专利名称：一种高活力β-淀粉酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种植物中的淀粉酶的分离提纯方法，尤其是一种工业化生产高活力β -淀粉酶的方法。
背景技术：
β-淀粉酶(E.C3.2.1.2)是淀粉酶的一种，又称1，-3-麦芽糖苷酶。β -淀粉酶广泛存在于大麦，小麦，甘薯，豆类等植物中，还有不少微生物能产生β_淀粉酶。β_淀粉酶在食品工业中作为生物催化剂，可以应用于麦芽糖、啤酒、面包等的生产和制造。在食品点心上使用β_淀粉酶可以防止淀粉老化，在医药工业上制造注射用麦芽糖，可以和α-淀粉酶一起作为消化剂。近年来，以β_淀粉酶作为生物催化剂制造麦芽糖浆，补足了我国食糖不足的状况。随着科技进步，人们对高麦芽糖浆，超高麦芽糖浆研究非常活跃。但国内由甘薯，小麦来生产淀粉酶的活力低(50万u/ml)，耐温性差(58°C)，不符合高麦芽糖，超高麦芽糖浆的生产要求。进口的高活力β -淀粉酶虽然能够符合高麦芽糖浆的生产，但由于其耐温性不及大豆β-淀粉酶，在用于生产高麦芽糖时β-淀粉酶的使用量大，且生产高麦芽糖时所必需的普罗兰酶用量也要大于大豆β_淀粉酶(大麦β_淀粉酶的使用PH窄和普罗兰酶pH不一致所造成的)。上述高活力大豆β_淀粉酶的工艺应用于工业化生产，使用范围受到限制，价格高，不能满足需求。与此同时，国内科研部门虽然取得了不少淀粉酶的制备方法科研成果，但是大部分能耗高，环境污染高(盐析方法`)，原料的综合利用率低，成本高(原料采用低温豆柏，价格3500元/吨以上)(参见名称为《大豆β -淀粉酶的制备工艺》、专利号为99102506的中国发明专利)。
发明内容
本发明的目的是提供一种消耗资源少，得率高、活力高、性能好的β -淀粉酶制备方法。依据该制备方法获得的产品具有耐温、耐酸优于同类产品的优点，且保存稳定性好，是应用效果较好的高活力β_淀粉酶。本发明提供了一种β -淀粉酶的制备方法，包括分离水收集，预处理，沉淀并溶出β -淀粉酶，采用聚丙烯酸与溶液中的β -淀粉酶形成复合沉淀物，溶解复合沉淀物，调节PH大于等于6.0溶出β-淀粉酶，经净化，浓缩，配以稳定剂，精制后获得高活力淀粉酶
上述方法中，可以采用废弃的植物提取液作为原料。例如，本发明的优选例中，以大豆蛋白分离水作为分离水原料。上述方法中，可以采用聚凝剂及筛选的滤材对分离水进行固液分离，使滤液不会堵塞超滤膜。其中，分离水收集后，调整温度10-50°c，pH 3.2-5.0。
加入浓度为0.05-5%的PAA (聚丙烯酸)。加入PAA后分离沉淀物，再中和沉淀物溶出淀粉酶。在本发明的一个优选实施例中，上述的PAA.Ε (聚丙烯酸.淀粉酶)复合沉淀物，加水溶解并加入碳酸钙中和至ΡΗ6.0以上，促进Ca2+能与沉淀物中PAA形成溶解度更小的复合物沉淀，而使酶蛋白释放溶于水中。上述方法中，溶出淀粉酶后，还包括聚凝除杂质，超滤的步骤。超滤过程中，可以采用10Κ-30Κ道尔顿分子量的滤材进行浓缩。所述的滤材可以是有机膜、无机膜或者金属膜。超滤到一定倍数后，调整pH和聚凝剂使得残余蛋白及胶体物质沉淀。超滤可以分二段进行，第一段对浓缩液进行聚凝处理并调整pH，使得浓缩液中非含酶物质得到沉淀；第二段对第一段获得的产物过滤后再进行二次浓缩。超滤分二次进行，首先对粗酶液进行聚凝处理并调整PH4.5-5.5，使得非酶物质得到沉淀，过滤后的粗酶液再进行超滤浓缩。从而有效地提高了浓缩倍数从而得到高活性的β _淀粉酶。在本发明的优选例中，加入了酶稳定剂(含有食盐，糊精，醋酸钠)，以进一步提升所得大豆淀粉酶的性能。上述方法中，可以采用助滤剂进行固液分离或微孔膜进行精制，和去除微生物 本发明的制备方法，以废弃植物提取液为原料，不仅变废为宝，绿色环保，而且能够大
幅度的减少大豆蛋白质工·厂分离水中C0D。化学需氧量COD (Chemical Oxygen Demand)是以化学方法测量水样中需要被氧化的还原性物质的量。水样在一定条件下，以氧化I升水样中还原性物质所消耗的氧化剂的量为指标，折算成每升水样全部被氧化后，需要的氧的毫克数，以mg/L表示。它反映了水中受还原性物质污染的程度。该指标也作为有机物相对含量的综合指标之一。利用本发明的制备方法，生产I吨高活力β -淀粉酶可以节约10余吨豆柏，同时还可以减少大豆蛋白质工厂分离水中COD约20-30%。另一方面，本发明还提供了依据上述制备方法生产的大豆淀粉酶，其特性为最适作用温度60-63°C，作用温度范围40-65°C，最适作用pH5.5，作用pH范围3.8-7.0。本发明制备的β_淀粉酶，其酶活最高可以达到100万u/ml (lu即I个酶活力单位，它是指定适宜反应条件下，每小时产生I毫克麦芽糖的酶量)。由于该产品具备上述优异特性，保证制糖高效率，又增强了抗御微生物对糖化液污染的危害。图1显示，本发明的制备方法生产的大豆β -淀粉酶在较高的温度，不仅活性没有降低，反而略有提升。而同样温度下，大麦淀粉酶的活性就迅速下降。图2显示，在其他条件相同的情况下，大麦β -淀粉酶在pH彡4.5时，几乎没有活性，当pH大于4.5后，活性逐步提高，在pH=5.5时达到最高峰，随后立即下降；而本发明的制备方法生产的大豆β-淀粉酶在较宽的PH范围内，活性稳定。本发明高活力β -淀粉酶制备方法优异效果:
采用废弃大豆蛋白分离液提取β_淀粉酶达到综合利用，变废为宝，能够减少大豆蛋白质工厂分离水中C0D，对改善环境起到很好作用。
采用PAA沉淀分离获得β_淀粉酶方法简单，收率高，采用超滤浓缩可以获得高活力β_淀粉酶。更重要的是，运用本发明获得比其他植物提取的β_淀粉酶更优异的产品特性，保证制糖高效率又增强了抗御微生物对糖化液污染的危害。本发明高活力β_淀粉酶适合于上述工业产品的制造。特别是制造高麦芽糖浆，超高麦芽糖糖浆及防止淀粉老化的优选产品。比较试验显示，在生产高麦芽糖时，大豆β -淀粉酶的使用量相比大麦β -淀粉酶可以减少20%，普罗蓝酶的用量也可减少20%。
图1是大豆β -淀粉酶和大麦β -淀粉酶对温度的耐受比较图。其中，横坐标是温度(摄氏度)，纵坐标是相对酶活。SBA是大 β -淀粉酶,BBA是大麦β_淀粉酶。图1显示，本发明的制备方法生产的大豆β_淀粉酶在较高的温度，不仅活性没有降低，反而略有提升。而同样温度下，大麦淀粉酶的活性就迅速下降。图2是大豆β -淀粉酶和大麦β -淀粉酶对酸碱度的耐受比较图。其中，SBA=Soyβ-amylase (大豆 β-淀粉酶)，BBA=Barley β -amylase (大麦β -淀粉酶);
横坐标是pH值，纵坐标是相对酶活。SBA是大豆β -淀粉酶，BBA是大麦β -淀粉酶；图中显示，在其他条件相同的情况下，大麦β -淀粉酶在pH彡4.5时，几乎没有活性，当pH大于4.5后，活性逐步提高，在 pH=5.5时达到最高峰，随后立即下降；而本发明的制备方法生产的大豆淀粉酶在较宽的PH范围内，活性稳定。图3是330个单位(330u/g淀粉)的大豆β -淀粉酶和各浓度普罗兰酶的差别。反应条件:pH4.562°C。图4是330个单位(330u/g淀粉)的大麦β -淀粉酶和各浓度普罗兰酶的差别。反应条件:pH4.562°C。图5是在普罗蓝酶添加0.5ASPU情况下，大麦β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麦芽糖的表现。图6是在普罗蓝酶添加1.0ASPU情况下，大麦β -淀粉酶和大豆β _淀粉酶生成麦芽糖的表现。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计
笪
ο除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练、人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1优选制备例I取分离水(蛋白分离后的废水)IOOL (活性4125u/ml)，调整温度45°C，pH3.4加入
0.P/oPAA获得沉淀，经溶解加入IOOg碳酸钙，中和pH6.30，经300cm2过滤器过滤，得到滤液用中孔纤维膜浓缩，配以酶稳定剂(食盐，糊精，醋酸钠)，精制得71.64万u/ml成品416ml。实施例2优选制备例2
取收集分离水1500L (活性4380u/ml)，调整温度44°C，pH3.3加入0.2%PAA获得沉淀，加水1:5溶解，加入1.1kg碳酸钙中和pH6.05，用Im2板框过滤得到滤液，用4寸卷式膜超滤浓缩，配以酶稳定剂(食盐，糊精，醋酸钠)，精制得到74.58万u/ml成品6589ml。实施例3优选制备例3
取收集分离水IOM3 (活性4217u/ml)调整温度44°C，中和pH3.4加入0.50%PAA获得沉淀，经溶解加入1:5水溶解，加入IOkg碳酸钙中和pH6.18，用8寸卷式膜超滤浓缩，经酶稳定剂(食盐，糊精，醋酸钠)精制后得到91.64万u/ml成品34787ml。实施例4优选制备例4
取收集分离水1000L (4530u/ml)，采用筛选的硅藻土过滤处理，滤液用膜超虑浓缩到20倍，第一次浓缩液用聚合氯化铝(PAC)0.03%聚凝并调整pH到4.0-6.0,使浓缩液中的蛋白及胶体物质得到沉淀，过滤去除杂质，滤液进行二次超滤，二次浓缩液经酶稳定剂(食盐，糊精，醋酸钠)精制得到90万u/ml成品4836ml。实施例5大豆β-淀粉酶和大麦β-淀粉酶生成麦芽糖的性能比较
用实施例3获得的大豆β-淀粉酶和目前中国普遍在用的大麦β-淀粉酶作比较制造麦芽糖方面的应用。所使用的普罗兰酶(GCI 0ΡΤΙΜΑΧ L-1000)活性为1000 ASPU/g。所使用的大豆β-淀粉酶和大麦β -淀粉酶的活性相近，分别为大豆β淀粉酶705870U/ml，大麦β淀粉酶 708840u/mlo糖化试验的条件设定如下:
基质浓度:日本淀粉 100，33%W/V浓度(DE = 11相当)/50mM冰醋酸-醋酸钠缓冲溶液。酶的添加量:根据表I和表2的组合添加。
糖化pH温度:大豆β -淀粉酶为ρΗ4.5，62.(TC ;大麦β -淀粉酶为ρΗ5.5，58.5°C。
糖化时间:O 48小时。
糖化目标:70%以上。按照大豆β -淀粉酶和大麦β -淀粉酶的最适合条件，就糖化能力作比较。表I中大豆β -淀粉酶在比大麦β -淀粉酶减少20%添加量时,糖化40小时后能够同样达到相同的糖化效果。另外由于大麦β -淀粉酶的适用pH和普罗蓝酶不一致，因此对普罗蓝酶有依存性(添加大于2ASPU)，而大豆β -淀粉酶和普罗蓝酶的适用pH —致，因此当普罗蓝酶添加到
0.75ASPU后对麦芽糖的增长作用不大了，所以生产高麦芽糖时普罗蓝酶的添加量可以减少20%。这说明本发明的大豆淀粉酶生产制造麦芽糖时，成本相对较低。
注:Gl=葡萄糖，G2=麦芽糖，G3=麦芽三塘，G4=四糖。表I大豆β -淀粉酶和大麦β -淀粉酶的糖化比较试验
权利要求
1.一种β-淀粉酶的制备方法，包括分离水收集，预处理，沉淀并溶出β-淀粉酶，其特征在于，其包括步骤:采用聚丙烯酸与溶液中的β-淀粉酶形成复合沉淀物，溶解复合沉淀物，调节PH大于等于6.0溶出β -淀粉酶，经净化，浓缩，配以稳定剂，精制获得高活力的β -淀粉酶。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，分离水收集后，调整温度10-50°C，pH3.2_5.0 ο
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，加入聚丙烯酸的终浓度为0.05-5%。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，溶出淀粉酶后，还包括超滤和除杂质的步骤。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，超滤采用10Κ-30Κ道尔顿分子量的有机膜、无机膜或者金属膜进行浓缩。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，超滤到一定倍数后，调整pH和聚凝剂使得残余蛋白及胶体物 质沉淀。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，超滤分二段进行，第一段对浓缩液进行聚凝处理并调整PH，使得浓缩液中非含酶物质得到沉淀；第二段对第一段获得的产物过滤后再进行二次浓缩。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于采用助滤剂进行固液分离或微孔膜进行精制和去除微生物。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，采用大豆蛋白分离水作为分离水原料。
10.根据权利要求1所述的制备方法获得的β-淀粉酶。
全文摘要
本发明涉及一种植物中的淀粉酶的分离提纯方法，尤其是一种工业化生产高活力β-淀粉酶的方法。本发明的β-淀粉酶的制备方法，包括分离水收集，预处理，沉淀并溶出β-淀粉酶，采用聚丙烯酸与溶液中的β-淀粉酶形成复合沉淀物，溶解复合沉淀物，调节pH大于等于6.0溶出β-淀粉酶。本发明是一种消耗资源少，得率高(收率75%左右)，活力高(通常70-90万u/ml)的β-淀粉酶制备方法，所得产品对温度和酸碱度的耐受性好，应用于麦芽糖生产成本较低。
文档编号C12N9/24GK103232982SQ201310177110
公开日2013年8月7日 申请日期2013年5月15日 优先权日2013年5月15日
发明者霍国昌, 许建中 申请人:常熟市诺科生化工程有限公司