Cas9-scForkI融合蛋白及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种Cas9-scForkI融合蛋白及其应 用。
【背景技术】
[0002] CRISPR-Cas源自细菌和古细菌的免疫系统，可利用靶点特异性的RNA将Cas9核酸 酶带到基因组上的具体靶点，从而对特定基因位点进行修饰。RNA导向Cas9可以在多种细 胞和生物体中发挥功能，在特异位点裂解完整基因组。Cas9这种基因组编辑的潜能使这项 技术已经广泛用于人的细胞系，小鼠，大鼠，多物种的基因敲除及敲入。
[0003]ForkI是一种限制性核酸内切酶，ForkI二聚化后就可以对DNA进行切割。已 经有文献报道，失活的Cas9与ForkI融合，即Cas9-ForkI可用于基因组的编辑。而且 Cas9-ForkInickase可以更精确的用于基因组的编辑。但是这两个技术需要设计两个gRNA 革巴向，设计比较复杂。而且Cas9-ForkInickase的切割效率也比较低。本发明用一个失活 的Cas9蛋白连接两个ForkI,这两个ForkI由（G4S)1CI连接，该方法设计比较简单,只需要 设计一个gRNA，而且切割活性很高。该方法更适用于介导基因敲入。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种Cas9_scForkI融合 蛋白。本发明通过基因工程的办法，把人源化Cas9蛋白进行改造，用（G4S)1Q即 (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)1(l是一个linker,由它连接两个ForkI显示，然后和失活的Cas9融 合成Cas9-SCF〇rkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑。
[0005] 本发明采用的技术方案如下： Cas9-scForkI融合蛋白，所述融合蛋白为由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列组成的蛋白。
[0006] 编码上述的Cas9_scForkI融合蛋白的核苷酸序列。
[0007] 以上核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0008] 所述的Cas9_scForkI融合蛋白，所述的Cas9蛋白是失活的Cas9。
[0009] 所述的Cas9_scForkI融合蛋白，所述的scForkl蛋白是由两个ForkI,中间由一个 (G4S)1CI 连接。
[0010] 所述的Cas9-scForkI融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
[0011] 本发明与现有技术相比，其有益效果为：本发明通过基因工程的办法，把失活的 Cas9蛋白进行改造，用（G4S)1CI即（Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 1(|是一个linker,由它连接两个ForkI,然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因 组的编辑。本发明Cas9-SCF〇rkI融合蛋白做药物筛选或基因修饰更安全，该融合蛋白还可 用于基因治疗。
[0012] 本发明和现有技术相比较，设计更加灵活。而且切割活性更高，用作基因敲入的效 率更高。蛋白不仅可以用于基因修饰，也可用于基因治疗。
【附图说明】
[0013] 图1为Cas9_scForkI蛋白活性的验证图； 图2为Cas9-scForkI蛋白对Maltl基因切割活性验证图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0015] 本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发 明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件 或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的 常规产品。
[0016] 本发明中，SEQIDN0. 8所不序列、引物Primer_Fl、引物Primer_Rl、Maltl基因 的gRNA序列、引物PrimerF、引物PrimerR、引物Primer_F2和引物Primer_R2,均购于生 工生物工程(上海）股份有限公司； 胶回收采用胶回收试剂盒，购于天根生化科技（北京）有限公司；hCas9 载体购于Addgene，Plasmid41815 ; 小鼠ES细胞，购于Millipore; 以3￡0 10腸.8所不合成〇&89-卩〇^1-(617-617-617-617-361')10-卩〇^10嫩序列是委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成的。
[0017] 实施例1Cas9_scForkI融合蛋白的制备 所述的Cas9-scForkI融合蛋白的制备方法，包括步骤如下： 第一部分，pCas9-scForkI真核表达载体的构建： 以5￡〇10勵.8所示合成〇&89-卩〇41-(617-617-617-617-561〇104〇410嫩序列，以Cas9-ForkI-(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser) 10-ForkIDNA序列为模板，用引物Primer_Fl:CAGCC CTAACCGGTTCATGAGCGGAAATTGATCTCGC(SEQIDNO. 4) 进行扩增，配置反应体系如表1所示： 表1反应体系
【主权项】
1. Cas9-SCF〇rkI融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白为由SEQ ID NO. 1所示氨基酸序 列组成的蛋白。
2. 编码要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白的核苷酸序列。
3. 根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所 /_J、i〇
4.根据权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白，其特征在于，所述的Cas9蛋白是失 活的Cas9。
5. 根据权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白，其特征在于，所述的scForkl蛋白 是由两个ForkI，中间由一个（G4S) 1Q连接。
6.权利要求1所述的Cas9-scForkI融合蛋白在药物筛选及基因修饰中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种Cas9-scForkI融合蛋白及其应用，属于分子生物学领域，本发明通过基因工程的办法，把失活的Cas9蛋白进行改造，用(G4S)10即(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)10是一个linker，由它连接两个ForkI，然后和失活的Cas9融合成Cas9-scForkI，该融合蛋白可以序列特异性的进行基因组的编辑，本发明Cas9-scForkI融合蛋白做药物筛选或基因修饰更安全，该融合蛋白还可用于基因治疗，本发明和现有技术相比较，设计更加灵活，而且切割活性更高，用作基因敲入的效率更高，蛋白不仅可以用于基因修饰，也可用于基因治疗。
【IPC分类】C12N15-62, C12N9-22
【公开号】CN104531633
【申请号】CN201410656091
【发明人】李云英
【申请人】李云英
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月18日