专利名称：一种嗜热α－淀粉酶的制备纯化方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及重组蛋白质与嗜热酶的提取、纯化。
背景技术：
耐高温α-淀粉酶是工业上最常用的酶制剂之一，广泛使用于食品工业、化工工业中的淀粉加工。寻求与开发耐受高热的淀粉酶长期以来始终是工业酶研究领域的重点与热点课题。全球淀粉处理的酶的市场约为1.5亿美圆，其中用于淀粉液化过程的约占24％。因此，对于淀粉酶生产产率，耐热性以及酶活性的任何提高均具有十分重要的理论意义与直接商业价值。
目前工业上普遍使用的耐热淀粉酶来自于地衣芽孢杆菌，该酶即地衣芽孢杆菌嗜热淀粉酶(BLA，如Taka-therm)的最适催化温度为90℃，最适pH值为7.0-8.0，且需要Ca2+来维持其热稳定。在实际的工业化淀粉加工过程中，需要高于100℃来实现淀粉的液化，淀粉溶液的pH值通常只有4.5左右，另外，Ca2+的加入会影响到后续反应的糖化酶的活性，因此BLA并非最适的淀粉酶。S.Jorgensen与G.Dong等各自独立的从极端嗜热古菌Pyrococcus furiosus克隆并得到极端嗜热α-淀粉酶PFA，研究发现，PFA具有优秀的耐热特性，其最适温度为100℃，在100℃环境下数小时不丧失活力。与此同时，PFA的最适pH为5.5-6.0，不需要Ca2+仍能保持80％以上的活性。优良的酶学特性使PFA具有良好的应用前景和商业开发价值。
Pyrococcus furiosus是从海底火山温泉中的分离得到的绝对厌氧菌，最适生长温度100℃，很难用作工业生产的菌种。由于Pyrococcus furiosus本身培养相对较为复杂，这一淀粉酶的大量制备只能通过外源重组表达来实现。沈微等尝试在大肠杆菌中直接表达或分泌表达，韦宇拓等在酵母中进行分泌表达，但表达量较低，在SDS-PAGE上未能看到表达条带。Dong等克隆了该基因并在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中表达，也遇到表达量偏低的问题。当表达量升高时，重组PFA主要以不溶性的包涵体形式表达，Dong等采用了低温诱导，从菌体破碎上清中纯化得到重组蛋白以提高重组蛋白质的可溶性表达，但提高非常有限。随后Beata等采用与intein融合表达的方式，提高了PFA可溶性表达量，但总的表达量仍不高。Linden等认为，由于重组PFA以包涵体形式表达时表达量远高于可溶性表达，从包涵体中纯化该蛋白质是一种效率更高的方法。他们采用甘油抽提的方法，从包涵体中溶解出有酶活的蛋白，并建立了用疏水柱的一步纯化方法，简化了纯化步骤。尽管如此，甘油抽提方法只能溶解出部分活性蛋白，仍有大量重组蛋白质留在沉淀中被弃掉。甘油抽提方法除了收率方面的因素以外，在过程放大等方面亦存在问题。
因此，本领域迫切需要提供一种新的简便高效、低成本、可放大的重组PFA纯化方法，为重组PFA的大量制备提供了新的途径。
发明内容
本发明旨在提供一种重组的嗜热α-淀粉酶的提纯方法。
本发明的另一个目的是提供一种用上述提纯方法所获得的α-淀粉酶及其用途。
在本发明的第一个方面，提供了一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，它包括步骤(1)将嗜热α-淀粉酶的包涵体在70-100℃的温度下，在pH9-13的碱性溶液中溶解变性，从而获得嗜热α-淀粉酶的变性溶液；(2)将步骤(1)中获得的嗜热α-淀粉酶的变性溶液进行复性，从而获得嗜热α-淀粉酶的复性溶液；(3)从步骤(2)得到的嗜热α-淀粉酶的复性溶液分离出嗜热α-淀粉酶。
在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶是选自下组的嗜热α-淀粉酶火球菌属的嗜热α-淀粉酶、嗜热古菌Pyrococcus furiosus(也译为激烈火球菌)的嗜热α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜热α-淀粉酶以及来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。
在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶是以下菌种所产生的嗜热α-淀粉酶嗜热古菌Pyrococcus furiosus DSM 3638、嗜热古菌Pyrococcus furiosus ATCC43587、Pyrococcus woesei ATCC 49860、或其组合。
在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶是嗜热古菌Pyrococcus furiosus的嗜热α-淀粉酶。
在另一优选例中，获得重组的嗜热α-淀粉酶包涵体的表达载体为T7启动子的表达载体。
在另一优选例中，所述的表达载体为Novagen公司的pET17b(产品号69663-3)、pET21a(产品号69740-3)。
在另一优选例中，获得重组的嗜热α-淀粉酶包涵体的表达宿主为大肠杆菌E.coli。
在另一优选例中，所述的表达宿主为Stratagen公司的大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(产品号230245)。
在另一优选例中，上述制备方法的步骤(1)中，所述的碱性溶液为pH9.5-12.0的缓冲液。
在另一优选例中，步骤(1)中的碱性溶液温度为75-95℃。较佳地80-95℃。
在另一优选例中，步骤(1)中的变性处理时间为0.5-60分钟，较佳地1-20分钟。更佳地2-10分钟。
在另一优选例中，步骤(1)中所述的碱性溶液是pH9-13的Britton-Robinson缓冲液、PBS、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液。
在另一优选例中，上述制备方法的步骤(2)中，复性条件是在15-70℃下，于pH7.5-10.0的缓冲液复性0.5-20小时。
在另一优选例中，步骤(2)中所述的复性溶液是Britton-Robinson缓冲液、PBS、Tris-HCl缓冲液、碳酸盐缓冲液。
在另一优选例中，上述制备方法的步骤(3)中，所述的分离是通过以下方法进行疏水层析、离子交换层析、分子排阻层析或其组合。
在另一优选例中，步骤(3)中的分离是通过以下方法进行疏水层析、离子交换层析。
在另一优选例中，上述制备方法还包括步骤(4)将分离的嗜热α-淀粉酶冻干，制得嗜热α-淀粉酶冻干剂。
在本发明的第二方面，提供了一种由上述的制备方法所获得的嗜热α-淀粉酶。
在另一优选例中，所述的嗜热α-淀粉酶耐受超过100℃或更高的温度，且在100℃数小时以上不丧失其活性(如100℃2小时后活性至少保留90％)。
在本发明的第三个方面，提供了一种上述的嗜热α-淀粉酶的用途，它可用于在超过100℃的高温下，使淀粉水解成为寡糖与单糖的工艺。
由此，本发明提供一种新的简便高效、低成本、可放大的重组嗜热α-淀粉酶的纯化方法。
图1显示了α-淀粉酶基因的PCR扩增产物电泳图，其中MDNA分子量标准；1α-淀粉酶基因的PCR扩增产物。
图2显示了α-淀粉酶表达产物的SDS-PAGE电泳分析，其中M蛋白分子量标准；1IPTG诱导的含pET21a的BL21(DE3)RIL菌体全蛋白；2IPTG诱导的含pET21a-PFA的BL21(DE3)RIL菌体全蛋白；3IPTG诱导的含pET21a-PFA的BL21菌体裂解后的上清；4IPTG诱导的含pET21a-PFA的BL21(DE3)RIL菌体裂解后的沉淀。
图3显示了甘油抽取α-淀粉酶纯化法各步骤的SDS-PAGE电泳分析，其中M蛋白分子量标准；1包涵体；2甘油抽取上清(上样)；3phenylSepharose疏水柱洗脱的活性组分。
图4显示了纯化的α-淀粉酶SDS-PAGE电泳和酶谱分析，其中左图电泳后用考马氏亮兰；右图稀碘液染色；M蛋白分子量标准；1，6纯化蛋白不经加热直接上样；2，5纯化蛋白在100℃加热10分钟后上样；3，4纯化蛋白121℃加热10分钟后上样。
图5显示了本发明溶解包涵体纯化法各步骤的SDS-PAGE电泳分析，其中M蛋白分子量标准；1包涵体；2包涵体溶解上清；3稀释后(上样)；4phenyl Sepharose疏水柱洗脱的活性组分。
具体实施例方式
发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现在碱性和高温条件下(如pH9-13、70-100℃)，只需数分钟就能将重组蛋白(嗜热α-淀粉酶PFA)包涵体溶解，而对蛋白基本上没有破坏作用。然后，经过复性过程，疏水层析分离，就可获得纯化的重组蛋白质。其活性蛋白的回收率大大提高，可达到现有技术(甘油抽提法)的3倍。
可用于本发明的嗜热α-淀粉酶没有特别限制，可以是来自火球菌属的嗜热α-淀粉酶、嗜热古菌Pyrococcus furiosus(也译为激烈火球菌)的嗜热α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜热α-淀粉酶以及来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。所述的嗜热α-淀粉酶是选自下组的嗜热α-淀粉酶在本发明中，所述的嗜热α-淀粉酶可以是天然嗜热α-淀粉酶或其变异体，也可以是重组的嗜热α-淀粉酶。
优选的是来自嗜热古菌Pyrococcus furiosus DSM 3638、嗜热古菌Pyrococcus furiosus ATCC 43587、嗜热古菌Pyrococcus woesei ATCC 49860或其组合的嗜热α-淀粉酶。
适用于本发明的嗜热α-淀粉酶可以是天然的嗜热α-淀粉酶、重组的嗜热α-淀粉酶或其变异体。代表性的嗜热α-淀粉酶包括(但并不限于)由以下基因编码的嗜热α-淀粉酶Genebank登陆号U96622、AF001268、AF177906.1、AE010170.1、AF240464.1、DQ192528.1等。
可用于本发明的包涵体没有特别限制，只要该包涵体含有重组表达的嗜热α-淀粉酶。本发明所用的包涵体可由本领域常规的重组方法获得，其中可以选用本领域常规的各种大肠杆菌宿主菌、质粒、启动子等材料构建重组表达宿主菌，并且在常规条件下发酵，从而获得包涵体。
一种优选的方法为(a)PCR扩增古菌Pyrococcus furiosus DSM3638基因组DNA；(b)用步骤(a)所得的PCR扩增产物构建pET21a-PFA表达载体；(c)将重组质粒pET21a-PFA转化到感受态大肠杆菌中；(d)培养基中培养单菌落；(e)重组菌的发酵培养；(f)离心收集菌体，超声破碎得含重组蛋白(PFA)的包涵体。所用的初始菌种为Pyrococcus furiosus DSM 3638，Pyrococcus furiosusATCC43587；T7启动子的表达载体可选用购自Novagen公司的pET17b(产品号69663-3)、pET21a(产品号69740-3)等；表达宿主选用购自Stratagen公司的BL21-CodonPlus(DE3)-RIL(产品号230245)。
包涵体溶解变性是纯化过程中的最为关键的因素。在大肠杆菌中表达的外源重组蛋白质包涵体，其蛋白质分子间主要通过非共价作用相互结合在一起，这些非共价作用包括疏水作用、范德华力、氢键以及离子键作用，唯一的共价作用是蛋白质分子中半胱氨酸残基间的-S-S-键。最常用的包涵体溶解方法是高浓度的尿素与盐酸胍等变性剂，另外还有包括极端pH条件，温度以及去垢剂等。PFA是一种生物酶分子，纯化过程需要充分考虑成本、工艺便利程度以及可放大性等多种因素。发明人尝试采用在不同pH条件下进行包涵体的溶解过程，发现在高碱性条件下(大于pH12.5)时可以获得满意的包涵体溶解效果，但由于强碱环境对于蛋白质与酶活性具有一定的破坏作用，在随后的疏水柱纯化后获得的总的活性蛋白量不高。发明人摸索了不同温度和pH条件，发现在pH9-13、70-100℃条件下数分钟即能将蛋白包涵体溶解。
溶解后的包涵体可用常规的复性方法进行复性。一种优选的复性方法是将溶解后的包涵体在缓冲液中进行稀释复性，经疏水层析分离得到纯化的重组PFA。经碱性pH溶解复性纯化得到的重组PFA表现出与甘油抽提纯化PFA类似的酶活性。
一种优选的从包涵体中得到嗜热α-淀粉酶的方法包括步骤(1)将重组的嗜热α-淀粉酶包涵体在70-100℃碱性缓冲液中溶解变性0.5-30分钟；(2)将步骤(1)的溶液稀释在pH7.5-9.5的缓冲液中复性；(3)上柱层析步骤(2)得到的溶液进行分离纯化，制得α-淀粉酶。
本发明的增溶过程中所用的溶液没有特别的要求，只需将pH调节到特定的数值。可以使用水或水性溶剂作为溶解步骤的溶剂。合适的缓冲液可以包括(但并不限于)以下种类磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、Tris-HCl、碳酸盐、甘氨酸-NaOH等；优选地同时含有磷酸盐、硼酸盐与醋酸盐，其比例为1∶1∶1。
用于增溶的溶液为碱性，pH9-13，较佳地pH9.5-12.0。
用于增溶的碱性溶液需加热到70-100℃，较佳地85-95℃。
溶解变性的时间没有特别限制，通常为0.5-60分钟，较佳地1-20分钟，更佳地2-10分钟。
同样，嗜热α-淀粉酶的复性可以通过任何适当的缓冲液稀释来完成，缓冲液的pH范围为7.5-9.5，较佳约8.0-9.0。在此稀释步骤中完成复性α-淀粉酶的合适缓冲液包括磷酸盐、硼酸盐、醋酸盐、Tris-HCl、碳酸盐、甘氨酸-NaOH等。经过此步稀释后，进行柱层析分离纯化，可以用疏水层析、离子交换层析、分子排阻层析或其组合进行分离纯化。
本发明的主要优点在于本发明针对重组嗜热α-淀粉酶(PFA)包涵体蛋白质的新纯化方法大幅度提高了重组PFA蛋白质的纯化效率，并具有低成本、方法简便等特点，适合大规模工业化生产。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则所有的百分比和份数按重量计。
实施例1制备嗜热α-淀粉酶PFA材料与方法1、材料菌株及载体Pyrococcus furiosus DSM3638基因组DNA ATCC编号为43587TM；大肠杆菌E.coli DH5α，E.coli BL21(DE3)及E.coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL购自Stratagen公司；pET21a表达载体购自Novagen公司；分子生物学试剂限制性内切酶Nde I、HindIII、Pyrobest DNA聚合酶、T4DNA聚合酶、T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司；蛋白质分子质量标准购自上海生化所；Phenyl Sepharose 6 Fast Flow层析柱材料购自Novagen公司；胶回收试剂盒购自华瞬生物工程有限公司；引物合成由上海博彩生物公司完成DNA测序由英骏生物技术有限公司完成其他试剂均为分析纯。
2、方法(1)PCR扩增PFA基因根据GenBank中PFA的基因序列设计引物，以ATCC编号为43587TM的Pyrococcus furiosus DSM3638基因组DNA为模板进行PCR扩增，引物序列见表1。
表1引物序列
由于该基因N端26个氨基酸为分泌引导肽，其存在会影响活性，所以发明人从编码第27个氨基酸的位点开始扩增，并在下游引物的5’端设计了HindIII酶切位点，以便于连接入载体pET21a；扩增程序为94℃变性3min，94℃1min，55℃1min，72℃2min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存。
(2)pET21a-PFA表达载体的构建PCR扩增产物HindIII酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，胶回收试剂盒回收，pET21a以Nde I酶切，以T4DNA聚合酶补平，再以HindIII酶切，胶回收试剂盒回收，以T4DNA连接酶连接回收PCR片段和载体，转化E.coli DH5α感受态，菌落PCR方法鉴定转化子。阳性转化子送到英骏生物技术有限公司测序。测得的DNA序列翻译为蛋白质序列，与GenBank收录的PFA蛋白序列对比完全相同。
(3)重组大肠杆菌的诱导表达与分析将测序正确的重组质粒pET21a-PFA转化到E.coli BL21(DE3)和Ecoli BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中，同时转化pET21a作对照。挑单菌落接种于液体LB中(含100μg/ml氨苄青霉素、BL21(DE3)RIL中另添加50μg/ml卡那霉素)，过夜培养，以1％接种于液体培养基培养3小时，至OD600达到0.7时，加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度1mmol/L，诱导4小时。离心收集菌体，重悬于50mmol/L Tris-HClpH7.5、100mmol/L NaCl(缓冲液A)的缓冲液，超声破碎，离心收集上清，用1/5体积相同缓冲液重悬沉淀。分别取菌体及超声离心后得到的上清和沉淀重悬液，以2×上样缓冲液处理，SDS-PAGE电泳分析表达产物。
(4)表达产物的纯化诱导后收集菌体超声破碎，离心后弃去上清，包涵体用缓冲液A洗涤，离心弃去上清。
方法1120mg湿重包涵体悬浮于20ml含20％甘油的50mM醋酸钠缓冲液，室温搅拌4小时，离心取上清，反复三次，上清合并待上柱。
方法2120mg湿重包涵体悬浮于6ml 120mM Britton-Robinson(pH 10.5)缓冲液(内含磷酸盐、硼酸盐与醋酸盐)中，90℃水浴3分钟，大多数蛋白溶解，置冰浴中冷却。离心，上清稀释于54ml 120mM Britton-Robinson(pH 8.5)缓冲液中待上柱。
样品上样于用同样缓冲液平衡的Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析柱，以含0-50％乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸钠缓冲液梯度洗柱，用含50％乙二醇的50mmol/L，pH6.0醋酸钠缓冲液洗脱，流速1ml/min，收集洗脱液，同时A280检测。以Lowry法对纯化后的目的蛋白进行浓度测定。
(5)淀粉酶活力测定方法用常规的DNS法进行测量，参照文献(BernfeldP.Amylases α-and β-.Methods Enzymol，1955，1149-158)，将稀释的酶液加入到0.5ml含1％淀粉的50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液中，100℃反应15min，迅速放入冰水浴中终止反应。加入0.5ml DNS试剂(1g 3，5-二硝基水杨酸溶解于20ml 2mol/LNaOH中，加入30g酒石酸钠钾，稀释至100ml；I2-KI溶液1％碘，10％碘化钾，50％甲醇)，沸水煮5分钟，冷水冷却，加入5ml水，用分光光度计检测在波长546nm的吸光度，以葡萄糖与DNS试剂反应作标准曲线。以1分钟降解淀粉产生1umol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位(U)；(6)淀粉酶酶谱检测将酶液对称上样进行SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，从中间切开，一半进行考马斯亮蓝染色，另一半置于50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液中，40℃水浴15分钟，将溶液换成含1％淀粉的50mmol/L，pH5.0醋酸钠溶液，100℃加热30min，浸入I2-KI溶液显色。根据透明条带出现的位置，对照考马斯亮蓝染色结果，确定淀粉酶的酶带。
结果1.pET21a-PFA表达载体的构建用设计的引物扩增出约1.3kb的片段与预期的PFA的1301bp大小相符(图1)，将扩增出的片段用HindIII酶切，回收后，与经Nde I酶切、补平再经HindIII酶切的载体pET21a进行一端平端一端粘端的连接，连接产物转化到DH5α感受态细胞，经菌落PCR鉴定阳性后进行测序，经测序验证后转化到BL21(DE3)及BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行表达。
2.PFA蛋白的表达将重组质粒分别转化到大肠杆菌菌株BL21(DE3)和BL21-Codon Plus(DE3)-RIL中进行诱导表达，SDS一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表达结果，见图2。
结果表明转入重组质粒的BL21(DE3)菌株与对照相比没有明显表达，而转入BL21-Codon Plus(DE3)-RIL的菌株在43KD处出现特征蛋白质带。根据核酸推算，该蛋白的分子量应为52KD，这可能是由于该蛋白在含2％SDS和100mMDDT的样品处理液中加热处理后仍能保持部分折叠。在Dong的实验中也发现这一现象。细胞超声破碎后，分别进行上清和沉淀的SDS-PAGE电泳，发现该蛋白主要是以包涵体的形式存在与细胞破碎液的沉淀中。
3.表达产物的纯化Linden等建立的甘油常温抽提后疏水柱一步纯化法是目前为止纯化耐热嗜热α-淀粉酶最便捷的方法。发明人首先采用Linden等方法进行纯化，并以此方法获得的蛋白作为标准品。用20％甘油悬浮包涵体室温搅拌4小时，可以抽提出目的蛋白，见图3，反复进行三次抽提，第三次抽提液中几乎检测不到活性。将前两次抽提液合并上样，通过Phenyl Sepharose 6Fast Flow疏水层析柱纯化。通常蛋白需要高盐离子才能结合到疏水柱上，但由于PFA的疏水性很强，不添加盐离子且有20％甘油存在时依然能结合到疏水柱上。样品上柱时，细菌的杂蛋白和结构异常的PFA不会结合到柱子上，从而和目的蛋白分离开来。50％乙二醇洗脱出单一峰。SDS-PAGE检测结果显示在46KD和64KD处各有一条带，见图3，Dong等发现该蛋白易于形成二聚体。本实施例中，将样品121℃加热15分钟后，电泳条带变成46kD处一条，说明该蛋白在100℃加热后在SDS-PAGE上仍能保持部分二聚体状态。酶谱鉴定发现PFA二聚体具较强活性，而单体只有微弱的活性。当121℃加热15分钟后，仍有微量二聚体，尽管蛋白电泳看不到条带，但酶谱鉴定上二聚体位置有微弱的活性，见图4、表2。
表2从0.4g重组大肠杆菌细胞中纯化α-淀粉酶(方法1通过甘油抽提)
a细胞超声破碎后b离心后含α-淀粉酶和细胞破碎物的沉淀c沉淀经20％甘油抽提后的上清d经phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱纯化后的样品结果表明，采用这种方法，最终获得的PFA淀粉酶比活为3629.4/mg。
用甘油虽然可以溶解部分蛋白，但仍有大量蛋白保留在沉淀中。形成包涵体的蛋白质存在正常的二级结构。发明人用方法2，即在pH10.5、90℃条件下3分钟就能将蛋白包涵体溶解，且对蛋白没有明显的破坏作用。进一步稀释到pH8.5，通过Phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水层析柱纯化，50％乙二醇洗脱出单一峰，见图5、表3。
表3从0.4g重组大肠杆菌细胞中纯化α-淀粉酶(方法2通过碱性条件下加热溶解包涵体的方法)
a细胞超声破碎后b离心后含α-淀粉酶和细胞破碎物的沉淀c沉淀在pH10.5条件下90℃加热3分钟，离心后上清d稀释于pH8.5的缓冲液e经phenyl Sepharose 6 Fast Flow疏水柱纯化后的样品结果表明通过碱性条件下加热溶解包涵体的方法，测得比活为3830.2U/mg，回收率是甘油抽提法的3.1倍。
讨论PFA是来源于Pyrococcus furiosus的胞外嗜热α-淀粉酶，本发明人通过PCR方法从Pyrococcus furiosus基因组中扩增出PFA的序列，在大肠杆菌BL23(DE3)RIL菌株中获得高效表达，重组PFA表达量占菌体总蛋白30％以上，并主要以不溶性的包涵体形式表达。本发明人采用Linden等的甘油抽提纯化方法，获得了一定量的纯化蛋白，并以此作为阳性对照。本发明人实验中发现，甘油抽提方法只能溶解出部分活性蛋白，仍有大量重组蛋白质留在沉淀中无法被溶解纯化。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国科学院上海生命科学研究院<120>一种嗜热α-淀粉酶的制备纯化方法<130>062455<160>2<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>1atgaaatact tggagcttga agag24<210>2<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>2aagaagctta tcacccaaca ccacaataac tc 3权利要求
1.一种嗜热α-淀粉酶的制备方法，其特征在于，它包括步骤(1)将嗜热α-淀粉酶的包涵体在70-100℃的温度下，在pH9-13的碱性溶液中溶解变性，从而获得嗜热α-淀粉酶的变性溶液；(2)将步骤(1)中获得的嗜热α-淀粉酶的变性溶液进行复性，从而获得嗜热α-淀粉酶的复性溶液；(3)从步骤(2)得到的嗜热α-淀粉酶的复性溶液分离出嗜热α-淀粉酶。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的嗜热α-淀粉酶是选自下组的嗜热α-淀粉酶火球菌属的嗜热α-淀粉酶、嗜热古菌Pyrococcusfuriosus的嗜热α-淀粉酶、沃氏火球菌Pyrococcus woesei的嗜热α-淀粉酶以及来源于其他嗜热微生物的嗜热α-淀粉酶。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的碱性溶液为pH9.5-12.0的缓冲液。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中的碱性溶液温度为75-95℃。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，变性处理时间为0.5-60分钟。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，复性条件是在15-70℃下，于pH7.5-10.0的缓冲液复性0.5-20小时。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述的分离是通过以下方法进行疏水层析、离子交换层析、分子排阻层析或其组合。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括步骤(4)将分离的嗜热α-淀粉酶冻干，制得嗜热α-淀粉酶冻干剂。
9.一种如权利要求1所述的制备方法所获得的嗜热α-淀粉酶。
10.一种如权利要求9所述的嗜热α-淀粉酶的用途，其特征在于，用于在超过100℃的高温下，使淀粉水解成为寡糖与单糖的工艺。
全文摘要
本发明公开了一种制备嗜热α－淀粉酶(PFA)的方法，所述的方法是在碱性条件下加热溶解重组蛋白包涵体，稀释复性后通过柱层析分离纯化。该方法的回收率高，且回收的α－淀粉酶活性高。
文档编号C12P19/00GK101063115SQ20061002597
公开日2007年10月31日 申请日期2006年4月24日 优先权日2006年4月24日
发明者张毅, 王丽萨, 杨胜利 申请人:中国科学院上海生命科学研究院