携带cas9的重组腺病毒及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。本发明要求保护携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。所述Cas9蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。本发明还保护以上所述的重组腺病毒在制备用于敲除目的基因的试剂盒中的应用。CRISPR方法具有效率高，速度快，费用低的特点。本发明提供的CAS9的重组腺病毒可用于：(1)蛋白功能细胞平台，快速基因修饰，高通量筛选；(2)肝脏蛋白功能平台，在肝脏实现快速、特异基因敲除；(3)小鼠基因改造平台，制备基因敲除/敲入小鼠。
【专利说明】携带CAS9的重组腺病毒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。
【背景技术】
[0002]随着基因组注释项目(genome annotat1n projects)的不断发展和完善，以及蛋白质组计划(proteome projects)的实施,科研人员们已经开始跃跃欲试，想要将组学研究的成果尽早地运用到基础科学研究的各个领域，以及个性化医疗(personalizedmedicine)当中。不过海量的组学信息也给科研人员们出了一个不小的难题，那就是该如何将这些枯燥的数据转换成有意义的蛋白质功能，或者与临床相关的信息呢？解决这个问题的核心就在于尽快开发出一种高效率的、可靠的方法，来帮助科研人员研究基因型(genotype)对表型(phenotype)的影响作用。利用同源重组机制(homologousrecombinat1n)对基因进行定向失活(Targeted gene inactivat1n)就是这样一种好方法，可以帮助科研人员明确基因或蛋白的功能。不过在实际工作中使用这种方法也会受到好几个因素的限制，比如存在效率太低、费时费力、而且有可能导致突变等的限制。
[0003]近十年来出现了两种新的研究手段，可以帮助科研人员对各种细胞和各种生物体内的几乎任意基因进行人工操作。这种新技术就是我们常说的“基因组编辑技术(genome editing) ”，包括锌指核酸酶(Zinc-finger nucleases, ZFN)和转录激活因子样效应因子核酸酶(transcript1n activator-like effector nucleases, TALEN)。这两种核酸酶都是嵌合体，都是由经过设计的、序列特异性的DNA结合元件(programmable, sequence-specific DNA-binding modules)和非特异性的 DNA 切割结构域结合而成的。ZFN和TALEN都可以对DNA进行各种遗传修饰，这两种核酸酶的作用机制都是先对D NA双链分子进行切割，形成DNA双链断裂切口(DNA double-strand break，DSB)，然后激活细胞内的非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)修复机制(这是一种非保真的、容易出现遗传突变的修复机制)或者同源重组(homology-directed repair,HDR)修复机制(这是一种高保真的修复机制，不容易出现突变)，利用细胞自身的修复机制对DNA进行遗传学修饰。
[0004]这种由序列特异性的DNA结合结构域与非特异性的DNA切割结构域组合而成的人工核酸酶就是这种基因组编辑技术的重要组成部分。这些嵌合式的核酸酶能够以极高的效率、极高的精确度对基因组进行人工修饰，切割DNA产生DSB，然后利用NHEJ或HDR等DSB修复机制完成所需要的各种人工修饰。由于科研人员们对锌指蛋白和TALE蛋白等蛋白的DNA结合结构域的设计能力越来越强，所以这种基因组编辑技术的应用范围也一再地被拓展。这些既简单又灵活的核酸酶在遗传工程学领域里发挥了极大的作用，其重要性也在与日俱增，已经站到了遗传工程工作的最前线。
[0005]CRISPRs 全称为规律成族间隔短回文重复(Clustered regularly interspacedshort palindromic repeats),这是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。这一模式出现在超过40 %的细菌和90 %的古生菌中。研究表明，CRISPR与一系列相关蛋白、前导序列一起，能为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。
[0006]起初，很多研究人员假定这些奇怪的重复序列是毫无意义的，但是2005年，三个生物信息学团队报告，间隔区DNA通常和噬菌体的基因序列相匹配，表明CRISPR在微生物免疫中可能发挥了作用。马里兰州美国国家生物技术信息中心的Eugene Koonin和他的同事提出，细菌和古生菌获得了噬菌体DNA，之后将其作为RNA分子(能阻止外来DNA的匹配)的一个模板保存起来，就像真核细胞利用一个被称作核糖核酸干扰(RNAi)的系统摧毁RNA一样。
[0007]2007年，Rodolphe Barrangou、Philippe Horvath和其他人证明，他们能通过添加或删除和噬菌体DNA相匹配的间隔区DNA，改变嗜热链球菌对噬菌体攻击的抵抗力。这一发现使得杜邦公司能够为食品生产培育更强壮的菌株。他们同时也发现了其中隐藏的基本的原理:遭遇噬菌体入侵时，CRISPR会作出反应，此时细菌把间隔区DNA和DNA回文序列转录成一串长的RNA分子，tracrRNA (—个额外的RNA片段)和Cas9 —起作用产生crRNA (源自间隔区的RNAs)。2011年， Charpentier于在《自然》杂志上提出，Cas9、tracrRNA和crRNA一起以某种方法攻击和crRNA配对的外来DNA。
[0008]不仅是食品科学家和微生物学家，很多领域的研究人员都意识到细菌免疫系统的重要性，因为它具备一个非常有价值的特性:以某个特定的基因序列为目标。许多科研团队利用它来删除、添加、激活或抑制人体、老鼠、斑马鱼、细菌、果蝇、酵母、线虫和农作物细胞中的目标基因，从而证明了这个技术的广泛适用性。
[0009]在以上提到的三种精确操纵基因的技术中，CRISPR的功效和易用性在各方面都更胜一筹。在切割目标DNA方面，CRISPR系统要比TALENs更高效，且能比TALENs处理更多的基因。
[0010]Zhang Feng和他的同事的实验显示，CRISPR能立刻锁定和切割人体细胞中的两个基因。在与马萨诸塞州怀海德生物医学研究所发育生物学家Rudolf Jaenisch的合作中，Zhang分裂了小鼠胚胎干细胞中的5个基因。这些工作为培育转基因小鼠打下了基础，这是生物医学研究的一个关键工具。他的团队发现，这能简单地将Cas9信使RNA和两个向导RNAs注入老鼠的卵子或受精卵中。此外，通过对Cas9基因进行改构和利用一对gRNA引入不同的切割位点，CRISPR的脱靶效应问题也被克服。至此，CRISPR技术本身走向完善，并开始进入了应用阶段。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种携带CAS9的重组腺病毒及其应用。
[0012]本发明要求保护携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所不。所述Cas9蛋白的编码基因具体可如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所示。
[0013]所述的重组腺病毒的制备方法包括如下步骤:
[0014](I)将所述Cas9蛋白的编码基因插入pD0NR?221载体的attLl和attL2位点之间，得到中间质粒；
[0015](2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒PAD-DEST-CAS9 ；
[0016](3)将重组质粒pAD-DEST-CAS9导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组腺病毒。
[0017]所述中间质粒具体可为用序列表的序列6所不的含有Cas9蛋白的编码基因的双链DNA分子替换pD0NR?221载体的attLl和attL2之间的小片段(含attLl和attL2)，得到的重组质粒。
[0018]所述哺乳动物细胞具体可为293细胞。
[0019]本发明还保护一种重组质粒(重组质粒pAD-DEST-CAS9)，其制备方法如下:
[0020](I)将所述Cas9蛋白的编码基因插入pD0NR?221载体的attLl和attL2位点之间，得到中间质粒；
[0021](2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒。
[0022]本发明还保护以上任一所述的重组腺病毒在制备用于敲除目的基因的试剂盒中的应用。所述目的基因具体可为CEBPA蛋白的编码基因。所述CEBPA蛋白的编码基因具体可为具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。
[0023]本发明还保护一种用于敲除目的基因的试剂盒，包括以上任一所述的重组腺病毒。所述试剂盒还可包括携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒。所述目的基因具体可为CEBPA蛋白的编码基因。所述CEBPA蛋白的编码基因具体可为具有序列表的序列3所示的核苷酸的DNA分子。所述目的基因的sgRNA的编码基因具体可如序列表的序列I或序列2所示。所述携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒的制备方法具体如下:将重组质粒pLent1-U6 sgRNA导入哺乳动物细胞并培养，得到携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒；所述重组质粒pLent1-U6sgRNA的制备方法如下:①合成序列表的序列I所示的双链DNA分子并作为模板,采用序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；②合成序列表的序列2所示的双链DNA分子并作为模板，采用序列表的序列4所示的单链DNA分子和序列表的序列5所示的单链DNA分子组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；③用限制性内切酶SalI和XbaI酶切pLK0.1载体，回收载体骨架；④将步骤①得到的PCR扩增产物、步骤②得到的PCR扩增产物和步骤③得到的载体骨架连接，得到重组质粒pLent1-U6 sgRNA。所述试剂盒还可包括所述重组质粒pLenti_U6 sgRNA。所述哺乳动物细胞具体可为293T细胞。
[0024]发明人构建了 pLenti_U6 sgRNA慢病毒载体和CAS9腺病毒载体。pLenti_U6sgRNA慢病毒载体导入哺乳动物细胞并培养，可以得到表达特定基因的小向导RNA(smallguide RNA, sgRNA)的重组慢病毒。根据实验的要求，可以设计并合成针对不同基因的pLent1-U6sgRNA载体。CAS9腺病毒载体导入哺乳动物细胞并培养，可以得到表达CAS9蛋白的重组腺病毒。将表达特定基因的小向导RNA的重组慢病毒和表达CAS9蛋白的重组腺病毒共同感染目的细胞，就可以沉默目的细胞中的特定基因，很方便的对各种细胞进行基因组编辑。也可以将表达特定基因的小向导RNA的重组慢病毒和表达CAS9蛋白的重组腺病毒共同感染小鼠，可以对小鼠肝脏(腺病毒在肝脏中可以得到富集)中蛋白进行基因组编辑，从而无需制备转基因组小鼠。制备转基因小鼠耗费的时间长，约需3个月，应用病毒感染的方法仅需1-2周。制备转基因小鼠的单个基因费用在大约15万元，应用病毒感染的方法所需花费在I万元左右。
[0025]CRISPR方法具有效率高，速度快，费用低的特点。本发明提供的CAS9的重组腺病毒可用于:(1)蛋白功能细胞平台，快速基因修饰，高通量筛选；(2)肝脏蛋白功能平台，在肝脏实现快速、特异基因敲除；(3)小鼠基因改造平台，制备基因敲除/敲入小鼠。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为实施例2的结果。
[0027]图2为实施例3的步骤3的结果。
[0028]图3为实施例3的步骤4的结果。
【具体实施方式】
[0029]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0030]pLK0.1 载体:sigma 公司，货号:SHC001o 293T 细胞=ATCC,编号为 CRL-3216。AML12细胞(小鼠正常肝细胞):ATCC，编号为CRL-2254。293细胞:ATCC，编号为CRL-1573。pAD-DEST 载体(pBL0CK-1T?6-DEST Vector):1nvitrogen 公司，产品目录号为V48720。C57小鼠:北京华阜康生物科技股份有限公司。pD0NR?221载体(Gateway?pD0NR?221 Vector) =Invitrogen 公司，目录号 12536017。
[0031 ] 实施例1、sgRNA病毒液和CAS9病毒液的制备
[0032] 一、靶位点的选择
[0033]米用CCAAT 增强子结合蛋白-A(CCAAT_enhancer binding protein-alpha, CEBPA)作为靶序列，验证CRISPR/Cas9系统的可靠性和真实性，为了避免脱靶效应，选择两个gRNA串联的靶区域，
[0034]两个gRNA的DNA序列分别如下:
[0035]gRNA1:5，-GAAAGGACGAAACACCGAAGGCGGCCGGGTCGATGTAGGgttttagagctagaaat_3’ ；
[0036]gRNA2:5’-GAAAGGACGAAACACCGCACAGCCGACAGCAGGAGAAGGgttttagagctagaaat~3’。
[0037]gRNAl如序列表的序列I所示(其靶区域为序列表的序列3自5’末端第323-345位核苷酸)。gRNA2如序列表的序列2所示(其靶区域为序列表的序列3自5’末端第375-397位核苷酸)。CEBPA蛋白的编码基因的片段如序列表的序列3所示。
[0038]二、重组质粒 pLenti_U6 sgRNA 的构建
[0039]1、合成序列表的序列I所示的双链DNA分子。
[0040]2、以步骤I合成的DNA分子为模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0041]CRISPR-F (序列表的序列 4):5’ -GTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCG-3，；
[0042]CRISPR-R(序列表的序列 5):5’ -gttgataacggactagccttattttaacttgctatttctagο?ο?ββββο-3 ο
[0043]3、合成序列表的序列2所示的双链DNA分子。
[0044]4、以步骤3合成的DNA分子为模板，采用CRISPR-F和CRISPR-R组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0045]5、用限制性内切酶SalI和XbaI酶切pLK0.1载体，回收约4kbp的载体骨架。
[0046]6、采用Gibson Assembly试剂盒(NffB,产品目录号为E2611,说明书见https: //www.neb, com/protocols/2012/09/25/gibson-assembly-master-mix-assemb ly)并按试剂盒说明书操作，使得步骤2得到的PCR扩增产物、步骤3得到的PCR扩增产物和步骤5得到的载体骨架连接，得到重组质粒pLent1-U6 sgRNA。
[0047]三、sgRNA重组慢病毒的制备
[0048]1、取对数生长期的293T细胞，胰蛋白酶消化后用含10% (体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每20ml细胞悬液(含1.2 X 17个细胞)接种至一个直径为15cm的细胞培养皿，在37°C、5% CO2培养箱内培养24h(细胞密度达到70% -80% )。
[0049]2、完成步骤I后，弃除上清液，加入新配制的DMEM培养基，在37°C、5% CO2培养箱内培养2h。
[0050]3、完成步骤2后，借助Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司，产品目录号为12566014)并按说明书操作，每个细胞培养皿转染20μ g重组质粒pLent1-U6sgRNA，在37°C>5% CO2培养箱内培养8h。
[0051]4、完成步骤3后，弃除上清液，用20ml PBS缓冲液(pH7.4,0.01M)洗涤沉淀，然后加入新配制的含10% (体积比)FBS的DMEM培养基，在37°C、5% CO2培养箱内培养48h。
[0052]5、完成步骤4后,取上清液。
[0053]6、取步骤5得到的上清液，4°C、4000g离心10min，收集上清液。
[0054]7、将 I 体积份 lentivirus precipat1n solut1n (ALSTEM,产品目录号为 VC100)和4体积份步骤6得到的上清液置于离心管中并混匀，然后4000 Xg离心20min，离心管中的体系分为2层，收集上层清液，即为含有表达gRNAl和gRNA2的慢病毒的病毒液，简称sgRNA病毒液(sgRNA病毒液中的病毒含量为2 X 107pfu/ml)。
[0055]四、重组质粒pAD-DEST-CAS9的构建
[0056]1、用序列表的序列6所示的含有Cas9蛋白的编码基因的双链DNA分子替换pD0NR?221载体的attLl和attL2之间的小片段(含attLl和attL2)，得到中间质粒。序列表的序列6中，自5’末端第789-5045位核苷酸为CAS9蛋白的编码基因。
[0057]2、中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应(BP重组)，得到含有CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒PAD-DEST-CAS9。
[0058]五、CAS9重组腺病毒的制备
[0059]1、取对数生长期的293细胞，胰蛋白酶消化后用含10% (体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每1ml细胞悬液(含5 X 15个细胞)接种至一个直径为60mm的细胞培养皿，在37°C、5% CO2培养箱内培养24h(细胞汇合率为50-70% )。
[0060]2、完成步骤I后，弃除上清液，加入新配制的DMEM培养基，在37°C、5% CO2培养箱内培养2h。
[0061]3、用限制性内切酶Pac I酶切重组质粒pAD_DEST_CAS9，使其线性化，得到线性化质粒。
[0062]4、完成步骤2后,借助Lipofectamine 2000试剂(Invitrogen公司，产品目录号:12566014)并按说明书操作，转染6yg步骤3得到的线性化质粒(以单个培养皿计)，在37°C>5% CO2培养箱内培养8h。
[0063]5、完成步骤4后，弃除上清液，用20ml PBS缓冲液(pH7.4,0.01Μ)洗涤，然后加入新配制的含10% (体积比)小牛血清、I %青霉素-链霉素的DMEM培养基，在37°C、5% CO2培养箱内培养7天。
[0064]6、完成步骤5后，用细胞刮从培养皿中刮下细胞并移入50ml锥形管，离心收集细胞，用DMEM培养基重悬，得到细胞悬液。
[0065]7、将步骤6得到的细胞悬液进行反复冻融(现在液氮中冻结细胞，然后在37°C水浴中溶解，剧烈振荡；共冻融4次)，收集上清液，即为初始病毒液。
[0066]8、取对数生长期的293细胞，胰蛋白酶消化后用含10% (体积比)FBS的DMEM培养基悬浮得到细胞悬液，将每1ml细胞悬液(含5 X 15个细胞)接种至一个直径为60mm的细胞培养皿，在37°C、5% CO2培养箱内培养24h(细胞汇合率为50-70% )。
[0067]9、完成步骤8后,加入步骤7得到的初始病毒液,病毒液的体积为细胞培养液的体积的50 %，在37 °C、5 % CO2培养箱内培养4天(培养2-3天即可看到明显的细胞裂解或CPE现象)，然后收集上清液。
[0068]10、将15% CsCl和40% CsCl加入Beckman离心管中制备CsCl梯度溶液。
[0069] 11、将步骤9得到的上清液滴加于步骤10得到的CsCl梯度溶液上，4°C、30000rpm离心16小时，离心管中的体系显示两条带(处于上层的为腺病毒空壳，处于下层的为活病毒颗粒)，收集下层部分，在TBS缓冲液中透析一小时，然后在含有10%甘油的TBS缓冲液中透析两次，得到含有CAS9重组腺病毒的病毒液，简称CAS9病毒液(CAS9病毒液中的病毒含量为 10X10lclpfu/ml)。
[0070]六、制备对照病毒液
[0071 ] 用靶向GFP基因的两个gRNA代替gRNAl和gRNA2，进行步骤二和三，得到sgRNA病毒液的对照病毒液，简称对照病毒液。
[0072]实施例2、体外活性检测
[0073]1、用DMEM培养基悬浮AML12细胞，得到细胞浓度为5X 15个/ml的细胞悬液。
[0074]2、分组处理
[0075]实验组:将Iml步骤I得到的细胞悬液、Iml实施例1的步骤三得到的sgRNA病毒液、0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液混合，在37°C、5% CO2培养箱内培养48h ；
[0076]对照组:将Iml步骤I得到的细胞悬液、Iml实施例1的步骤六得到的对照病毒液、
0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液混合，在37°C、5% CO2培养箱内培养48h。
[0077]3、完成步骤2后，取细胞，提取基因组DNA，采用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩+?
日O
[0078]Fl: 5，-ATTCGCGACCCGAAGCTGCG-3，；
[0079]Rl: 5，-TGTTCTTGTCCACCGACTTCTTGGCT-3，。
[0080]4、取步骤3得到的PCR扩增产物，进行T7E1酶切(设置不进行T7E1酶切的对照处理)，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图1。对照组进行T7E1酶切的处理、实验组不进行T7E1酶切的对照处理，条带单一。实验组进行T7E1剪切后，出现弥散条带，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切并产生了错配的杂合双链，从而可以被T7E1酶切。
[0081 ] 实施例3、体内活性检测
[0082]1、分组处理
[0083]实验组:取4只C57小鼠，每只尾静脉注射0.1ml实施例1的步骤三得到的sgRNA病毒液和0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液；
[0084]对照组:取I只C57小鼠，每只尾静脉注射0.1ml实施例1的步骤六得到的对照病毒液和0.1ml实施例1的步骤五得到的CAS9病毒液。
[0085]2、注射病毒液7天后，取小鼠的肝脏。
[0086]3、取步骤2得到的肝脏，提取基因组DNA，采用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，取PCR扩增产物，进行T7E1酶切(设置不进行T7E1酶切的对照处理)，然后进行2%琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。对照组进行T7E1酶切的处理、实验组不进行T7E1酶切的对照处理，条带单一。实验组进行T7E1剪切后，出现弥散条带，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切并产生了错配的杂合双链，从而可以被T7E1酶切。将目的片段测序，结果表明，剪辑比例高达70%以上，
[0087]4、取步骤2得到的肝脏，提取总蛋白，进行Western检测，采用的一抗为CEBPa抗体(14AA)(购自Santa Cruz B1technology,目录号:sc_61)。结果见图3,实验组小鼠肝脏中的CEBPA蛋白含量显著低于对照组小鼠，即在sgRNA和CAS9蛋白的作用下，CEBPA蛋白的编码基因发生了剪切，从而CEBPA蛋白含量显著降低。
【权利要求】
1.携带Cas9蛋白的编码基因的重组腺病毒；所述Cas9蛋白如序列表的序列7所示。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于:所述Cas9蛋白的编码基因如序列表的序列6自5’末端第789-5045位核苷酸所不。
3.如权利要求1或所述的重组腺病毒，其特征在于:其制备方法包括如下步骤: (1)将所述Cas9蛋白的编码基因插入pDONR?221载体的attLl和attL2位点之间，得到中间质粒； (2)将中间质粒与pAD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒，即为重组质粒PAD-DEST-CAS9 ； (3)将重组质粒pAD-DEST-CAS9导入哺乳动物细胞并培养，得到所述重组腺病毒。
4.如权利要求3所述的重组腺病毒，其特征在于:所述哺乳动物细胞为293细胞。
5.—种重组质粒，其制备方法如下: (1)将所述Cas9蛋白的编码基因插入pDONR?221载体的attLl和attL2位点之间，得到中间质粒； (2)将中间质粒与p AD-DEST载体发生gateway反应，得到含有所述CAS9蛋白的编码基因的重组质粒。
6.权利要求1至4中任一所述的重组腺病毒在制备用于敲除目的基因的试剂盒中的应用。
7.一种用于敲除目的基因的试剂盒，包括权利要求1至4中任一所述的重组腺病毒。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组慢病毒。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于:所述试剂盒还包括携带所述目的基因的sgRNA的编码基因的重组质粒。
10.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于:所述目的基因为CCAAT增强子结合蛋白-A。
【文档编号】C12N15/861GK104178461SQ201410400098
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2014年8月14日 优先权日:2014年8月14日
【发明者】张普民, 程然然, 彭瑾, 闫永红, 卞广兴 申请人:北京蛋白质组研究中心