专利名称：嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种来源于超嗜热细菌 FemVfo6a"m'ww c/w"g6m'o/w CBS-1的嗜热脂肪酶基因、由该基因重组载体在常 温宿主中表达的嗜热脂肪工程菌，以及利用该工程菌构建的嗜热脂肪酶及该嗜热 脂肪酶在工业中的应用。
背景技术：
生物催化技术的深入研究与广泛应用，是继生物制药和生物科技农业之后， 生物技术发展的"第三次浪潮"和重要支柱，这一技术的核心就是生物催化剂的开 发。而酶作为生物催化剂已经广泛应用于化工、食品、医药、轻工业等领域。但 是工业生产所需的苛刻条件和酶稳定性之间的矛盾，长久以一直在制约着酶技术 的发展和应用。近些年来随着人们对极端环境和微生物的深入研究，发现来源于 超嗜热微生物的嗜热酶在高温下显示了良好的热稳定性和活性。因此，嗜热酶的 研究开发与应用可以很大程度的缓解现代工业中的苛刻反应条件和酶稳定性之 间的矛盾。嗜热酶将在现代工业技术领域呈现巨大的应用潜力，将会大大推动生 物技术产业的快速发展。自1985年第一种嗜热酶即TaqDNA聚合酶被成功地用于 聚合酶链式反应(PCR)后，生长在特殊高热环境下的微生物正日益引起人们的 重视。在美国、日本、德国等地有20多个研究课题组正活跃于寻找嗜极菌及极 端酶。近些年来，许多水解酶类的嗜热酶相继得到了开发，并在许多领域发挥了 重要作用。嗜热酶不仅具有化学催化剂无法比拟的优点，如催化效率高和底物专 一性强，而且酶的稳定性极好。它可以克服中温酶(mesophilicenzyme, 20-55°C) 及低温酶(psychrophilic enzyme, -2-20°C)在应用过程中常常出现的生物学性 质不稳定的现象，从而使很多高温化学反应得以实现，这将极大地促进生物技术 产业的发展，带动技术水平和生活质量的提高。利用嗜热酶作为生物催化剂有如下优点(1)酶制剂的制备成本降低。因为 嗜热酶的稳定性高，因而可以在室温下分离提纯和包装运输，并且能长久地保持 活性；(2)加快动力学反应。随着反应温度的提高，分子运动速度加快，酶催化 能力加强；(3)减少了能耗。因为在高温情况下反应，因此对反应器冷却系统的要求标准降低；(4)提高了产物的纯度。在嗜热酶催化反应条件下(超过7(TC)， 很少有杂菌生存，从而减少了细菌代谢物对最终产物的污染。由于嗜热酶的高温 反应活性，以及对有机溶剂、去污剂和变性剂的较强抗性，使它在食品、医药、 制革、石油开采及废物处理等方面都有广泛的应用潜力。脂肪酶(lipase，E.C.3.1丄3)全称为三酰基甘油酯水解酶(triacylglycerol acylhydrolase)，是指能在油水界面上水解脂肪的酶。脂肪酶催化三酰基甘油酯 反应式月旨肪酶 月旨脉脇 三酰基甘油酯^=^二酰基甘油酯+脂肪酸:气月旨肪酵单酰基甘油酯+脂肪酸^——^甘油+脂肪酸因为脂肪酶在工农及医药等很多方面有十分重要的作用，脂肪酶基因的研 究引起人们的关注，迄今为止，人们己经对多种脂肪酶的基因进行了克隆和研 究。但不同菌属细菌的脂肪酶基因差别很大。即使同一属各种之间的同源性也 很差。目前研究结果表明，脂肪酶是一种丝氨酸酶类，其发挥生物活性需要通 过Ser， Asp禾卩His或Ser， Glu和His组成的三联体电子中继网来完成。除此 之外，有些种类的脂肪酶还需要一个额外的Ala的存在才能发挥高催化活性。 虽然脂肪酶蛋白的氨基酸序列总体的同源性不高，但底物结合部位的氨基酸序 列的同源性较高，绝大多数已知序列的脂肪酶蛋白均含有Gly-Xxx-Ser-Gly这 样一小段保守序列，而有的如枯草杆菌的脂肪酶含有Ala-Xxx-Ser -Xxx-Gly这 样一段序列。第一个Xxx为His或Gly，第二个Xxx为Met、 Glu、 Leu或是 Ala。同时这五个氨基酸附近的十个氨基酸具有较高的同源性。迄今为止，绝大多数脂肪酶都来源于常温微生物或一般嗜热微生物，很多 脂肪酶尽管具有较好的催化活性，但是却无法适应工业上较高温度的反应体 系，而来源于超嗜热微生物的脂肪酶具有良好的热稳定性和高温发挥催化活性 的特性，因此，嗜热脂肪酶的开发研究具有非常好的工业应用前景。发明内容本发明的目的之一是提供一种具有酯水解功能的嗜热脂肪酶基因； 本发明的另一个目的是利用上述嗜热脂肪酶基因通过生物工程技术构建一 种嗜热脂肪酶工程菌；本发明的再一个目的是利用上述嗜热脂肪酶工程菌制备一种稳定性好、耐热 性强、催化效率高的嗜热脂肪酶；本发明的最后一个目的是通过对嗜热脂肪酶的理化性质的研究，提供嗜热脂 肪酶在工业生产中的多种用途。超嗜热细菌Fen;zWo6ac^7'wm c/wf"gkn'cwm CBS-1来源于中国长白山温泉水 的沉积物，最适生长温度为75 8(TC。在前期工作中我们发现该菌在胞内和胞外 所表达的蛋白都具有酯水解的活力，因此推断该菌的基因组中含有多个具有酯水 解功能的基因。但是，由于超嗜热细菌属于高温厌氧型细菌，生长条件苛刻，人 工培养困难，生长周期相对较长，而且其菌体密度低(OD600S1.0),表达的嗜 热脂肪酶含量非常低，因此从成本上来讲直接利用超嗜热细菌培养物来生产嗜热 脂肪酶是不可行的。然而，将嗜热脂肪酶基因转入可快速繁殖、培养条件简单的 常温宿主如大肠杆菌内，能够有效地解决上述问题。对来源于中国长白山温泉的超嗜热细菌FemWo6a"m'ww ctong^Zcww CBS-1通过菌体培养、目的基因钓取，则得到本发明所述的嗜热脂肪酶基因，我 们委托宝上海生工生物技术有限公司进行基因测序，测序结果如图2所示，核酸 序列如SEQ ID NO.l所示。将本发明的嗜热脂肪酶基因与表达载体重组，形成重组表达载体，本发明不 限于特定的表达载体(pET-lla, pET-28a或pET-20b等系列pET表达载体)，优 选的表达载体采用真核或原核表达载体，进一步优选的为pET-15b表达载体。上述重组表达载体可按生物学常规方法导入适宜的宿主细胞，适宜的宿主细 胞包括原核细胞和真核细胞。本发明不局限于任何特定的宿主细胞，只要它能够 表达所述重组表达载体。在一优选实施方案中，本发明使用五.co// BL21(DE3) codonplus (BLp,购买于Stratagene公司)菌株或BL21(DE3)菌株。我们将上述嗜热脂肪酶基因装载在pET表达系统载体上，然后转入到大肠 杆菌宿主中，得到一株工程菌FCL1。该工程菌菌株已于2007年10月15日保藏 于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京巿朝阳区大屯路，中国 科学院微生物研究所，100101)，保藏编号为CGMCCNo.2195。分类命名大肠 埃希氏菌(foc/ e"'c/n'" co//)。工程菌表达产物分为细胞可溶性蛋白和细胞膜结合蛋白两部分。有以下两种处理方法 一、通过细胞超声破碎和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可分离纯化得到 细胞可溶性嗜热蛋白，再以0.2%脱氧胆酸钠(DOC)溶解超声破碎后细胞碎片和加热失活大肠杆菌杂蛋白即可得到与膜结合的嗜热蛋白；二、通过大肠杆菌直 接热破碎的方法释放嗜热蛋白，可以得到50%以上纯度的嗜热蛋白。在本专利工 程菌发酵的后处理中，我们推荐第二种方法，操作简单可节约成本。应用大肠杆菌工程菌(FCL1)表达的嗜热蛋白经活性实验鉴定，它具有水 解系列甘油三酯和单酯活力，而且还具有催化聚酯合成和酯交换等多种脂肪酶相 关的反应。该嗜热蛋白即为本发明所述的嗜热脂肪酶，它是首例报道的来自超嗜 热微生物的脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ IDN(X2所示。相比一般来源的脂肪 酶，它具有非常明显的稳定性优势，6(TC保温48小时仍然保持90。/。以上活力， 7(TC的半衰期为8.5小时，而一般脂肪酶在7(TC中的半衰期都小于2小时；另外 该嗜热脂肪酶能在高温下(70~85°C)催化反应，运用到生产中，有储运成本低、 加快动力学反应、对反应器冷却系统要求标准低等优点。以上技术方案中所有基本分子生物学操作均参照"分子克隆实验指南"(第 三版，科学出版社，2002年)。本发明的嗜热脂肪酶催化反应所利用的底物范围不局限于任何指定的酯类 和脂肪类、有机酸和醇类等物质，只要能参与酯水解、酯合成、转酯反应发生的 化学物质都可以。在一优选实施方案中，本发明使用对硝基苯酚脂肪酸酯和三甘油脂肪酸酯作为底物，进一步优选的底物为对硝基苯酚癸酸酯和十二垸酸甘油三 酯。
图1:嗜热脂肪酶基因PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱； 图2:嗜热脂肪酶基因测序图谱； 图3:重组表达载体构建示意图；图4:纯化得到的嗜热脂肪酶的SDS-PAG电泳图谱；图5:嗜热脂肪酶的温度-活力曲线；图6:嗜热脂肪酶的pH-活力曲线；图7:嗜热脂肪酶的温度曲线；图8:嗜热脂肪酶的8pH稳定性曲线。如图1所示，左道为DNA分子Marker DL2000，右道为嗜热脂肪酶基因的PCR 扩增产物，右道在分子量950bp处有明显亮带，与预期的分子量945bp相符，所以我们通过PCR方法所钓取的基因即为本专利所述嗜热脂肪酶基因。如图2所示，此图为上海生工生物技术有限公司提供的嗜热脂肪酶基因的测 序文件，图(a)为下游测序结果，图(b)为上游测序结果，测序时上游和下游各测 一个反应(约600bp)，进一步可以用Gene-man软件组装得到全长的嗜热脂肪酶 基因(945bp)。如图3所示，将pET-15b载体(A)和嗜热脂肪酶基因的PCR产物(B)都用 限制性内切酶Nde I， BamH I进行双酶切(载体另需去磷酸化)，然后在16'C应 用T4DNA连接酶来连接已酶切的脂肪酶基因片段和载体片段，即得到含有嗜热脂 肪酶基因的重组载体(C)。如图4所示，从左往右依次NI亲和层析所得的纯酶、蛋白质分子量Marker 和热破碎粗酶。
具体实施方式
实施例l:嗜热脂肪酶工程菌的构建及其酶的表达(1)超嗜热细菌Fen;/ctoto"en'wm c&awg6a/cwm CBS-1的培养及其染色体 DNA的提取。每升Ferv/(io6fl"eWMW c/^"gkn'cww CBS-1的培养基组成成分如下 (NH4)2S04,1.3 g; KH2P04, 0.28 g; MgS04'7H20, 0.25 g; CaCl2， 0.07 g; FeS04-7H20， 0.028 g; MnCl2， 1.8 mg; Na2B407,4.5 mg; ZnS04.7H20， 0.22 mg; CuS04-2H20,0.05 mg; NaMo04-2H20， 0.03 mg; CoCl2， 0.01 mg;酵母抽提物，1 g;蛋白胨，2 g; 0.1 %(v/v)刃天青(resazurin)。培养基高温高压灭菌后分装，每100ml培养基中注射加入0.5ml己灭菌的 10%Na2S (营养盐)溶液。Fen;Wo6""m'ww cte"g6m'CMw CBS-1 (菌种保藏号DSM17883, JCM13353) 的干细胞加入1ml上述培养基，重悬后转移至装有10mL新鲜上述培养基的培养 管中，稍微旋转培养管以混匀；通入氮气3分钟以除尽培养管内的氧气，之后置 于高温培养箱中80。C静止培养2天。然后转移至装有100ml上述培养基的厌氧 培养瓶中80。C静止培养2天，8000rpm离心20分钟收集上述嗜热菌体，-40°。保 存菌体备用。取0.2g上述收集的菌体，用200nL的25mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.0,含50mmol/L葡萄糖、10mmol/LEDTA)重悬菌体，加入50^1的50mg/ml溶菌酶，4°C 消化1小时；加入50^1的SDS溶液(终浓度为2%)反应10分钟；加入与上述溶 液等体积(300^1)的酚氯仿异戊醇(体积比为25: 24: 1)，上下颠倒充分 混匀，12000rpm离心5分钟，将上清液转移到另一支离心管中；向上清中加入 2倍体积的无水乙醇，沉淀菌体DNA， 12000rpm离心5分钟，倒去上清后，用 70%的乙醇洗涤DNA，再用95%乙醇洗涤DNA后37。C放置5分钟以除尽乙醇； 最后用100ul pH8.0的lxTE溶液重新溶解，取5ul溶液用0.8%的琼脂糖核酸凝 胶电泳鉴定所得染色体DNA的浓度和大小，在分子量20Kb左右有一条亮带， 为所得的染色体DNA，即本专利所述的嗜热脂肪酶基因的PCR扩增模板，-20°C 冰箱中备用。(2)引物设计及用PCR法钓取酶的基因制备重组载体本专利所述的嗜热脂肪酶基因通过PCR方法从步骤(1)所得染色体DNA 中扩增而得到。两个引物是根据该基因的序列及表达载体的多酶切位点而设计 的，委托上海生工生物技术有限公司合成。上游引物GCACTACATATGTCAAGAATAGTAGAGTATG，划线部分为Nde I位点；下游引物AGTCTAGGATCCTCACTCCAGAATATCGATGAG，划线部分为 BamHI位点。两个引物所设置的酶切位点与表达载体pET15b的Ndel和BamHI相匹配， 适合于在大肠杆菌中高效表达。PCR反应在IOO[U反应体系中含lpl Ex-Taq DNA聚合酶，10^1 Ex-Taq DNA 聚合酶缓冲液，1.5^1 dNTP混合物(每种核苷酸浓度25nmol/L)， 4pl染色体 DNA， lpl上游引物，1^1下游引物，81.5^1超纯水。每循环中94X:变性0.5分 钟，55'C退火1分钟，72'C延伸1分钟，最后一次循环延至10min,共35个循 环。用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，分子量与预期的(945bp) —致， 如图1所示。使用PCR产物纯化试剂盒(Bay Gene公司生产的PCR Clean-up Kit,步骤 如下向PCR溶液中加入三倍体积的Buffer PCR-A，混匀；将上述溶液加入到 DNA-prep柱子中，12000rpm离心30秒；向DNA-prep柱子中加入500n旧uffer W2， 12000rpm离心1分钟，再重复一次；把DNA-prep柱子转移到干净的1.5ml microfogetube，加入灭菌的去离子水，室温放置一分钟后12000rpm离心1分钟即得到纯化的PCR产物)对扩增产物进行纯化，-20匸保存备用。将纯化的PCR产物用限制性内切酶BamH I酶切(20ul反应体系10ul上 述PCR产物，5ul去离子水，2ul 10xK缓冲液，lul BamH I酶)，37。C下保温1 小时后，直接加入1^1 Nde I ，再在37'C下保温1小时。酶切完毕，在1.0 %的 琼脂糖凝胶上电泳，应用DNA凝胶检测试剂盒回收酶切后的DNA片段。1.0% 的琼脂糖核酸凝胶电泳检测凝胶回收的DNA片段大小约950bp，与目的DNA片 段945bp大小相符，说明所得DNA为目的DNA。将pET-15b载体(大肠杆菌表达载体，含有T7强启动子、N-末端组氨酸标 签以及氨苄青霉素抗性基因等)用限制性内切酶BamHI酶切(20ul反应体系 10ulpET-15b载体，5ul去离子水，2ull0xK缓冲液，lulBamHI酶)，37。C下保 温1小时后，直接加入1^1 Nde I ，再在37匸下保温1小时。酶切完毕，再用碱 性去磷酸化酶(CIAP)处理，在0.8%琼脂糖凝胶中检测线性载体并提纯酶切后 的载体。在16'C应用T4DNA连接酶来连接已酶切的脂肪酶基因片段和载体片 段，得重组载体。将重组载体转入Eco// BL21(DE3) Codon Plus中，用含氨苄青霉素的琼脂糖 平板进行单克隆菌株的筛选和鉴定。从菌落中提取重组子，用限制性内切酶Nde I和BamH I作用重组子质粒，得到不同大小两个片段，其分别与脂肪酶基因(945bp)禾G pET15b/Ndel+BamHI酶切(约5700bp)的片段大小一致，表明挑 取的重组子为阳性转化菌，重组载体的构建过程如图3所示。 (3)重组载体在宿主细菌中的表达 重组载体可转化到BL21(DE3)和BL21 (DE3) Codon Plus等宿 主细胞中，都能高效表达嗜热脂肪酶，其中在Eco"BL21 (DE3) CodonPlus中 表达的嗜热脂肪酶含量较高。大肠杆菌感受态细胞制备及其载体转化方法参照"分子克隆实验指南" 一书。挑取步骤2中已经鉴定的阳性转化菌，置5 ml含 氨苄青霉素的2YT培养液(含1.6% (w/v)蛋白胨，1% (w/v)酵母抽提物和 0.5% (w/v) NaCl)中37'C振荡培养过夜，次日接种到100ml新鲜2YT培养基 中，37。C继续培养4 h。将初步放大的种子液以1% (v/v)的比例接入2 L的2YT 培养液中，在空气摇床震荡培养G7'C， 120rpm/min)。待菌体生长到00600为 0.6 1.0时，加入100mM的异丙基硫代P-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度为lmM， 降低培养温度至27'C，对菌体进行诱导使其产生大量目的蛋白，培养10-12小时 后收获菌体，得到本发明所述工程菌。该工程菌菌株已于2007年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2195。分类命名大肠埃希氏菌(&c/2en'cWaco/0。 本发明提供的CGMCC No. 2195菌株的特征如下1. 菌体形态特征菌体为短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。2. 培养特征菌落为白色，有明显突起，边缘整齐。液体培养可以在普通 摇床中进行，发酵液浑浊，液面不产生膜。3. 生理生化特征生长pH值为5.0 9.0;生长温度为10 42°C。可利用葡 糖糖，麦芽糖，乳糖，甘露糖，山梨醇，甘露醇，玉米桨等糖醇类物质作为唯一 碳源。4. 菌株培养条件平板培养需在含1.5V。琼脂糖的2YT培养基，液体培养可 以在普通摇床中进行，最适培养温度37'C，最适pH7.0。5. 培养基固体纯化培养基2YT琼脂培养基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g， NaC15.0g， 15g琼脂糖，蒸馏水1000mL。液体增殖培养基2YT培养基，包括蛋白胨16.0g，酵母抽提物10.0g， NaCl 5.0g，蒸馏水1000mL。根据"伯杰系统细菌学手册"(Bergy's Manual of Systematic Bacteriology)第 八版提供的鉴定方法和上述试验结果表明，上述菌株仍属大肠埃希氏种。把菌体于-40'C冷冻1小时，融化，加入菌体6倍体积的50mM磷酸缓冲液 (pH8.0)，重悬混匀；将菌液于7(TC加热处理20分钟，离心除去变性的大肠杆菌 杂蛋白(12000rpm， 20min)，收集上清得重组酶的粗酶液。因为重组嗜热酶N-末端含有His-Tag，应用镍亲和柱(Ni-Chelating Column) 对重组蛋白进行分离，用lOOmM咪唑洗脱与层析柱结合得到纯的嗜热酶。应用 SDS-PAGE (10%)电泳检测重组蛋白的纯度，可见在33000Da附近可见一电泳 条带，结果如图4所示。实施例2:重组嗜热脂肪酶的特性 (1)最适反应温度反应温度是影响酶催化活力的重要因素。 一般而言，嗜热脂肪酶在高温下的 反应活力远远高于低温，但是在最适温度附近的稳定性却大大地降低，对本专利所述嗜热脂肪酶的催化活力检测的温度范围为20~90°C。以对硝基苯酚辛酸酯作为反应底物，在20 90'C的温度范围内测定脂肪酶活 力，以酶活的相对活力对温度作图。由图5可见，其活力在20 78'C温度范围内 随温度的升高而提高，在78'C以上，活力下降，最适温度为78'C。酶活性的检测以对硝基苯酚辛酸酯作为脂肪酶水解底物，反应体系为lml, 缓冲体系为50mM磷酸缓冲液(pH8.0)，对硝基苯酚辛酸酯的终浓度为0.2mM， 加入5ul 0.1mg/ml的酶，78'C测定1分钟内OD4()5的增加值，求出直线的斜率， 即为酶的活力。1个酶活力单位定义为1分钟水解底物生成lfimol对硝基苯酚 (s-O.OM^UV^.cm-1)所需要的酶量。(2) 最适pH环境pH值会影响酶分子中带电氨基酸的解离状态和酶的构象，进而影响酶 的催化活力。酶的最适pH是在宽范围pH缓冲液体系中测定，其成分如下乙 酸、N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPS)、 N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸 (TAPS)、 3-环已胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES)。在78。C条件下 精确配制100mM不同pH的缓冲液，以对硝基苯酚辛酸酯作为底物，在78'C下 测定嗜热酶在pH 5.5-10范围内的活力，以酶活的相对活力对pH作图。实验结 果如图6所示，在pH值7.0至8.5之间能够有效地催化对硝基苯酚辛酸酯的水 解，且表明本专利所述的嗜热脂肪酶最适pH为8.0。(3) 底物特异性称取各种对硝基苯酚脂肪酸酯，将它们分别溶于乙腈配成1Ommol/L的底物 溶液，参照(1)所述脂肪酶测定条件进行酶活力测定。甘油三酯底物的测定方法如下以4%的聚乙烯醇为乳化液，分别配制 100mM的各种甘油三酯底物的溶液，在10ml反应体系中加入5ml乳化的底物溶 液、4ml磷酸缓冲液(pH8.0)和lml (浓度1.0mg/ml)酶液。70。C反应10分钟 后，立即将反应液放入冰上并加入10ml乙醇终止反应，再加入100ul 0.1%酚酞 溶液作为指示剂，以已标定的50MmNaOH滴定到微红为止，记录消耗的NaOH 体积，根据公式计算得出脂肪酶的活力。1个酶活力单位定义为1分钟水解底物 生成lpmol脂肪酸所需要的酶量。由表1可知，嗜热脂肪酶对系列对硝基酯和甘油三酯都表现出不同程度的活 力，相对偏嗜中长碳链的底物，以对硝基苯酚辛酸酯和十二垸酸甘油三酯作为底 物是催化活力最高。因此可见，中长链的脂肪酸酯是酶的适宜底物。中长链的脂肪酸酯广泛存在于油脂及化工产品中，因此本发明所述酶在生物化工、生物柴油、 油脂加工、工具酶等领域中具有广泛的应用。表l.嗜热酶的底物特异性底物相对活力(°/。)对硝基苯酚已酸酯3.08对硝基苯酚辛酸酯1.03对硝基苯酚癸酸酯29.42对硝基苯酚月桂酸酯100对硝基苯酚肉豆蔻酸酯4.32对硝基苯酚软脂酸酯1.02对硝基苯酚硬脂酸酯—丁酸三甘油酯10.57己酸三甘油酯15.69辛酸三甘油酯25.20癸酸三甘油酯59.35十二烷酸三甘油酯訓十四垸酸三甘油酯19.51十六烷酸三甘油酯24.96橄榄油5.36注对硝基苯酯底物以对硝基苯酚月桂酸酯为100%，甘油三酯底物以十二 垸酸三甘油酯为100%。(4)温度及pH稳定性 将浓度为0.5mg/ml的纯酶液置于不同温度(60°C， 70'C和75"C)下缓冲液 (50mMpH8.0磷酸缓冲液)保温，测定不同保温时间的残余活力。结果如图7 所示，表明该酶在6(TC保温10小时后仍然保持100。/。活力，而且70'C的半衰期 也达到8.5小时，而75。C保温3小时后活力基本消失。这说明该酶在7(TC以下 具有非常好的热稳定性。将浓度为0.5mg/ml的纯酶液放置于50 mM不同pH的宽范围缓冲液(乙酸、 N-2-羟乙基哌嗪-N'-2-乙磺酸(HEPS)、 N-三(羟甲基)甲基-3-氨基丙磺酸(TAPS)、3-环己胺基丙磺酸(CAPS)和2-码啉乙磺酸(MES)中，在室温放置1小时， 70'C测其残余活力。由图8可以看出，该酶在pH5-10范围内稳定性较高，残余 酶活力在80%以上。本发明所公开的内容，相信本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此 前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明 的范围。本领域研究人员在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种 变更和改进。附本发明所涉及嗜热脂肪酶基因核苷酸序列表和由该基因表达的嗜热脂肪酶氨基酸序列表 (1) SEQ ID NO. 1 嗜热脂肪酶基因核苷酸序列表 〈110〉吉林大学<120>嗜热脂肪酶基因、工程菌和嗜热脂肪酶及应用 <160> 2 <210> 1 <211> 945 <212> DNA<213>真细菌(Anaerobic Hyper-thermophilic bacterium, Fervidobacterium changbaicum CBS-l)<220〉<221〉 CDS<222〉 (l)... (945)<柳〉1ATGGAGAATAATACCTTCGTGAGCTTTCTCAAAGTTTTGTTACTAGGAMetGluAsnAsnThrPheValSerPheLeu!>ysValLeuLeuLeuGly151015ACGATTGTGTTTTACATCTCAACACACCTATCAACATCAAGAATAGTAThrlieValPheTyrlieSerThrHisLeuSerThrSerArglieVal202530GAGTATGTTTCACAAGATGCAAAAAAACTCACAATCGAGGGAATTCAAGluTyrValSerGinAspAlaLysLysLeuThrlieGluGlylieGin354045GTTGCTTACAGAGAATACGGAAAAGGTAACTTTGAAACTATAGTGTTCValAla丁yrArgGluTyrGlyLysGlyAsnPheGluThrlieValPhe505560CTACATGGATTCGCCGGTTCTTCTTACGATTGGAAGGTGCTAATTGATLeuHisGlyPheAlaGlySerSerTyrAspTyrLysValleulieAsp65707580GTGCTTTCGGAAAATTATCACTGCATAGCATTTGATATACCACCATTTValLerSerGluAsnTyrHisCyslieAlaPheAsplieProProPhe859095GGTTTATCTGAAAAGAAAAACGACTTTGATTATTCTGACGAATCGATTGlyLeuSerGluLysLysAsnAspPheAspTyrSerAspGluSerlie100105110GTAAGACTCTTAATAAAGTCTTTAGATTCCCTGGGAATAGAG(MTTCValArgLerLerlieLysSerLerAspSerLerGlylieGluGinPhe105120125ACTCTCGTTGGTCATTCGATGGGTGGATACCTTTCACTTGCGATAGCAThrLeuValGlyHisSerMetGlyGlyTyrLeuSerLeuAlalieAla130135140AGCATTATTCCAAAAAGAGTGGAAAGGCTCATTTTATTTGACGCTGCGSerlielieProLysArgValGiuArgLerlieLeuPheAspAlaAla145150155160TACGATGTTAACAGTGAAGATTTACAAAACCCAGGCCCTCCGTTTTyrAspViaAsnSerGluAspLeuGinAsnProGlyProProPheLys165170175CTAAAAGACGAGCACCTACTTAAGTTTTACCAAATATTTCTGGATGTALeuLysAspGluHisLeuLeuLysPheTyrGinliePheLeuAspVia180185190GGTTTGAAAACCTATCCGCTGTTCAAATTCGTTTACCGAAATTCATTAGlyLeuLysThrTyrProLeuPheLysPheValTyrArgAsnSerLeu195200205GCAGAAGGTGJVGATTCTGAATGCCGAAacTTCGACTACTTGTTTTCAAlaGluGlyGlulieLeuAsnAlaGluHisPheAspTyrLeuPheSer210215220CAAAATTACTTTCTACCTGCGGAAATACTCATAAAGTTCACAAAAGACGinAsnTyrPheLeuProAlaGlulieLeulieLysPheThrLysAsp225230235240AAAGCAGCACAGAAACCTTTAAAAATTGATCTTGAGGGTATAACCGCCLysAlaAlaGinLysProLeuLyslieAspLeuGluGlylieThrAla245250255AAAACTCTTATTATTTACGGTGAAAAAGATCAGATAACCCCTCCGTCGLysThrLeulielieTyrGlyGluLysAspGinlieThrProProSer260265270ATAGGTGAGTATTTATCCAAATCAATAAAGAACTCGAAATTTATGTTGlieGlyGluTyrLeuSerLysSerlieLysAsnSerLysPheMetLeu275280285ATTCCAAACGAAGGGCACATGCCTTTATCAAACAGATTAGTTATAGAAlieProAsnGluGlyHisMetProLeuSerAsnArgLeuVallieGlu290295300CTGGTCAGGAAATTCCTCATCGATATTCTGGAGTAG(945)Leu Val Arg Lys Phe Leu lie Asp lie Leu Glu承 305 310 315(2)SEQIDN0.2 嗜热脂肪酶氨基酸序列表<210〉 2<211〉 157<212〉 PRT<213〉古生菌(Aerobic Hyper—thermophilic crenarchaeon, Aeropymm pernix Kl)<400> 2MetGluAsnAsnThrPheValSerPheLeuLysValLeuLeuLeuGly151015ThrlieValPhe 20TyrlieSerThrHis 25LeuSerThrSerArg 30lieValGluTyrVal 35SerGinAspAlaLys 40LysLeuThrlieGlu 45GlylieGinValAla 50TyrArgGluTyrGly 55LysGlyAsnPheGlu 60ThrlieValPheLeuHisGlyPheAlaGlySerSerTyrAspTyrLysValLeulieAsp65707580ValLerSerGluAsnTyrHisCyslieAlaPheAsplieProProPhe859095GlyLeuSerGlu 100LysLysAsnAspPhe 105AspTyrSerAspGlu 110SerlieValArgLer 105LerlieLysSerLer 120AspSerl_erGlylie 125GluGinPheThrLeu 130ValGlyHisSerMet 135GlyGlyTyrLeuSer 140LeuAlalieAlaSerlielieProLysArgValGluArgLerlieLeuPheAspAlaAla145150155160TyrAspViaAsnSer 165GluAspLeuGinAsn 170ProGlyProProPhe 175LysLeuLysAspGluHisLeuLeuLysPheTyrGinliePheLeuAspVia180185190GlyLeuLys 195ThrTyrProLeuPhe 200LysPheValTyrArg 205AsnSerLeuAlaGluGlyGlulieLeuAsnAlaGluHisPheAspTyrLeuPheSer210215220GinAsnTyrPheLeuProAlaGlulieLeulieLysPheThrLysAsp225230235240LysAlaAlaGinLysProLeuLyslieAspLeuGluGlylieThrAla245250255LysThrLeulielieTyrGlyGluLysAspGinlieThrProProSer260265270lieGlyGlu 275TyrLeuSerLysSer 280lieLysAsnSerLys 285PheMetLeulieProAsnGluGlyHisMetProLeuSerAsnArgLeuVallieGlu290295300LeuValArgLysPheLeulieAsplieLeuGlu氺305 310 31权利要求
1、一种嗜热脂肪酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2、 如权利要求1所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于与表达载体pET-lla、 pET-28a或pET-20b重组，构成重组表达载体。
3、 如权利要求2所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于表达载体为pET-15b。
4、 如权利要求2或3所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于重组表达载体导入 五.co// BL21(DE3) codon plus宿主细胞或BL21(DE3)宿主细胞，得到嗜热工程菌。
5、 如权利要求4所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于宿主细胞为 BL21(DE3) codon plus。
6、 如权利要求5所述的嗜热脂肪酶基因，其特征在于得到的嗜热工程菌为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，其于2007年10月15日保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 2195。
7、 一种嗜热脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
8、 权利要求7所述的嗜热脂肪酶在中长链的脂肪酸酯催化中的应用。
全文摘要
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于超嗜热细菌Fervidobacterium changbaicum CBS-1的嗜热脂肪酶基因、由该基因重组载体在常温宿主中表达的嗜热脂肪工程菌，利用该工程菌构建的嗜热脂肪酶及该嗜热脂肪酶在生物化工、生物柴油、油脂加工、工具酶等领域中的广泛应用。本发明所得嗜热脂肪酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，嗜热脂肪酶具有SEQ IDNO.2所示的氨基酸序列，嗜热脂肪工程菌于2007年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2195，分类命名大肠埃希氏菌(Escherichia coli)。
文档编号C12N15/55GK101215571SQ200810050250
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月14日 优先权日2008年1月14日
发明者雁 冯, 搏 宋, 蔡锦刚, 渊 谢 申请人:吉林大学