一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领 域。
【背景技术】
[0002] 麦芽糖是由两个葡萄糖单位经a-1，4糖苷键连接组成的还原性二糖，化学名称 是4-0-D-六环葡萄糖基-D-六环葡萄糖。其甜度柔和，又因低粘度、低吸湿性及良好的热 稳定性特点，可作为食品增甜剂取代葡萄糖和蔗糖，在食品工业领域具有巨大的应用潜力。 工业上麦芽糖的制备，是以淀粉质为原料，经过淀粉酶，麦芽（或淀粉酶，真菌淀粉 酶）水解工艺，制得一种以麦芽糖为主（40%-60%)的糖浆，若麦芽糖含量超过45% (最 好在50%以上），则被称为高麦芽糖浆。在食品工业中高麦芽糖浆的用途之一是制作糕点、 糖果等产品。糖浆熬煮温度远高于饴糖，一般超过140°C。麦芽糖含量大于70%，甚至高达 90%以上，则被称为超高麦芽糖浆。麦芽糖相比葡萄糖可避免血糖升高，对于应用于抗体、 疫苗等的制备具有优于葡萄糖的应用优势。因此超高纯度的麦芽糖浆在医药领域的应用也 引起了越来越多的关注。
[0003] 当前麦芽糖生产工艺已较为成熟，使用a-淀粉酶和淀粉酶生产麦芽糖时，产 物中麦芽糖含量可高达90%，葡萄糖、三糖、四糖以及部分低聚糖和糊精是主要的转化副产 物。其中糊精和部分低聚糖，可通过乙醇沉淀去除。超高纯度麦芽糖的制备，则要通过色谱 分离和结晶等方法获得。由于麦芽糖黏度大、难结晶，通常要求结晶原料中麦芽糖纯度在 90%以上，因此色谱分离的纯度，对麦芽糖结晶起着至关重要的作用。色谱分离基本可去除 葡萄糖和五糖及以上的小分子糖类，对麦芽糖纯度影响较小。但产物中的三糖和四糖由于 与麦芽糖性质较为相近，往往成为分离纯化中的主要杂质，不仅直接降低了产品纯度，还给 麦芽糖结晶性、糖浆粘度以及最终产品的水分含量带来很大不利影响，使麦芽糖最终收率 大大降低。
[0004] 麦芽糖淀粉酶具有小分子糖水解活性，可水解三糖、四糖等小分子糖，形成葡萄糖 和麦芽糖，因此在超高麦芽糖生产中通常与a-淀粉酶、淀粉酶和普鲁兰酶等复配使 用以降低副产物比例，使麦芽糖更利于结晶。据报道，来源于嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus)的麦芽糖淀粉酶具有较高的最适反应温度和较低的最适pH反应条 件，可满足较为苛刻的工业生产条件，将产物中麦芽糖比例提高至92%，在工业上有极大的 应用优势。但发明人在前期应用中发现，由于该酶同时具有的水解活性和转苷活性，在水解 小分子糖的过程中，又会转苷产生新的三糖和四糖等。生产中为了减少副产物的生成，往往 需要延长反应时间使水解反应达到平衡，一方面导致生产周期长、效率低，另一方面反应时 间的延长，又容易导致生成的麦芽糖被重新利用形成转苷副产物。
[0005] 因此，本发明利用蛋白质工程和酶工程手段，降低该酶转苷活性，减少转化体系中 的副产物比例，使具有更高的麦芽糖生产效率，赋予其在工业上更好的应用性能。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种麦芽糖淀粉酶的突变体，该突变体是B.stearothermophilus 的麦芽糖淀粉酶转苷活性中心相关的氨基酸残基的取代，与其亲代的麦芽糖淀粉酶相比， 其对麦芽糖具有更快的转化效率以及更少的转化副产物。
[0007] 所述B. stearothermophilus麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与NCBI数据库中的 B. stearothermophilus麦芽糖淀粉酶氨基酸序列一致（登录号：AAA22233. 1)。
[0008] 所述的突变体是将亲本麦芽糖淀粉酶基因中第177位的色氨酸（Trp)分别突变成 了苯丙氨酸（Phe)和酪氨酸（Tyr)，分别命名为W177F和W177Y。
[0009] 本发明突变体酶W177F和W177Y分别用于麦芽糖生产时，在相同酶转化条件下，添 加突变体酶W177F在12h达到反应平衡，麦芽糖含量由90. 49%提高为95. 79 %，反应体系 中已不含三糖和四糖；添加突变体酶W177Y在8h达到反应平衡，麦芽糖含量由90. 49%提 高为96. 10%，反应体系中已不含三糖和四糖。而添加野生酶转化生产麦芽糖，8h时麦芽糖 含量为93. 20 %，三糖和四糖含量分别为4. 10 %和0. 50% ;12h时麦芽糖含量为94. 61%， 三糖和四糖含量分别为2. 57 %和0. 22%;反应至30h时仍未达到平衡，此时麦芽糖含量为 95. 45%，三糖和四糖含量分别为0. 67%和0. 35%。由此可见，添加突变体酶生产麦芽糖， 可将反应体系中的三糖和四糖完全降解。添加野生酶的反应体系中，三糖含量随反应进行 逐渐降低为〇. 67%;四糖在12h时达最低值0. 22%，但随着反应时间延长，又呈现出重新生 成的趋势。因此突变体酶W177F和W177Y在麦芽糖生产应用中，不仅可以大大缩短反应平 衡时间，提高麦芽糖生产效率，同时完全降解了副产物中的主要杂质三糖和四糖，简化了色 谱分离纯化过程，在高纯度结晶麦芽糖的生产中具有潜在应用优势。
【附图说明】
[0010] 图1野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽糖含 量变化
[0011] 图2野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽三糖 含量变化
[0012] 图3野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)生产麦芽糖过程中麦芽四糖 含量变化
[0013] 图4野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)的最适温度
[0014] 图5野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)的60°C温度稳定性
[0015] 图6野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)的最适pH
[0016] 图7野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)的pH稳定性
[0017] 图8金属离子对野生型麦芽糖淀粉酶和突变体（W177F和W177Y)比活力的影响
【具体实施方式】
[0018] 实施例1 :本例说明野生麦芽糖淀粉酶的制备。
[0019] (1)麦芽糖淀粉酶重组菌的构建
[0020] 根据NCBI上的amyM氨基酸序列（NCBI编号：AAA22233. 1)，将NCBI上的amyM基 因序列（NCBI编号：M36539)进行密码子优化，采用化学全合成方法合成麦芽糖淀粉酶的基 因序列amyM。用于构建大肠杆菌表达载体的质粒是pET24a(+)。将pET24a(+)质粒和带有amyM基因的质粒分别进行NcoI和HindIII双酶切，酶切产物经胶回收后，用T4连接酶连 接过夜，连接产物转化至大肠杆菌JM109感受态细胞，转化产物涂布于含100mg/L卡那霉素 的LB平板，经37 °C培养过夜，平板上挑取2个单菌落，接入LB液体培养基，8h后抽提质粒验 证，结果正确，得到富集的amyM/pET24a质粒。将质粒amyM/pET24a转化大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞，挑取转化子在LB液体培养基（含100mg/L卡那霉素）中37°C培养过夜，保存 甘油管，命名为amyM/pET24a/BL21 (DE3)。
[0021] (2)麦芽糖淀粉酶的表达与纯化
[0022] 从甘油管接种amyM/pET24a/BL21 (DE3)于LB液体培养基（含100mg/L卡那霉素） 生长8h，按5%接种量将种子接入TB液体发酵培养基（含100mg/L卡那霉素）。大肠杆菌 在37°C培养2h后，加入0.OlmM终浓度的IPTG进行诱导，并在25°C摇床继续培养发酵48h 后，将发酵液于4°C、8000rpm离心10min除菌体，收集发酵上清。
[0023] 在上清液中缓慢加入50%(NH4)2S04,4°C放置过夜，4°C、8000rpm离心20min，收集 沉淀。用pH7.5的20mM梓檬酸缓冲液复溶沉淀后，在20mM梓檬酸缓冲液中透析过夜。期 间更换2-3次缓冲液。通过0.22y m膜过滤后制成上样样品，采用avant蛋白纯化仪进行重 组蛋白的纯化。阴离子交换色谱纯化步骤：（1)平衡：用5倍体积的20mM缓冲液平衡DEAE 阴离子交换色谱柱；（2)上样：预先处理好的样品以lmL/min的流速上样；（3)洗脱：流速 lmL/min进行梯度洗脱，检测波长为280nm，分步收集含麦芽糖淀粉酶活力的洗脱液。得到 纯化的野生麦芽糖淀粉酶。
[0024] 实施例2 :本例说明麦芽糖淀粉酶突变体制备。
[0025] (1)定点突变
[0026] 在B.stearothermophilus来源的麦芽糖淀粉酶与环状芽孢杆菌（Bacillus circulansstrain251)来源的环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase)序列比对分析的基础上， 对麦芽糖淀粉酶的蛋白质结构进行模拟分析，发现了麦芽糖淀粉酶中与转苷活性可能相 关的氨基酸位点Trpl77,Phel88,Ala229,Tyr258。将麦芽糖淀粉酶中第177位的色氨酸 (Trp)分别突变成组氨酸（His)和天冬酰氨（Asn)，分别标记为W177H，W177N;将麦芽糖淀 粉酶中第188位的苯丙氨酸（Phe)突变成酪氨酸（Tyr)，标记为F188Y;将麦芽糖淀粉酶中 第229位的丙氨酸（Ala)分别突变成缬氨酸（Val)、苏氨酸（Thr)和亮氨酸（Leu)，分别标 记为A229V、A229T和A229L;将麦芽糖淀粉酶中第258位酪氨酸（Tyr)分别突变成天冬酰 氨（Asn)和谷氨酰氨（Gin)，分别标记为Y258N和Y258Q。
[0027] 引入W177H突变的定点突变引物为：
【主权项】
1. 一种麦芽糖淀粉酶的突变体，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与 NCBI数据库中登录号为AAA22233. 1的嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶一致，所述突变是 将第177位色氨酸突变为苯丙氨酸，命名为W177F。
2. -种麦芽糖淀粉酶的突变体，其特征在于，所述麦芽糖淀粉酶的亲本氨基酸序列与 NCBI数据库中登录号为AAA22233. 1的嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶一致，所述突变是 将第177位色氨酸突变为酪氨酸，命名为W177Y。
3. 权利要求1、权利要求2所述的突变体的制备方法，包括如下步骤： 1) 在嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶氨基酸序列的基础上确定突变位点；设计定点 突变的突变引物，以携带麦芽糖淀粉酶基因的载体为模板进行定点突变并构建含突变体的 质粒载体； 2) 将突变质粒转化进宿主细胞； 3) 挑选阳性克隆进行发酵培养，并纯化麦芽糖淀粉酶突变体； 所述质粒载体为PUC系列，pET系列，或pGEX中的任意一种；所述宿主细胞为细菌和真 菌细胞；所述细菌为革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌。
【专利摘要】一种麦芽糖淀粉酶的突变体及其制备方法，属于基因工程和酶工程领域。是将嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)来源的麦芽糖淀粉酶转苷活性中心的氨基酸残基的取代，与其亲代的麦芽糖淀粉酶相比，其对麦芽糖具有更高的转化效率以及更少的转化副产物。所述B.stearothermophilus麦芽糖淀粉酶突变体，至少以下性质之一发生改变：1)生产周期缩短；2)产物比例提高。这些突变体比野生型麦芽糖淀粉酶更适合用于麦芽糖生产过程。
【IPC分类】C12N15-56, C12N9-28, C12R1-07, C12N15-10
【公开号】CN104531636
【申请号】CN201510025813
【发明人】吴敬, 段绪果, 孙烨橙, 王蕾
【申请人】江南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月19日