一种B型流感病毒广谱中和抗体、其制备方法及应用与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种流感病毒抗体、其制备方法及应用，尤其涉及一种b型流感病毒广谱中和抗体、其制备方法及应用。

背景技术：

流感病毒(influenzavirus)是引起流行性感冒的人畜共患传染病病原，属于正粘病毒科(orthomyxoviridae)，流感病毒属。按照流感病毒核蛋白和基质蛋白抗原性的不同，流感病毒可分为a、b、c三型，近年来发现的牛流感病毒归为了d型。

a型流感病毒可引起人、禽、哺乳动物和蝙蝠等感染和发病，危害最为严重。根据病毒颗粒表面血凝素蛋白(hemagglutinin，ha)和神经氨酸酶(neuraminidase，na)的不同，a型流感病毒可分为多个亚型，目前已发现的ha有18个亚型(h1-h18)，na有11个亚型。a型流感病毒容易发生抗原变异和漂移，曾四次引起世界性大流感，也是季节性流感的主要元凶。b型流感种系较少。自1940年首次分离后，b型流感病毒逐渐进化成以b/victoria/2/1987为代表的b-victorialineage(bv)和以b/yamagata/16/1988(by)的两个种系。截止目前为止，b型流感病毒仅为3个种系：现在流行的bv系、by系，以及在bv和by出现以前的b型流感毒株种系。

b型流感病毒的自然宿主主要是人，曾经在海豹中检测到。b型流感病毒的变异频率和宿主范围比a型流感病毒要低，要小，也从未造成过流感大流行。人们认为b型流感病毒的危害远远低于a型流感病毒，这致使b型流感的研究也相应较少。然而，近些年来有研究发现，b型流感病毒在特定的情况下 所导致的疾病负担甚至超过了a型流感病毒。原因在于b型流感多发于儿童和老年人。幼儿园或学校等人群密集环境因素使得b型流感在儿童间呈集体性暴发，儿童感染后常见的临床症状为高烧、肌肉酸痛、咳嗽和头痛等，如治疗不及时，可在短时间内引发肺炎、脑膜炎和心肌炎等症状。由于老年人抵抗力较低，感染b型流感后出现并发症较多，致使病情严重，无疑增加了死亡率。在2013-2014年流感流行季节，在北美地区特别是美国爆发了大范围的b型流感疫情，使得美国疾病预防控制中心提出了b型流感病毒的致病性不可低估的指导性意见。

疫苗接种是目前预防和控制流感的首选策略。临床上经常使用流感疫苗包括a型流感病毒中的h1n1亚型流感病毒、h3n2亚型流感病毒和一个种系b型流感病毒三种流感组份，为三价流感疫苗。近些年来，季节性流感疫苗又增加了一个种系的b型流感病毒组分，称之为四价疫苗。流感疫苗候选毒株会随着流行毒株的变化而更新，然而仍然赶不上季节性流感病毒变异的速度，更无法预防跨种传播而来的禽流感和猪流感。简而言之，流感病毒的不可预测性及高度的变异性致使流感防控成为研究的重点与难点。这些无疑使得能预防多个亚型a型流感病毒或多个种系b型流感病毒的广谱流感疫苗显得尤为重要。研究学者尝试了多种方法来开发广谱流感疫苗，如表达高度保守的ha茎部区作为亚单位疫苗、或以形成纳米颗粒的蛋白为骨架，递呈ha茎部区的病毒样颗粒疫苗等。此外，在广谱流感疫苗的概念和基础上，广谱流感病毒中和抗体也逐渐成为流感预防和治疗药物的研究焦点和重点。

ha是流感病毒的主要表面抗原，结合在ha受体结合部位或茎部区的抗体能有效抑制ha蛋白的受体结合和膜融合活性。目前，已有多个靶向ha头部区的人源或鼠源单克隆抗体，其中11个抗体的抗原抗体复合物结构已解析。这类 抗体主要通过抑制病毒与受体结合来发挥作用。大多数为型特异性，也有一些广谱型单克隆抗体，如可中和多个a型流感病毒亚型的广谱中和抗体c05、f045-092、s139/1，以及中和多个b型流感病毒种系的cr8033和cr8071人源单克隆抗体。ha头部的抗原变异较为频繁，容易发生免疫逃逸现象，ha茎部区相对于头部区更为保守，靶向ha茎部区的广谱型抗体的研发更受青睐。近些年研发出较多靶向ha茎部区的单克隆抗体：如cr6261，f10，cr8020，fi6v3和6f12等。cr6261和f10可中和group1的a型流感病毒，cr8020可中和group2的a型流感病毒，而fi6v3甚至可中和所有亚型的ha，而cr9114抗体则是可中和a型流感病毒和b型流感病毒超级广谱中和抗体。

常用的人源流感病毒中和抗体的筛选方法有噬菌体抗体库展示筛选、单个b细胞测序技术、b细胞永生化和人源化小鼠杂交瘤细胞筛选等等，目前，已利用这些方法获得了多种人源广谱中和抗体，如c05、f045-092、cr6261、cr9114、cr8033、cr8071、f10和fi6v3等。而我们则利用高通量测序的方法获得了一株a型流感病毒的广谱中和抗体af4h1k1。这种方法利用患者或疫苗免疫个体的pbmc来构建抗体文库，采用二代高通量测序的方式获得bcr文库，通过分析感染或疫苗不同免疫时期的抗体重链和轻链可变区的频率变化来挑选，简化了抗体的筛选流程，为抗体药物的研发提供了一个捷径。

技术实现要素：

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供了一种流感病毒抗体、其制备方法及应用，特别是一种b型流感病毒广谱中和抗体、其制备方法及应用。本发明提供的b型流感病毒广谱中和抗体为流感的预防和治疗提供了新的治疗方法，为b型流感病毒感染诊断以及b型流感病毒表面抗原ha的检测提供了新的选择，具有重要的经济和社会意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

在本发明的第一方面，本发明提供了一种b型流感病毒广谱中和抗体，所述抗体为人源单克隆抗体。根据本发明的实施例，该抗体的轻链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.5、seqidno.6和seqidno.7所示；其重链高变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别如seqidno.8、seqidno.9和seqidno.10所示。

根据本发明的实施例，所述抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seqidno.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；其重链可变区的氨基酸序列如seqidno.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或多个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

根据本发明的实施例，序列可以包含某些生物学功能等同的氨基酸或“保守性替代”，其它序列可以包含功能非等同的氨基酸或“非保守性替代”，其经基因工程改造以改进cdr或含cdr抗体的特性。

根据本发明的实施例，前面所述的氨基酸序列如下：

seqidno.1：

diqltqspsflstsvgdrvtitcrashdiysylawyqqkpgkapklliyaastlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyycqqlrsypytfgqgtkleik。

seqidno.2：

qvqlvqsgselrrpgasvkisckasgytftdyamnwvrqvpgqglewvgwintdngnptyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfcaanwggyyydssvnsgggyfdnwgqgtlvtvfs。

seqidno.5：hdiysy。

seqidno.6：aas。

seqidno.7：qqlrsypyt。

seqidno.8：gytftdya。

seqidno.9：intdngnp。

seqidno.10：aanwggyyydssvnsgggyfdn。

根据本发明的实施例，所述抗体的轻链框架区fr1、fr2和fr3的氨基酸序列如seqidno.11、seqidno.12或seqidno.13所示；其重链框架区fr1、fr2和fr3的氨基酸序列如seqidno.14、seqidno.15或seqidno.16所示。

根据本发明的实施例，前面所述的氨基酸序列如下：

seqidno.11：diqltqspsflstsvgdrvtitcras。

seqidno.12：lawyqqkpgkapklliy。

seqidno.13：tlqtgvpsrfsgsgfgteftltisslqpedfgtyyc。

seqidno.14：qvqlvqsgselrrpgasvkisckas。

seqidno.15：mnwvrqvpgqglewvgw。

seqidno.16：tyaeafagrfvfsldtsvstaylqisslkaddtavyfc。

根据本发明的实施例，所述抗体为人源单克隆抗体。

根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体、双链抗体、嵌合抗体或其衍生物。

发明人发现，根据本发明实施例的抗体或其抗原结合片段，能够很好的中和yamagata种系、victoria种系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，该抗体能抑制b型流感病毒凝集鸡红细胞的能力，是血凝抑制抗体；且所述抗体能抑制b型流感病毒在小鼠体内的复制，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的体重 下降，保护小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％存活率，从而可以有效预防和治疗由b型流感病毒引起的疾病。

在本发明的第二方面，本发明提供了一种dna片段。根据本发明的实施例，该dna片段编码如第一方面所述的抗体。

根据本发明的实施例，前面所描述的dna片段，包含重链可变区编码序列和轻链可变区编码序列；其编码轻链可变区和重链可变区的核苷酸序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示。

根据本发明的实施例，前面所述的核苷酸序列如下：

seqidno.3：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggggaccaaactggagatcaaa。

seqidno.4：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattgg ggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

发明人发现，通过采用根据本发明的多核苷酸，能够有效地合成根据本发明实施例的b型流感病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段。关于b型流感病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该多核苷酸，在此不再赘述。

在本发明的第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包含至少一个拷贝的如第二方面所述的dna片段。

在本发明的第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含如第三方面所述的表达载体。

发明人发现，通过采用根据本发明的方法，能够利用前面所述的多核苷酸有效地合成根据本发明实施例的b型流感病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段。关于b型流感病毒广谱中和抗体或其抗原结合片段，前面所描述的特征和优点同样适用该多核苷酸，在此不再赘述。

在本发明的第五方面，本发明提供了一种如第一方面所述b型流感病毒广谱中和抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分离季节性流感疫苗免疫者外周血中的单个核细胞(pbmc)，提取rna，反转录cdna；

(2)扩增重链和轻链的高度可变区序列，根据cdr丰度进行挑选并合成；

(3)将合成的抗体片段构建到表达载体中。

根据本发明的实施例，所述抗体的制备方法可以采用本领域技术人员熟知的技术进行，在此不做特殊限制。

根据本发明的实施例，步骤(3)所述的载体为哺乳动物表达载体，优选为 pcaggs哺乳动物表达载体。

考虑到密码子的简并性，例如可在其编码区，在不改变氨基酸序列的条件下，对编码上述抗体的基因序列进行改造，获得编码具有相同功能的抗体的基因。本领域技术人员可以根据表达抗体宿主的密码子偏爱性，人工合成改造基因，以提高抗体的表达效率。

进一步地，本发明将前面所述抗体的轻链可变区和重链可变区进行重组，可获得分子量更小的单链抗体(scfv)，该抗体同样能够特异性识别b型流感病毒表面抗原ha。单链抗体穿透力强，易于进入局部组织发挥作用。可将上述编码抗体的基因、scfv基因克隆到表达载体中，进而转化或转染宿主细胞，获得所述抗体以及单链抗体。

此外，可将前面所述抗体的轻链可变区编码基因和重链可变区编码基因克隆到全抗表达载体中，并导入宿主细胞中，获得表达抗b型流感病毒的全抗免疫球蛋白。

利用血凝抑制试验，以及中和试验等方法对获得的b型流感病毒抗体进行功能鉴定，结果表明所述抗体针对b型流感病毒均有特异性结合，利用中和试验对所述抗体进行功能鉴定，结果表明该抗体对yamagata种系、victoria种系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒均具有较好的中和活性。

在本发明的第六方面，本发明提供了如第一方面所述的b型流感病毒广谱中和抗体，或如第二方面所述b型流感病毒广谱中和抗体的dna片段，或如第三方面所述的表达载体，或如第四方面所述的宿主细胞在制备预防或治疗由b型流感病毒引起的疾病的药物中的应用。

本发明还提供了一种药物组合物。根据本发明的实施例，该药物组合物包含前面所述的抗体或其抗原结合片段或前面所述的dna片段。

在本发明的第七方面，本发明提供了如第一方面所述的b型流感病毒广谱中和抗体在制备对多种系b型流感病毒的ha抗原具有亲和力和中和活性的试剂中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明所述抗体能够很好的中和yamagata种系、victoria种系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，该抗体能抑制病毒凝集鸡红细胞的能力，是血凝抑制类抗体，其hi效价在0.24μg/ml-4.7μg/ml之间，其中和效价ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之间；

(2)本发明所述抗体能够抑制b型流感病毒在小鼠体内的复制，抑制b型流感病毒感染后小鼠的体重下降，保护小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％的存活率；

(3)本发明所述抗体的获得为b型流感的预防和治疗提供了新的候选，具有重要的经济和社会意义。

附图说明

图1是本发明制备的0809抗体的igg和fab经superdextm20010/300gl分子筛层析纯化结果；

图2为本发明制备的抗体0809在balb/c体内预防效力评估，其中，图2(a)为小鼠感染病毒后的体重变化；图2(b)为小鼠感染病毒后的存活率；

图3为本发明制备的抗体0809在balb/c体内抑制病毒复制的评估，其中，图3(a)为攻毒后3天的肺部病毒滴度；图3(b)为攻毒后5天的肺部病毒滴度。

下面对本发明进一步详细说明。但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为 准。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，需要说明的是下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。另外，如果没有明确说明，在下面的实施例中所采用的所有试剂均为市场上可以购得的，或者可以按照文本或已知的方法合成的，对于没有列出的反应条件，也均为本领域技术人员容易获得的。

实施例1抗体的制备

b型流感病毒广谱中和抗体的制备方法，包括如下步骤：

(1)在志愿者接种季节性流感疫苗后的0天和7天采集外周血中的pbmc，提取rna，反转录cdna；

(2)扩增出重链和轻链的高度可变区序列，将扩增的目的片段利用miseq2x300bp进行测序，并对测序结果进行分析；

(3)以cdr丰度为主要参数挑选免疫者免疫7天后的高频可变区序列，并通过重链轻链配对算法计算自然配对的几率，接着挑选出cdr1、cdr2和cdr3的高频出现的vh和vl序列加上各自的恒定区进行合成；

所述轻链可变区(vl)的核苷酸序列为：

gacatccagttgacccagtctccatccttcctgtctacatctgtaggggacagagtcaccatcacttgccgggccagtcacgacatttacagttatttagcctggtatcagcaaaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgctgcatccactttgcaaactggggtcccatcaaggttcagcggcagtggatttgggacagagttcactctcacaatcagcagcctgcagcctgaagattttggaacttattactgtcaacaacttaggagttacccgtacacttttggccaggg gaccaaactggagatcaaa；

所述重链可变区(vh)的核苷酸序列为：

caggtgcagctggttcaatctgggtctgagttgaggaggcctggggcctcagtgaaaatttcgtgcaaggcttccggatacaccttcaccgactatgctatgaattgggtccgccaggtccctggacaaggtttggagtgggtgggatggatcaacaccgacaatgggaacccaacgtatgccgaggccttcgccggacggtttgtcttctccttggacacctctgtcagcacggcatatctgcagatcagcagcctaaaggctgacgacactgccgtatacttttgtgcggccaattggggaggctattattatgatagttctgttaattccggcgggggctactttgacaactggggccagggaaccctggtcaccgtcttctca。

(4)以igg和fab形式，在n端加入对应的重链和轻链的分泌信号肽后，将抗体片段构建到pcaggs哺乳动物表达载体；

(5)将插入重链和轻链序列的pcaggs表达载体，通过pei转染试剂共转染293t细胞进行大量表达，并进行纯化；

(6)在质粒转染后96h后收获293t上清，而后，经过离心、0.22μm的滤膜过滤，亲和层析纯化和分子筛层析纯化获得纯度较高的fab或者igg。纯化后的抗体，经elisa检测，获得具有b型流感病毒结合活性的一株单克隆抗体，命名为0809。0809经superdextm75hiload20/16075pg分子筛层析纯化的结果如图1所示。由图1可见，通过纯化后都能得到单一所要抗体的igg或fab的形式。

实施例2抗原抗体亲和力测试

利用表面等离子共振技术，将0809的fab(10μg/ml)形式通过氨基偶联的作用固定到cm5芯片上，固定值达到500ru，流动相抗原蛋白b型流感病毒 ha按2倍比稀释(浓度范围1μm-100μm)。选取kinject模式进行动力学参数测定，机器流速30μl/min，进样时间1-2min，解离时间2-6min。而后，利用biaevaluation软件计算亲和力，表1示出了0809fab与各种系b型流感病毒ha的亲和力测定结果。由表1可以看出，0809与b型流感病毒yamagata和victoria种系的ha结合解离模式几乎都是快结合快解离，亲和力大小分别为4.11nm和7.63nm。

表1.0809fab与各种系b型流感病毒ha的亲和力测定

实施例3抗体的血凝抑制(hi)试验与中和试验

血凝抑制试验：采用固定病毒稀释抗体的方法，将0809igg抗体稀释液同4个血凝单位的b型流感病毒在室温下作用30min，而后加入同病毒液同等体积的1％鸡红细胞，表2示出了0809igg与各种系b型流感病毒的血凝抑制活性。结果发现0809igg是血凝抑制性抗体，对不同种系的b型流感病毒均有较高的血凝抑制活性，hi效价在0.24μg/ml-4.7μg/ml之间。

中和试验：采用固定病毒稀释抗体的方法，将0809igg抗体稀释液同等体积的200tcid50不同b型流感病毒毒株混合在一起，室温放置1h。而后将病毒抗体混合液接种96孔板的细胞，100μl/孔。放置37℃作用1h后，将上清去掉，用dmem洗涤三次，而后加入含有0.5μg/ml胰酶的dmem维持液。放在37℃ 培养72h。每天观察并记录细胞病变(cpe)，并在最后一天，利用血凝的方法检测每孔细胞上清的血凝活性，以此来判断有无病毒复制，以及抗体的中和效果，表2示出了0809igg与各种系b型流感病毒的中和活性。结果表明0809igg对不同种系的b型流感病毒均有较高的中和活性，ic50在0.02μg/ml-1.21μg/ml之间。

表2.0809igg与各种系b型流感病毒血凝抑制活性和中和活性测定

实施例4体内抗体预防效果

(1)预防实验

小鼠尾静脉注射0809igg抗体，剂量分别为15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg和1mg/kg。同时设定无关抗体igg为对照组，剂量为10mg/kg。抗体注射24h后干冰麻醉小鼠，滴鼻感染小鼠适应毒b/lee/1940。每组15只，其中5只用来 检测感染后3天肺中病毒滴度，5只用来检测感染后5天肺中的病毒滴度，剩下5只用来观察感染后14天内小鼠的体重变化及生存率。结果发现，0809给药剂量为1mg/kg时，同高剂量一样(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg)，能抑制病毒感染引起的体重降低，如图2(a)，并能提供100％的保护，见图2(b)。0809抗体四个剂量组(15mg/kg、10mg/kg、5mg/kg、1mg/kg)均能100％保护小鼠，因此在图2(b)中显示代表这四组的小鼠存活曲线完全重叠在一起。

(2)肺中病毒滴度的测定

感染后3天和5天的小鼠肺组织匀浆机磨成匀浆后，2000rpm，4℃，10min离心，取离心后的上清，按10倍倍比稀释后加入pbs洗两次的96孔板培养的mdck细胞，每孔100μl，每个梯度3个复孔。37℃，5％co2培养箱培养72h，每天观察细胞病变，并与第3天测定血凝试验结果，用reed-muench方法计算肺的tcid50。结果表明，在感染后3天(图3(a))，0809igg能够中和小鼠体的b/lee/1940病毒，抑制病毒在小鼠肺内的复制，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg组同阴性抗体对照组(10mg/kg剂量)相比，差异极其显著(***p<0.001)，而1mg/kg剂量，差异也显著(*p<0.05)。在感染后5天(图3(b))，15mg/kg、10mg/kg和5mg/kg的0809igg处理组小鼠的肺部病毒已经完全清除，而1mg/kg组还有些许病毒，但是同阴性抗体组相比，病毒滴度还是有所降低，差异显著(*p<0.05)。

通过上述实施例可以看出，本发明所述抗体能够很好的中和yamagata种系、victoria种系和古老的b/lee/1940株的b型流感病毒，该抗体能抑制b型流感病毒凝集鸡红细胞的能力，是血凝抑制抗体；且所述抗体能抑制b型流感病毒在小鼠体内的复制，抑制b型流感病毒感染小鼠引起的体重下降，保护小鼠在b型流感病毒感染后仍有100％存活率，具有重要的经济和社会意义。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细结构特征，但本发明并不局限于上述详细结构特征，即不意味着本发明必须依赖上述详细结构特征才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用部件的等效替换以及辅助部件的增加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。