供一种利用农杆菌介导法将目的基因导入马铃薯普通栽培品种的优化方法，以提高转化效率，获得转基因品系。
为实现上述目的，本发明首先从拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因组DNA克隆了rd29A启动子(SEQ ID NO 1)，从低温诱导下的马铃薯普通栽培品种“农薯3号”块茎中克隆了AcInv基因cDNA(SEQ ID NO 2)，用rd29A启动子和AcInv基因cDNA片段替换植物表达载体pBI121上的CaMV 35S启动子和GUS基因，构建成低温诱导型rd29A启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体pBIAc。然后用直接导入法转化农杆菌LBA4404，获得具有rd29A启动子驱动的AcInv反义基因农杆菌工程菌，再利用低温诱导型rd29A启动子驱动的AcInv反义基因农杆菌工程菌转化马铃薯品种，培育块茎抗低温糖化品系。
本发明对农杆菌介导的马铃薯遗传转化体系进行了研究，通过对培养基组分、受体材料、受体对Kan的敏感性、预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间以及转化受体材料的褐化防止等方面的研究，建立了较好的转化系统，使农杆菌介导的rd29A启动子驱动的马铃薯AcInv反义基因转化效率达到了0.501％，高于目前报道的马铃薯转化率(0.1％)。利用该方法，获得了2个转基因品系，其中“Ac转大西洋”块茎干物质、淀粉和还原糖含量分别为24.53％、19.96％和0.05％，其还原糖含量比对照品种“大西洋”低89.5％；“Ac转甘2”块茎干物质、淀粉和还原糖含量分别为27.93％、21.30％和0.44％，其还原糖含量比对照品种低59.8％。在低温(4℃±2℃)贮藏4周后，“Ac转大西洋”品系的块茎还原糖含量变为0.08％，比对照低91.3％；“Ac转甘2”品系块茎还原糖含量为0.48％，比对照降低了79.6％。证明了采用低温诱导启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方法，是培育马铃薯块茎抗低温糖化品系的一种有效方案。目前国内外尚未有相同的报道。
图1 从拟南芥DNA扩增Rd29A启动子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果
Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2～3拟南芥基因组DNA为模板PCR扩增产物图2 克隆载体pUCRD酶切(Hind III+Bam HI)产物电泳结果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2Hind III+Bam HI酶切pUCRD的产物图3 克隆载体pUCRD的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2～3以pUCRD质粒为模板PCR扩增产物图4 低温诱导型启动子rd29A的克隆载体图谱图5 CaMV35S启动子驱动的GFP基因植物表达载体图谱图6 rd29A低温诱导启动子驱动的GFP基因植物表达载体图谱图7 转化的洋葱表皮细胞中GFP的表达显微观察(20X)A～B28℃、弱光(1000lux)条件下洋葱表皮细胞中GFP的表达C～D4℃、弱光(1000lux)条件下洋葱表皮细胞中GFP的表达A和CpBIG转化细胞；B和DpBIRG转化细胞。
图8 马铃薯块茎RNA RT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2以马铃薯块茎RNA为模板的RT-PCR产物图9 AcInV基因的克隆载体图谱图10 AcInv基因反义植物表达载体(pBIRA)酶切检测结果Lane 1DGL2000 DNA MarkersLane 2(HindIII+BamHI)双酶切pBIRA的电泳检测结果图11 rd29A低温诱导型启动子驱动的AcInv反义基因的植物表达载体图谱图12 AcInv反义基因农杆菌工程菌的PCR检测琼脂糖凝胶电泳结果Lane 1λDNA/EcoR I+Hind III MarkersLane 2～5转化的农杆菌Ti质粒PCR扩增产物图13 对马铃薯不同受体材料的转化效果A.试管苗茎段 B.试管薯薯片 C.试管苗叶片 D.试管苗茎段E.微型薯薯片 F.试管苗茎段转化再生苗图14 转化苗的Southern bloting检测结果1.Dig标记的DNA Markers 2.大西洋转化植株DNA3.甘农薯2号转化植株DNA 4.布尔班克转化植株DNA5.夏伯蒂转化植株DNA 6.pBIRA/Bam HI+SacI7.大西洋未转化植株DNA图15 “Ac转大西洋”和“Ac转甘2”品系微型薯A.Ac转大西洋 B.Ac转甘2图16 “Ac转大西洋”和“Ac转甘2”品系大田表现A.Ac转大西洋 B.Ac转甘2图17 转基因品系与对照品种的薯块比较图18 本发明的植物表达载体构建流程图具体实施方式
实施例1.拟南芥rd29A启动子的克隆根据Yamaguchi-Shinozaki等(1994)报道的rd29A基因启动子核苷酸序列(GenBankD13044，gi285614)设计并合成如下成对引物Hind III引物R15’-AAG CTTAAC GCA TGA TTT GAT GGA GGA-3’Bam HI引物R25’-GGA TCCCTT TCC AAT AGA AGT AAT CAA ACC-3’
以拟南芥总DNA为模板，通过PCR扩增(94℃，3min预变性；94℃40sec，55℃40sec，72℃1.5min，循环30次扩增；72℃10min补平)得到约0.95kb的特异片段(图1)。
用PCR Fragment Recovery Kit回收0.95kb的特异片段，在T4 DNA连接酶的作用下，将回收的特异片段与pUCm-T Vector连接，转化E.coli DH5α感受态细胞，涂板(含有50mg/L Amp的LB固体培养基)后37℃过夜培养。挑选隔离良好的白色单菌斑摇菌。收集菌体，采用碱裂解法微量提取质粒。通过滞后质粒筛选、酶切(图2)和PCR鉴定(图3)，筛选的重组子提交上海联合基因科技有限公司进行测序，测序结果为SEQ ID NO 1。将测序结果SEQ ID NO1与GenBank中的rd29A基因启动子序列(D13044，gi285614)进行同源性比较，相同率达到98.12％，其主要调控区域如TATA box和低温响应元件(lowtemperature response element，LTRE)未发生任何改变，确证得到rd29A基因启动子。将此重组质粒命名为pUCRD(图4)。
实施例2.拟南芥rd29A启动子驱动的GFP基因植物表达载体构建及rd29A启动子活性检测绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein，GFP)是一些腔肠动物所特有的生物荧光素蛋白，其基因在异源细胞中的表达研究表明在蓝光激发下，转化细胞中的GFP都能发出绿光，即发射团的形成无物种特异性，也不需要特异的辅助因子。基于这一特点GFP基因作为新型标记或报告基因已广泛应用于各种生物。在我们的研究中，采用GFP基因的瞬时表达水平检测，以确定rd29A启动子的活性。
1.拟南芥rd29A启动子驱动的GFP基因植物表达载体构建将我们已经构建的植物表达载体pBIG(图5)(CaMV 35S+GFP基因)，用Hind III和Bam HI双酶切，回收大片段；用同样的两个限制酶酶切pUCRD，回收小片段；将回收的两个片段混合，用T4 DNA连接酶进行连接；连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，涂板(含有Amp的LB固体培养基)后37℃过夜培养；挑选白色单菌斑摇菌，采用碱裂解法微量提取质粒；通过滞后质粒筛选、酶切和PCR鉴定筛选出重组子，将此重组质粒命名为pBIRG(图6)。由于此质粒是用rd29A基因启动子替换pBIG上的CaMV35S，加之是双酶切产物的连接，可达到定向连接的目的，使rd29A启动子位于GFP基因的上游。所以此载体是rd29A启动子驱动的GFP基因植物表达载体。至此，获得了具有CaMV 35S启动子驱动和rd29A基因启动子驱动的GFP基因两种植物表达载体(pBIG和pBIRG)。这两种载体的结构示意如下 2.Rd29A启动子活性检测将启动子加在报告基因的上游，然后检测报告基因的表达水平可用来衡量启动子的活性。基因的瞬时表达是检测启动子和增强子活性的常用方法。由于我们构建的pBIG和pBIRG载体中都具有GFP基因，检测GFP的荧光强度，就可以确定启动子的活性。本研究用基因枪分别以包被pBIG和pBIRG质粒DNA的钨粉轰击洋葱表皮组织，在荧光显微镜下观察被处理的组织中荧光强度，用以比较rd29A启动子和CaMV 35S启动子驱动的GFP基因表达水平，进而确定rd29A启动子的活性和特点。
用基因枪轰击洋葱表皮组织前，先将洋葱表皮组织进行灭菌消毒，然后接种到含有渗透剂(0.25mol/L甘露醇+0.25mol/L山梨醇，用于维持细胞正常渗透压)的MS固体培养基中(Φ9cm培养皿)，在人工气候箱中，无菌、28℃±2℃、弱光(1000lux)条件下预培养4～6h。然后用基因枪分别将包被pBIG、pBIRG质粒DNA的钨粉(Φ1.2nm，Bio-Rad产品)轰击预培养的洋葱表皮组织。接着以28℃±2℃、弱光(1000lux)条件下将基因枪轰击后的洋葱表皮组织进行过渡培养3h，以利于受轰击细胞的恢复。此后，将过渡培养的转化材料各分为两批，一批继续在28℃±2℃、弱光(1000lux)条件下培养，另一批则置于4℃±2℃、弱光(1000lux)条件下培养10h，用荧光显微镜进行观察。
根据观察结果，在不同温度条件下rd29A启动子和CaMV 35S启动子驱动GFP基因表达有明显差异。在28±2℃、弱光(1000lux)条件下，pBIG质粒DNA转化的洋葱表皮细胞的绿色荧光强度(图7-A)高于pBIRG质粒DNA转化的表皮细胞(图7-B)，说明正常温度条件下CaMV 35S启动子的活性要高于rd29A启动子；相反的，在4℃±2℃、弱光(1000lux)条件下，pBIRG质粒DNA转化的表皮细胞中，绿色荧光强度(图7-C)明显强于pBIG质粒DNA转化的表皮细胞(图7-D)，说明rd29A启动子是一受低温诱导的启动子。
实施例3马铃薯块茎AcInv基因的克隆和rd29A启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体构建1.马铃薯块茎AcInv基因的克隆为了诱导AcInv基因的转录，将马铃薯品种“农薯3号”块茎贮藏于2℃条件下1-2周，然后提取总RNA。以块茎总RNA为模板，Oligo(dT)15作引物，在AMV Reverase(AMV-RT)作用下合成cDNA第一链。
根据已知AcInv基因核苷酸序列(GenBankL29099.1，GI529515)设计一对特异引物PAC-1Sac I
5’-GAG CTCATG GCC ACG CAG TAC CAT TCC AG-3’PAC-2BamH I5’-GGA TCCTTA CAA GTC TTG CAA GGG GAA GGA TC-3’将反转录产物稀释50倍作模板，加入合成的引物(PAC-1和PAC-2)、dNTP和Taq DNA polymerase，混匀后进行PCR扩增。PCR扩增反应参数为 30cycles扩增得到分子量约1.9kb的片段(图8)。
用PCR Fragment Recovery Kit回收PCR产物中分子量约为1.9kb的特异条带。在T4 DNA连接酶的作用下，将回收片段与pUCm-T Vector(上海生工生物工程技术服务有限公司产品，Cat.No.D0211)连接，转化感受态E.coli DH5α。挑选白色单菌斑、摇菌，采用碱裂解法微量提取质粒。通过滞后质粒筛选、酶切和PCR鉴定，初步确定为重组子，提交“赛北盛生物技术有限公司”测序。测序结果如SEQ ID NO 2所示，与GenBank中的AcInv基因序列(GenBankL29099.1，GI529515)进行同源性比较，同源率达到98.96％，确证得到AcInv基因，将此重组子命名为pGEMA(图9)。
2.rd29A基因启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体的构建分别培养pBIRG/E.coli DH5α和pUCAc/E.coli DH5α，提取质粒。为了用pUCAc上的AcInv cDNA片段替换pBIRG上的GFP基因片段，同时保证将AcInv cDNA片段反向连接在rd29A启动子之后，先根据pBIRG和pUCAc上的酶切位点对比分析，选用Sac I和BamH I分别对两种质粒进行酶切；分别从pBIRG质粒和pUCAc质粒酶切产物中，回收13.05kb片段和1.92kb片段；用T4 DNA Ligase将回收的两片段连接；连接产物转化感受态E.coli DH5α，涂布到含Kan(50mg/L)的LB固体培养基表面，37℃过夜培养；次日挑取隔离良好的单菌落8个，少量摇菌，提质粒进行酶切鉴定(图10)，结果重组质粒酶切后产生的两个片段之一与AcInv基因的分子大小相符；同时以重组质粒为模板，用引物PAC-1和PAC-2进行PCR扩增，扩增得到的片段与AcInv基因的分子大小也相符，证明AcInv cDNA已反向插入到rd29A启动子下游。该质粒上AcInv反义基因上游是植物源性的rd29A基因启动子，因此，它是AcInv反义基因的植物表达载体。将此植物表达载体命名为pBIRA(图11)。
实施例4 农杆菌介导的马铃薯遗传转化及转基因品系的获得1.pBIRA向根癌农杆菌的导入采用直接导入法(王关林等著，植物基因工程原理与技术，北京，科学出版社，1998472-473)将pBIRA导入农杆菌LBA4404，使rd29A启动子驱动的AcInv反义基因整合到Ti质粒，得到农杆菌工程菌用于马铃薯的遗传转化。由于pBIRA上具有T-DNA左边界区和右边界区(AcInv反义基因表达单元和npt-II基因表达单元的外测)，一旦pBIRA导入农杆菌后，就能与Ti质粒上的T-DNA同源区段发生双交换，使介于T-DNA左边界区和右边界区之间的区段置换整合到农杆菌Ti质粒上，而使Ti质粒成为共合体。其具体操作方法是将转化的pBIRA/LBA4404农杆菌涂布到含有卡那霉素(Kan，100μg/ml)+链霉素(Str，25μg/ml)+利富平(Rif，25μg/ml)的YEP固体培养基上，28℃培养14～18h，随机挑取分隔良好的几个单菌落，提取Ti质粒。以提取的Ti质粒做模板，用克隆AcInv基因时的特异引物进行PCR扩增，结果从挑选的四个单菌落Ti质粒模板中均扩增出了1.92kb的DNA分子片段(图12泳道2-5)，说明转化获得成功，将此转化鉴定后的农杆菌工程菌命名为LBRA。
2.农杆菌介导的马铃薯转化系统的建立通过对培养基组分、受体Kan敏感性、不同受体材料、预培养时间、农杆菌浓度、浸染时间、共培养时间以及防止转化受体材料的褐化等方面的研究，初步建立了较好的转化体系。本转化体系的主要内容有
①培养基 试管苗茎段和叶片转化的培养基采用1/2MS，激素浓度和配比见表1。薯片培养所加激素种类和使用浓度与试管苗茎段和叶盘培养有一定差别，还需增加有机物附加成分，包括激动素(KT)、叶酸、生物素、2，4-D和水解酪蛋白等。
②受体材料 适合于作为转化材料的是试管苗茎段，其诱导愈伤和分化的能力较强(图13-A、D和F)；其次是薯片(图13-B和E)，其中微型薯薯片(图13-B)优于大田薯块薯片，叶盘最差(图13-C)。
③Kan的使用浓度 茎段75mg/L，薯片75mg/L，叶盘为25mg/L。
④预培养时间 以茎段预培养2d，薯片预培养3d转化效率最高。
⑤农杆菌浓度 以OD600为0.5的浓度比较适宜，浸染时间以茎段侵染10min、叶盘5min、薯片3min效果较好。
⑥共培养时间 茎段以2d、叶盘3d、薯片共培养1d。
⑦诱导剂 在固体培养基表面涂以乙酰丁酰酮(AS)和1μmol/L的脯氨酸，对转化有明显的促进作用。
⑧转化材料褐化的预防 防止转化材料褐化，对提高转化效率极为重要。在初期培养阶段(包括预培养、共培养和选择培养初期阶段)置于暗处能有效的防止褐化。如果在培养基中加入2％PVP或水解酪蛋白，则防止褐化的效果更佳。
用以上转化体系使农杆菌介导的rd29A启动子驱动的AcInv反义基因转化茎段，其转化率平均达到了0.501％，比目前报道的马铃薯转化率(0.1％)[王关林等著.植物基因工程原理与技术(第二版).北京科学出版社，2002389-402]提高了5倍。
实施例5 AcInv反义基因转化品系及块茎抗低温糖化效果鉴定采用农杆菌介导法，对目前生产上栽培的马铃薯品种“甘农薯1号”、“甘农薯2号”、“农薯3号”、“Favorita”、“台红”、“大西洋”、“Novaly”、“甘农科院SK13”和“甘农科院92-24-114”等9个品系进行了遗传转化，从“Favorita”、“台红”、“大西洋”和“甘农科院SK13品系”和“甘农薯2号”等五个品种上得到转基因苗。经Southern杂交[王关林等著.植物基因工程原理与技术(第二版).北京科学出版社，2002844-854]检测，来自“大西洋”和“甘农薯2号”的转化苗呈阳性(图14)，将此转化株系命名为“Ac转大西洋”和“Ac转甘2”。
将转基因品系“Ac转大西洋”和“Ac转甘2”进行组织快繁，栽植在温室蛭石中，定期喷洒营养液，在生长60d后收获微型薯(图15)，作为大田种薯。2003年将微型薯种植在甘肃省天祝藏族自治县进行了品系鉴定(图16)。从两转基因品系在田间生长状况来看，其株型、叶型未改变，但与原来品种相比，其生长势较旺，叶色更加深绿，叶片变大，薯型、花色产生变异，如Ac转大西洋株系，其花色为淡紫色(大西洋品种为白花)、薯型变为长椭圆形，芽眉明显变长且略突出(图17)。
成熟块茎收获后，从各转基因品系和相应对照品种中随机取8个块茎，洗净去皮，各称取1g薯肉，立即用液氮速冻、研磨成粉状，转到一2ml离心管，加入1ml 80％乙醇(含10mmol/L Hepes-KOH，pH7.4)80℃提取1～2h，然后按照Stitt等所述方法(Methods Enzymol，1989，174518-552)，取上清液测定还原糖(葡萄糖、果糖)和蔗糖含量。所剩沉淀用冷水洗两遍后进行干燥，然后按照中国食物营养成分分析检测中心提供方法——酶水解法(http//www.fh21.com.cn)测定淀粉含量。干物质含量测定采用烘干称重法。
对转基因品系和对照品系块茎干物质含量、淀粉含量和还原糖含量测定结果表明对照品种“大西洋”块茎的干物质含量为20.19％，淀粉含量为17.7％，还原糖含量为0.49％；转基因品系“Ac转大西洋”块茎的干物质含量为24.53％，淀粉含量为17.9％，还原糖含量为0.08％；其还原糖含量比对照降低了83.7％。对照品种“甘农薯2号”块茎的干物质含量为26.5％，淀粉含量为19.6％，还原糖含量为1.09％；转基因品系“Ac转甘2”品系块茎干物质含量为27.93％，淀粉含量为21.30％，还原糖含量为0.44％；其还原糖含量比对照降低了59.6％。
挑选大小适中的“Ac转大西洋”、“Ac转甘2”、“大西洋”和“甘农薯2号”的薯块，贮藏在低温(4±2℃)条件下6周，然后对块茎的还原糖含量进行测定。冷藏后的“大西洋”块茎还原糖含量为0.92％，“Ac转大西洋”为0.12％，“甘农薯2号”为2.35％，“Ac转甘2”为0.52％。与低温贮藏前的块茎还原糖含量相比，转基因品系的还原糖含量增加了18％～50％，而对照品种的还原糖含量增加了1倍；“Ac转大西洋”块茎的还原糖含量比“大西洋”低86.9％，“Ac转甘2”比“甘农薯2号”低77.8％。说明采用低温诱导启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体转化马铃薯品种是培育块茎抗低温糖化品系的一条有效途径。
表1 试管苗茎段、叶盘培养的三种激素浓度和配比寻优结果外植体 生长激素(mg/L) 愈伤诱导 根分化芽分化NAA 0.2 0.4 06-BA 1.1250 3.4茎段GA300 4.5NAA∶6-BA∶GA31∶5∶0 1∶0∶0 0∶1∶1.2NAA 0.3 0.4 -6-BA 2.25 0 -叶盘GA300 -NAA∶6-BA∶GA31∶6∶0 1∶0∶0 -SEQ ID NO 1的信息序列特征
(A)(长度)958个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 1Hind III1AAGCTTAACG CATGATTTGA TGGAGGAGCC ATAGATGCAA TTCAATCAAA51 CTGAAATTTC TGCAAGAATC TCAAACACGG AGATCTCAAA GTTTGAAAGA101AAATTTATTT CTTCGATTCA AAACAAACTT ACGAAATTTA GGTAGAACTT151ATATACATTA TATGTGTAAT TTTTTGTAAC AAAATGTTTT TATTATTATT201ATAGAATTTT ACTGGTTAAA TTAAAAATGA ATAGAAAAGG TGAATTAAGA251GGAGAGAGGA GGTAAACATT TTCTTCTATT TTTTCATATT TTCAGGATAA301ATTATTGTAG AAGTTTAAAA GATTTCCATT TGACTAGTGT AAATGAGGAA351TATTCTCTAG TAAGATCATT ATTTCATCTA CTTCTTTTAT CTTCTACCAG401TAGAGGAATA AACAATATTT AGCTCCTTTG TAAATACAAA TTAATTTTCG451TTCTTGACAT CATTCAATTT TAATTTTACG TATAAAATAA AAGATCATAC501CTATTAGAAC GATTAAGGAG AAATACAATT CGAATGAGAA GGATGTGCCG551TTTGTTATAA TAAACAGCCA CACGACGTAA ACGTAAAATG ACCACATGAT601GGGCCAATAG ACATGGACCG ACTACTAATA ATAGTAAGTT ACATTTTAGG高盐/脱水/低温/ABA响应元件1651ATGGAATAAA TATCA CAGTTT GAAAGAAAAG GGAAAAAAAG高盐/脱水/低温/ABA响应元件2701AAAAAATAAA TAAAAGATAT AC GAGTTCCAA AAAGCAAAAA751AAAAGATCAA GCCGATACAG ACACGCGTAG AGAGCAAAAT GACTTTGACG801TCACACCACG AAAACAGACG CTTCATACGT GTCCCTTTAT CTCTCTCAGTTATA box851CTCTC CTTAGTGAG ACCCTCCTCT GTTTTACTCA CAAATATGCA
901AACTAGAAAA CAATCATCAG GAATAAAGGG TTTGATTACT TCTATTGGAABamH I951AGGGATCCSEQ ID NO 2的信息序列特征(A)(长度)1920个碱基(B)类型核酸(C)链型双链(D)(拓扑结构)线性序列描述SEQ ID NO 21 ATGGCCACGC AGTACCATTC CAGTTATGAC CTGGAAAACT CCGCCTCCCA51 TTACACATTC CTCCCGGATC AACCTGATTC CGGCCACCGG AAGTCCCTTA101AAATCATCTC CGGCATTTTC CTCTCCTCTT TCCTTTTGCT TTCTGTAGCC151TTCTTTCCGA TCCTCAACAA CCAATCACCG GACTTGCAGA GTAACTCCCG201TTCGCCGGCG CCGCCGTCAA GAGGTGTTTC TCAGGGAGTC TCCGATAAGA251CTTTTCGAGA TGTCGTCAAT GCTAGTCACG TTTCTTATGC GTGGTCCAAT301GCTATGCTTA GCTGGCAAAG AACTGCTTAC CATTTTCAAC CTCAAAAAAA351TTGGATGAAC GATCCTAATG GTCCATTGTA CCACAAGGGA TGGTATCATC401TTTTTTATCA ATACAATCCA GATTCAGCTA TTTGGGGAAA TATCACATGG451GGCCATGCCG TATCCAAGGA CTTGATCCAC TGGCTCTACT TGCCTTTTGC501CATGGTTCCT GATCAATGGT ACGATATAAA CGGTGTCTGG ACTGGGTCCG551CTACCATCCT ACCCGATGGT CAGATCATGA TGCTTTATAC CGGTGACACT601GATGATTATG TACAAGTGCG AAATCTTGCG TACCCCACCA ACTTATCTGA651TCCTCTCCTT CTAGACTGGG TCAAGTACAA AGGCAACCCG GTTCTGGTTC701CTCCACCCGG CATTGGTGTC AAGGACTTTA GAGACCCGAC CACTGCTTGG
751 ACCGGACCCC AAAATGGGCA ATGGCTTTTA ACAATCGGGT CTAAGACTGG801 TAAAACGGGT ATTGCACTTG TTTATGAAAC TTCCAACTTC ACAAGCTTTA851 AGCTATTGGA TGAAGTGCTG CATGCGGTTC CGGGTACGGG TATGTGGGAG901 TGTGTGGACT TTTACCCGGT ATCGACTGAA AAAACAAACG GGTTGGACAC951 ATCATATAAC GGCCCGGGTG TAAAGCATGT GTTAAAAGCA AGTTTAGATG1001ACAATAAGCA AGATCACTAT GCTATTGGGA CGTATGACTT GACAAAGAAC1051AAATGGACAC CCGATAACCC GGAATTGGAT TGTGGAATTG GGTTGAAGCT1101GGATTATGGG AAATATTATG CATCAAAGAC ATTTTATGAC CCGAAGAAAC1151AACGAAGAGT ACTGTGGGGA TGGATTGGGG AAACTGATAG TGAATCTGCT1201GACCTGCAGA AGGGATGGGC ATCTGTACAG AGTATTCCAA GGACAGTGCT1251TTACGACAAG AAGACAGGGA CACATCTACT TCAGTGGCCA GTTGAAGAAA1301TTGAAAGCTT AAGAGCGGGT GATCCTATTG TTAAGCAAGT CAATCTTCAA1351CCAGGTTCAA TTGAGCTACT CCATGTTGAC TCAGCTGCAG AGTTGGATAT1401AGAAGCCTCA TTTGAAGTGG ACAAAGTCGC GCTCCAGGGA ATAATTGAAG1451CAGATCATGT AGGTTTCAGC TGCTCTACTA GTGGAGGTGC TGCTAGCAGA1501GGCATTTTGG GACCATTTGG TGTCGTTGTA ATTGCTGATC AAACGCTATC1551TGAGCTAACG CCAGTTTACT TCTACATTTC TAAAGGAGCT GATGGCCGAG1601CTGAGACTCA CTTCTGTGCT GATCAAACCA GATCCTCAGA GGCTCCGGGA1651GTTGCTAAAC AAGTTTATGG TAGTTCAGTA CCCGTGTTGG ACGGTGAAAA1701ACATTCGATG AGATTATTGG TGGACCACTC AATTATGGAG AGCTTTGCTC1751AAGGAGGAAG AACAGTCATA ACATCGCGAA TTTACCCAAC AAAGGCAGTG1801AATGGAGCAG CACGACTCTT CGTTTTCAAC AATGCCACAG GGTCTAGCGT1851GACTGCCTCC GTCAAGATTT GGTCACTTGA GTCGGCTAAT ATTCAATCCT1901TCCCCTTGCA AGACTTGTAA
权利要求
1.一种包含有拟南芥Rd29A基因启动子和马铃薯块茎酸性转化酶基因cDNA的载体pBIAc，其特征在于该载体的Rd29A基因启动子和AcInv基因定向连接在一起，Rd29A基因启动子位于反向AcInv基因的上游，使AcInv基因被Rd29A基因启动子所驱动。
2.一种如权利要求1所述的载体，其中Rd29A启动子核苷酸序列为SEQ IDNO 1。
3.一种如权利要求1所述的载体，其中酸性转化酶基因核苷酸序列为SEQ IDNO 2。
4.一种构建如权利要求1-3所述任一载体的方法，所述载体包括具有权利2和3所述核苷酸序列任一片段所构建的载体。
5.一种含有如权利要求1-3所述任一载体的微生物克隆。
6.一种权利要求1-3所述任一载体的用途，其特征在于以各种基因导入方法，包括农杆菌介导法和直接导入法等转化系统转化马铃薯任一品种，用以抑制马铃薯块茎低温糖化现象的发生。
7.一种以农杆菌介导法转化马铃薯材料，将权利要求1-3所述任一载体导入马铃薯品种，培育块茎抗低温糖化品系的方法，该方法包括(1)农杆菌介导的转化受体材料是马铃薯普通栽培种品种；(2)所使用的转化组织是马铃薯普通栽培品种茎段、叶片、薯块等。
全文摘要
一种低温诱导型启动子驱动的AcInv反义基因植物表达载体构建及抗低温糖化马铃薯品系培育方法，从拟南芥菜叶片克隆了低温诱导型Rd29A启动子和马铃薯普通栽培种块茎酸性转化酶基因cDNA；用Rd29A启动子片段替换植物表达载体pBI121上的组成型表达启动子－CaMV 35S启动子，并将AcInv基因cDNA片段反向插入到Rd29A启动子和NOS终止子之间，建成了Rd29A启动子驱动的低温诱导型AcInv反义基因植物表达载体pBIAc；用直接导入法转化农杆菌LBA4404，获得了由低温诱导型Rd29A启动子驱动的AcInv反义基因农杆菌工程菌。还提供了一种利用低温诱导型Rd29A启动子驱动的AcInv反义基因农杆菌工程菌转化马铃薯品种，培育块茎抗低温糖化品系的方法。利用该方法，获得了“Ac转大西洋”和“Ac转甘2”两个转基因品系，其中“Ac转大西洋”块茎还原糖含量为0.08％；“Ac转甘2”块茎还原糖含量为0.44％。在低温(4℃±2℃)贮藏6周后，“Ac转大西洋”品系块茎还原糖含量为0.18％；“Ac转甘2”品系块茎还原糖含量为0.52％。
文档编号C12N5/10GK1618976SQ200410068868
公开日2005年5月25日 申请日期2004年7月13日 优先权日2004年7月13日
发明者张金文, 王蒂, 孟亚雄, 关彦荣, 王清, 黄慧英, 于品华, 白斌, 王旺田, 李学才, 张宁 申请人:甘肃农业大学