本发明涉及一种小窝蛋白-1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用，属于生物医药领域。
背景技术：
有各种感染疾病诱发的急性肺损伤及其严重阶段的急性呼吸窘迫综合症，发病率高，并且目前尚无有效治疗药物故死亡率也极高。因此研发有效治疗急性肺损伤疾病的药物是具有非常重要的临床意义。
小窝蛋白-1是细胞膜小窝的重要组成蛋白，其第82～101位氨基酸被称为小窝蛋白-1脚手架区在细胞信号转导、跨膜物质转运等生物学功能发挥重要作用。最近的研究表明，利用腺病毒或者慢病毒为载体能够治疗各种肝、肺和肾脏等脏器纤维化疾病。但由于基因治疗所用载体腺病毒或者慢病毒具有诸如费用昂贵、操作复杂、诱导宿主免疫反应和潜在的致病风险等严重缺陷，无法在医院广泛推广。最近的研究发现小窝蛋白-1脚手架区能够替代小窝蛋白-1的功能，同样具有多种治疗作用。
生物活性多肽作为药物具有其独特的优点：首先，分子量小，无免疫原性，比较安全：其次，结构相对简单，功能较明确，特异、副作用小；第三，分子小，易于合成，结构易于改造，生产成本低；第四，多肽药物易于从多途径吸收，因此给药途径可多样化(如口服、喷雾、透皮吸收等)；第五，合成的多肽纯度较高，不存在热源问题。正因为如此，国内外对多肽药物的研究特别重视。
技术实现要素：
为了解决上述问题，本发明提供了具有抗炎作用的小窝蛋白-1脚手架区融合多肽及其制备方法，以及融合多肽在制备抗炎药物方面的应用。
本发明的第一个目的是提供一种具有抗炎作用的小窝蛋白-1脚手架区融合多肽，所述多肽的氨基酸序列为dgiwkasfttftvtkywfyrrqikiwfqnrrmkwkk(序列如seqidno:1所示)。
本发明的第二个目的是提供编码所述多肽的核苷酸序列。
本发明的第三个目的是提供一种抗炎药物，所述抗炎药物以氨基酸序列为seqidno:1所示的多肽作为有效成分或者主要有效成分。
在一种实施方式中，所述药物中还包括药学上可接受的赋型剂。所述药学上可接受的赋型剂是指任何可用于药学领域的稀释剂、辅助剂和/或载体。
在一种实施方式中，本发明的多肽可以与其他活性成分组合使用，只要它们不产生其他不利的作用，例如过敏反应。
在一种实施方式中，本发明的药物可配制成若干种剂型，其中含有药学领域中常用的一些赋形剂；例如，口服制剂(如片剂，胶囊剂，溶液或混悬液)；可注射的制剂(如可注射的溶液或混悬液，或者是可注射的干燥粉末，在注射前加入注射用水可立即使用)；局部制剂(例如软膏或溶液)。
在一种实施方式中，用于本发明药物的载体是药学领域中可得到的常见类型，包括：口服制剂用的粘合剂、润滑剂、崩解剂、助溶剂、稀释剂、稳定剂、悬浮剂、无色素、矫味剂等；可注射制剂用的防腐剂、加溶剂、稳定剂等；局部制剂用的基质、稀释剂、润滑剂、防腐剂等。药物制剂可以经口服或胃肠外方式(例如静脉内、皮下、腹膜内或局部)给药，如果某些药物在胃部条件下是不稳定的，可将其配制成肠衣片剂。
本发明的第四个目的是提供一种所述多肽的制备方法。
在一种实施方式中，所述多肽是采用微波辅助固相合成法制备得到的。
在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，以吡啶/二甲基甲酰胺为溶剂，苯丙三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯为缩合试剂，反应物浓度为0.113mmol/l，反应时间为4分钟，反应温度为20℃。此时脚手架区多肽的产率最高，为87.7％，纯度为97％。
在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，是先制备fmoc-tyr(t-bu)-wang树脂并封闭未反应羟基，然后采用微波辅助脱除fmoc保护基，再微波辅助缩合fmoc-tyr(t-bu)-0h反应，按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区多肽。
在一种实施方式中，所述多肽的制备方法，包括下列步骤：
1)fmoc-tyr(t-bu)-wang树脂的制备及未反应羟基的封闭
称量wang树脂置于反应器中，加入二氯甲烷溶胀树脂，抽滤脱去二氯甲烷溶剂，将fmoc-tyr(t-bu)-0h连接到树脂上；分别加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲酰胺各洗涤树脂三次；向上面得到的树脂中加入乙酸酐和吡啶，反应2h；最后加入二氯甲烷和甲醇各漂洗树脂以封闭未反应羟基。
2)微波辅助脱除fmoc保护基
将上一步得到的fmoc-tyr(t-bu)-wang树脂置于反应管中，然后加入哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反应在微波反应器中进行，时间为6min-10min；
3)微波辅助缩合fmoc-tyr(t-bu)-0h反应
称量fmoc-tyr(t-bu)-0h，ⅳ-羟基-7-偶氮苯丙三氮唑和羟基一苯并三氮唑，其中氨基酸过量1倍，用适量的二甲基甲酰胺溶解；然后加入到树脂中，同时加入的二异丙基乙基胺，微波辐射下反应；然后抽滤掉反应液，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各洗涤3次；
4)肽链的延长
按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区多肽，此过程中各个氨基酸的过量倍数均为1倍。
本发明还要求保护表达所述多肽的转基因细胞系、含有编码所述多肽的载体、含有编码所述多肽的宿主等等。
本发明的优点和效果：
本发明制备得到的小窝蛋白-1脚手架区多肽纯度大于97％，产量达到87.7％。体外实验和体内实验表明，该多肽能够明显降低炎症环境中原代培养的大鼠巨噬细胞和小鼠肺组织中白介素-1、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1和诱导型一氧化氮合酶等各种促炎症因子的表达，从而达到抗炎的目的。
具体实施方案
下面的实例将具体说明本发明的操作方法，但不能作为对本发明的限定。
实施例1：微波辅助固相合成小窝蛋白-1脚手架区多肽的具体主要操作步骤
(1)fmoc-tyr(t-bu)-wang树脂的制备及未反应羟基的封闭
称量wang树脂2g置于反应器中，加入二氯甲烷15ml溶胀树脂30min，抽滤脱去二氯甲烷溶剂，将fmoc-tyr(t-bu)-0h连接到树脂上。反应结束后，分别加入二氯甲烷，甲醇和二甲基甲酰胺各2ml各洗涤树脂三次。未反应羟基的封闭：向上面得到的树脂中加入乙酸酐和吡啶，反应2h。反应结束后，加入二氯甲烷和甲醇各漂洗树脂3次。
(2)微波辅助脱除fmoc保护基
将0.1mmolfmoc-tyr(t-bu)-wang树脂置于反应管中，然后加入2ml20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液，反应在微波反应器中进行，时间为6min-10min。反应结束后，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各2ml洗涤树脂3次。
(3)微波辅助缩合反应
1)缩合fmoc-tyr(t-bu)-0h称量fmoc-tyr(t-bu)-0h0.1g，ⅳ-羟基-7-偶氮苯丙三氮唑0.1g和羟基一苯并三氮唑0.23g，氨基酸过量1倍，用二甲基甲酰胺溶解。然后加入到树脂中，同时加入0.34mmol的二异丙基乙基胺，微波辐射下反应；然后抽滤掉反应液，分别加入二氯甲烷、甲醇和二甲基甲酰胺各2ml洗涤树脂3次。
2)肽链的延长按照脚手架区多肽中氨基酸从羧基到氨基端的顺序，重复缩合和脱保护两步反应，合成脚手架区融合多肽，此过程中各个氨基酸的过量倍数均为1倍。最终得到以吡啶/二甲基甲酰胺为溶剂，苯并三氮唑/二四甲基脲六氟磷酸酯为缩合试剂，反应物浓度为0.113mmol/l，反应时间为4分钟，反应温度为20℃为最佳反应条件，此时脚手架区多肽的产率最高，为87.7％，纯度为97％。比传统单纯固相合成的方法相比，微波将缩合反应速率提高了15倍以上，氨基酸过量倍数也从传统的3倍降低到过量1倍，减少脚手架区多肽的合成成本约40％。
最终合成得到序列如seqidno:1所示的csd多肽。
实施例2：小窝蛋白-1脚手架区多肽降低原代培养的大鼠巨噬细胞中白介素-1、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1和诱导型一氧化氮合酶等各种促炎症因子的表达
分离培养原代大鼠肺泡巨噬细胞，将细胞分为5组，(1)normal组(即对照组)：完全培养基培养；(2)ap组：预处理10μmap多肽；(3)lps组：100ng/mllps处理16h；(4)lps+hemin组：20μmhemin和lps处理16h；(5)lps+hemin+csd多肽组：10μmcsd多肽预处理6h后，lps和hemin处理16h。
1.原代肺泡巨噬细胞的分离纯化培养：通过气管插管用冷的生理盐水对雄性sd大鼠进行肺泡灌洗，将获得灌洗液4℃，1,000rpm离心10min后，将沉淀重悬与dmem完全培养基中，2h后换液，贴壁的为原代大鼠的肺泡巨噬细胞。
2.实时荧光定量pcr法检测炎症因子和m1/m2表型标志物：提取给药处理后细胞的总rna，将其分别逆转为等量的cdna，通过syrbgreen实时荧光定量pcr法检测相关基因的表达水平。测定结果：lps组与正常组和ap组相比，可以明显增加炎症因子白介素-1(il-1β)和单核细胞趋化蛋白-1(mcp-1)以及经典活化巨噬细胞型(m1型)标志物肿瘤坏死因子α(tnf-α)和诱导型一氧化氮合酶(inos)的基因表达水平(p<0.05)，说明lps可以诱导巨噬细胞炎症损伤。
而细胞预处理6hcsd多肽组则可以降低炎症因子及m1表型标志物的基因表达水平，并且增加替代性活化巨噬细胞型(m2型)标志物白细胞分化抗原163(cd163)，白介素-10(il-10)的表达水平，说明csd多肽的预处理可有效增强巨噬细胞抵抗炎症损伤的能力，并且使得巨噬细胞从m1到m2表型极化增多，进而起到抗炎保护作用。其中，与lps+hemin组相比，lps+hemin+csd多肽组的il-1β、mcp-1、tnf-α、inos的表达量分别降低了61％、43％、50％、44％左右；而cd163和il-10的表达量分别提高了62％、98％。
3.griess法检测细胞培养基中一氧化氮的表达量：收集给药处理细胞培养基上清，通过griess显色法检测其中一氧化氮的表达量。正常组，ap组一氧化氮的表达量分别为4.92±1.35，5.01±1.51，两者之间无显著性差异。lps组，lps+hemin组，lps+hemin+csd组培养基中一氧化氮的表达量分别为120.22±9.65，113.92±9.85，90.33±15.62，较正常组lps可显著增加一氧化氮表达量(p<0.05)，lps+hemin组较lps组可降低一氧化氮的表达量但两者无显著性差异，而较lps+hemin组csd预处理可明显降低一氧化氮的表达水平(p<0.05)。说明csd多肽的预处理不但可以降低基因水平炎症因子的表达水平且可以降低胞外一氧化氮的表达量。
4.ho-1活性检测：通过检测血红素的分解代谢产物胆红素的含量比较ho-1活性高低。正常组，ap组，lps组，lps+hemin组，lps+hemin+csd组的ho-1活性分别为1124±92、1179±31、1776±82、2410±131、3677±270。lps组较正常组可增加ho-1活性(p<0.05)，lps+hemin组较lps组可显著增加ho-1活性(p<0.05)，csd预处理组可更进一步显著增加ho-1活性(p<0.05)。说明csd是通过增加ho-1活性产生的对巨噬细胞的抗炎保护作用。
实施例3：小窝蛋白-1脚手架区多肽降低肺组织中白介素-1、肿瘤坏死因子-α、单核细胞趋化蛋白-1和诱导型一氧化氮合酶等各种促炎症因子的表达
将清洁级成年雄性balb/c小鼠60只随机分为6组，(1)sham组(即假手术组)：小鼠腹腔注射300μl生理盐水；(2)ap组：腹腔注射4mg/kgap多肽；(3)lps组：小鼠气管滴注5mg/kglps溶液；(4)lps+hemin组：小鼠腹腔注射50μmol/kghemin溶液，24h后气管滴注lps溶液；(5)lps+hemin+csd组：小鼠腹腔注射50μmol/kghemin和4mg/kgcsd多肽，24h后气管滴注溶液；(6)lps+hemin+csd+znpp组：小鼠第一天腹腔注射hemin，连续两天腹腔注射csd多肽，lps气管滴注前2h腹腔注射50μmol/kgznpp。
1.肺组织病理形态改变：将取下的左肺在中性甲醛溶液中固定24h后,脱水、石蜡包埋、切片，经苏木素伊红(hematoxylineosin,he)染液染色观察肺损伤程度。正常组及ap组小鼠肺泡结构完整，肺泡腔无炎性细胞浸润；而lps组小鼠肺部可以观察到炎性细胞浸润，肺泡壁增厚，大量红细胞渗出，肺泡断裂，肺泡腔萎缩不张；lps+hemin+csd组肺组织损伤明显减轻，lps+hemin+csd+znpp组出现严重的肺结构破坏情况。
2.肺湿干比检测：分离小鼠肺组织后，肺组织称湿重后置于60℃温箱，72h后至恒重后再记录肺组织干重，计算湿/干重比。正常组、ap组、lps组、lps+hemin组、lps+hemin+csd组及lps+hemin+csd+znpp组肺湿干比分别为4.06±0.08、4.06±0.39、5.02±0.24、4.80±0.21、4.31±0.11以及5.29±0.31。较lps组和lps+hemin组，csd多肽可以有效地降低lps引起的肺水肿表现为湿干比降低。
3.小鼠血清乳酸脱氢酶(ldh)活力检测：分离小鼠血清，分别设定空白孔、标准孔、测定孔和对照孔测定血清ldh活力。正常组、ap组、lps组、lps+hemin组、lps+hemin+csd组及lps+hemin+csd+znpp组ldh活力分别为1501±136、1526±160、3933±453、3740±182、3555±343以及4250±102。csd多肽预处理可以明显降低血清中ldh活性。
4.实时荧光定量pcr检测小鼠肺组织炎症因子的表达：称取20mg小鼠肺组织，提取组织总rna，将其分别逆转为等量的cdna，通过syrbgreen实时荧光定量pcr法检测相关基因的表达水平。与正常组比较，lps组肺组织中il-1β、il-6、tnf-α、mcp-1和inos等炎症因子表达明显增高(p<0.05)；而与lps组相比，lps+hemin+csd组各炎症因子的表达明显降低(p<0.05)；与lps+hemin+csd组相比，lps+hemin+csd+znpp组肺组织中各炎症因子表达明显增高(p<0.05)。说明csd多肽在体内也具有抗炎保护作用。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110>江南大学
<120>一种小窝蛋白-1脚手架区融合多肽的制备方法及其应用
<160>1
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>36
<212>prt
<213>人工序列
<400>1
aspglyiletrplysalaserphethrthrphethrvalthrlystyr
151015
trpphetyrargargglnilelysiletrppheglnasnargargmet
202530
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35