专利名称：用于h5亚型流感病毒通用检测的结合蛋白和表位阻断elisa的制作方法
技术领域：
本发明涉及开发一种用于检测禽流感病毒抗体的特异性血清学分析。更具体 地，本发明涉及单克隆抗体的制备，所述单克隆抗体与所有已知的H5流感病毒亚型强烈 反应，但不与非H5流感亚型交叉反应，其用于开发用于检测人和非人动物中H5流感亚 型的血清抗体和相关结合蛋白的表位阻断ELISA。
背景技术：
禽流感病毒(AIV)是禽类常见疾病。1996年在中国广东省饲养的鹅中发现第一 例家禽的H5N1亚型AIV的感染，1年后在香港发现第一例人的H5N1亚型AIV感染[1]。 从那时起，H5mAIV造成禽流感的爆发，其波及世界许多地区。迄今为止受影响的地区 包括欧洲，中东和特别是亚洲[2]。根据世界卫生组织(WHO)的最新报告，总共有328 例确认的人H5N1禽流感病例，其中200例导致患者的死亡。在这328个病例中，据报 道绝大多数(106例，85例死亡)来自印度尼西亚[3，4]。根据WHO，基于病毒进化为 能够有效的在人与人之间传播的毒株，全球现在处于大范围流行警报的第3级(共6级) [5]。在2006年6月，印度尼西亚33个省中的27个报道了家禽中H5N1的爆发，导 致超过1600万只家禽因为患病和扑杀而死亡[6]。养禽业因为禽流感损失数百万元。这 种损失影响了数百万靠家禽维生的人的收入。HPAICH5N1)在家禽中的这种爆发以及现 在人类中病例数的增加引起大家的关注。在爆发初期准确并及时检测病原体存在的能力 将大大有利于控制疾病。此外，它可以减少抗生素滥用并以及时方式提供使用抗病毒治 疗的选择。可用于流感诊断的各种方法包括病毒分离，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)的 病毒抗原检测，通过RT-PCR的分子检测和血清测试。标准病毒分离步骤具有需要数天 来获得结果的缺点，从而限制了临床医生对其的使用。RT-PCR的缺点包括涉及的高成 本，技术熟练人员的要求，污染的可能性以及假阳性结果的后续风险。此外，因为抗原 性漂移，PCR引物可能需要持续更新[7]。病毒中和，血细胞凝集抑制(HI)，ELISA和 免疫印迹测试是血清学诊断的优选方法。但是，中和测定和HI测定不被认为是高度灵敏 的和需要进一步进行亚型分析，并且是高劳动强度和耗时的[8，9],因此不适于血清的 大规模常规检验。ELISA已经被广泛用作研究大量样品的预筛选工具，但市场上只能买 到针对鸡和火鸡血清的间接ELISA系统，因为没有提供其他物种的种特异性二抗。间接 ELISA的进一步限制是要求高的抗原纯度。但是，间接ELISA的最显著缺点在于已知HA 抗原与病毒的其他亚型交叉反应。因此，间接ELISA不是可靠的检测方法。大部分这些方法不仅是麻烦和高劳动强度的，并且耗时和包括获得假阳性结果 的风险。这些技术的进一步限制是流感病毒是碎裂的基因组RNA病毒，已知其经历连续 的突变和遗传重组(抗原性漂移)，使其难于检测病毒[10]。
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考虑到这些常规测定的缺点，并且因为AIV感染对野生动物、家养动物和人的 风险，急需一种新的测定法，其能快速、易用和特异性的用于检测AIV的H5亚型。本 发明代表了在AIVH5亚型的诊断和监测方面的突破。发明概述根据本发明，提供了对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋 白。所述抗体可用于哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染的血清学诊 断。更具体地，每种抗体可用于高灵敏和特异性表位阻断ELISA以检测人和其他动物中 的流感H5亚型。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应但不显示与非H5流感亚型的交 叉反应性。因此，本发明包括与禽流感病毒H5亚型的表位结合的结合蛋白，其基本上具有 单克隆抗体5F8或单克隆抗体1G5的免疫结合特性。结合蛋白可以是单克隆抗体、抗体 片段、嵌合抗体或人源化抗体和优选是单克隆抗体。本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为CNTKCQTP的AIV H5血凝素的表 位结合。本发明还包括结合蛋白，其与氨基酸序列为IHPLTIGE的AIVH5血凝素的表位结合。另一方面，本发明包括一种检测生物样品中H5亚型AIV的方法，其包括将样 品与包含H5亚型血凝素糖蛋白的表位的抗原接触并确定样品中的抗体是否结合所述表 位。优选通过表位阻断ELISA进行结合确定。优选H5亚型血凝素糖蛋白的表位包括序 列CNTKCQTP或序列IHPLTIGE。IHPLTIGE和CNTKCQTP表位存在于所有已知的人 H5N1 AIV株、基本上所有已知的鸡H5N1AIV株和基本上所有已知的其他动物和禽类的 H5N1株中，并且是非常稳定和高度抗原性的，使其非常适用于诊断H5N1感染。本发明还涉及检测生物样品中H5亚型AIV感染的试剂盒，其中所述试剂盒包括 结合H5亚型AIV包膜糖蛋白的表位的结合蛋白以及用于检测所述结合蛋白与所述表位 结合的试剂。在优选实施方案中，所述表位包括序列CNTKCQTP。在另一优选实施方 案中，所述表位包括序列HPLTIGECPK。在优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有 mAb 5F8的免疫结合特性。在另一优选实施方案中，所述结合蛋白基本上具有mAb 1G5 的免疫结合特性。附图简述
图1A-1B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 5F8的表征。图 1A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 5F8对H5N1 AIV感染的MDCK细胞中天然HA1和杆 状病毒表达的rHAl的识别。分别用H5亚型和重组杆状病毒感染MDCK和Sf_9细胞。 对照是H9N2感染的MDCK细胞和Sf_9细胞。图1B显示Western印迹中MAb 5F8对H5N1AIV的识别。通过SDS-PAGE分
析从尿囊液纯化的AIV H5N1 (第1-9道)，H5N2 (第10道)和H5N3 (第11道)，并将 其固定于硝酸纤维素膜。显示对H5亚型的抗体特异性的MAb 5F8不识别阴性对照(无 病毒)，H3N2(第 12 道)，H7N1 (第 13 道)HA。图 2A，2B, 2C 禾口 2D。MAb 5F8 的表位作图。图2A显示用于表位作图的策略。从A到E和SF1到SF8的全部指明片段作为 His融合蛋白表达。图2B显示片段A到E的Western印迹分析，使用MAb 5F8作为一抗。C:rHAl蛋白用作对照。图2C显示8个进一步截短肽(SF1-SF8)的Western印迹 分析结果，所述截短肽是图2A片段4的延伸但在片段5区域截短并作为组氨酸融合肽表 达。图2D显示也作为组氨酸融合肽表达的点突变的Western印迹分析结果。进行分析 以确定针对mAb 5F8的表位的氨基酸序列。图3A和3B显示相对于免疫鸡血清造成的CDC/523/H5HA1表位或rH5HAl 的mAb结合的50%阻断。结果表示为百分阻断值的算术平均值(n = 5/组+标准误差 (SE))。图4A-4B。通过免疫荧光测定(IFA)和Western印迹对mAb 1G5的表征。图 4A 1-4显示免疫荧光测定中mAb 1G5识别H5N1AIV感染的MDCK细胞和Sf_9感染杆 状病毒中的天然HA。分别用H5病毒或重组H5HA杆状病毒感染MDCK和Sf_9细胞。 对照是H4N1感染的MDCK细胞和Sf-9细胞。图4B显示Western印迹中mAb 1G5对H5HA的识别。所述单克隆抗体识别第 1-14道每条中的H5HA。第15道的非H5病毒不被1G5识别，显示该抗体对H5亚型的 特异性。图5A-5D。mAb 1G5的表位作图。图5A显示用于表位作图的策略。从A到 E和SF1到SF8的全部标明片段在实施例1中作为His融合片段表达。图5B显示片段A 到E的Western印迹分析，使用mAb 1G5作为一抗。C:rHAl蛋白用作对照。图5C和 5D分别显示亚片段SF1到SF8和表位确定最后一步点突变的Western印迹分析。图6A和6B显示mAb 5F8和1G5与H5亚型特异性反应。图6A显示所述抗 体与Indonesian H5N1株的15种不同样品特异性反应；图6B显示所述抗体与Indonesian H5N1 株(1-9)，H5N1/PR8(10) ； H5N2(11)和 H5N3(12)特异性反应，但不与 H4N1 或 H7N1(分别是13和14)反应。利用mAb5F8，1G5或其组合作为捕获抗体和利用多克隆 抗H5HA1作为检测抗体进行测定。图7显示基于mAb 5F8-和mAb 1G5的抗原捕获ELISA检测到102TCID50单位 的H5N1。包含H4N1的测定不产生显著高于背景水平的吸光度。图8显示感染和接种样品(样品1-10 感染和回收的血清样品；样品11-15 接 种的人血清样品；样品16 健康人对照血清)造成的相对于CDC/523H5HA1表位mAb 1G5的50%阻断。图9A和9B显示免疫鸡血清造成的相对于CDC/523 H5HA1表位的mAb 1G5结 合的50%阻断。在图9A中，样品1-14是按1 30稀释的H5NlIndonesian株免疫的鸡 血清样品。在图9B中，样品1-10是按1 30稀释的H5N1 Indonesian株免疫的鸡血清 样品，样品11和12是H5亚型株，样品13-17是非H5亚型株。结果表示为百分阻断值 的算术平均值(n = 5/组+S.E.)。发明详述本发明涉及与AIV H5亚型的HA1蛋白特异性结合的mAb和相关结合蛋白，还 涉及所述mAb和相关结合蛋白在表位阻断ELISA中的用途。通过IFA和Western印迹分 析，所述mAb对所有已知的H5N1AIV Indonesian株和其他H5亚型检验阳性。尤其是，一种这样的mAb或相关抗原结合蛋白具有由杂交瘤5F8产生的mAb 5F8的免疫结合特性，所述杂交瘤5F8于2007年11月6日保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，其分配的保藏号PTA-8757。第二种这样的mAb或相关抗原结合蛋白具有由 杂交瘤1G5产生的mAb 1G5的免疫结合特性，所述杂交瘤1G5于2007年11月6日保藏 于ATCC，其分配的保藏号PTA-8756。本发明还涉及检测和诊断H5亚型AIV感染的方 法和包括本发明mAb或结合蛋白的检测试剂盒。常用的流感血清学测定法是HI，AGID 和微量中和测定法，但如上所述，这些检验具有它们的缺点，需要一种检测针对AIV的 人抗体的灵敏和特异的血清学测定法。用于检测针对流感感染的抗体的间接ELISA已被 建议为快速筛选大量样品的灵敏方法，但这种测定法需要高纯化抗原并且可能在不同亚 型的HA之间显示交叉反应性[18]。本发明进一步涉及用于检测H5亚型的高灵敏和特异 的表位阻断ELISA(EB ELISA)。本文使用各种术语具有下列含义术语mAb或相关结合蛋白的免疫结合特性，按其全部的语法形式，都是指所述 mAb或结合蛋白对其抗原的特异性、亲和性和交叉反应性。术语结合蛋白是指包括本发明mAb或具有本发明mAb的免疫结合特性的mAb 的抗原结合位点的蛋白。通过用重组H5N1HA0蛋白免疫动物来制备具有mAb 5F8或mAblG5的结合特 性的单克隆抗体。这类抗原可以用作免疫原来产生具有所需免疫结合特性的抗体。这类 抗体包括但不限于单克隆抗体，嵌合抗体，单链抗体，Fab片段和包括mAb 5F8或mAb 1G5的抗原结合序列的蛋白。已经发现mAb5F8识别包括氨基酸序列CNTKCQTP的特定表位，所述表位已经 被证明存在于人类中发现的所有H5N1株以及迄今为止鉴定的所有已知来源包括鸡的全部 毒株中的超过99%中。该表位还被证明非常稳定(不经历突变)。该表位是高度抗原性 的，由此基本上在任何受感染个体的血清中都发现针对该表位的抗体，使得该表位在诊 断测试中非常可靠。已经发现mAb 1G5识别包括序列IHPLTIGE的特定表位，所述表位已被证明存 在于迄今为止鉴定的所有来源的1288个H5N1株中。该表位也是非常稳定和高度抗原性 的，由此基本上在任何个体的血清中都发现针对该表位的抗体，使得该表位在诊断测试 中也是非常可靠的。本发明的单克隆抗体可以利用通过培养的连续细胞系产生抗体分子的任何技术 获得。这类方法包括但不限于Kohler和Milstein最早开发的杂交瘤技术(1975，Nature 256 495-497)以及 trioma 技术，人 B 细胞杂交瘤技术(Kozbor et al.，1983，Immunology Today 4 72)和EBV-杂交瘤技术以产生人单克隆抗体(Cole et al.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, Inc., pp.77—96)。可以使用人抗体，人 抗体可以通过使用人杂交瘤(Cote et al.，1983，Proc.Nat = l.Acad.Sci.U.S.A.，80: 2026-2030)或用 EBV 病毒体外转化人 B 细胞(Coleetal.，1985，in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R.Liss, pp.77-96)来获得。此外，可以使用开发用于产生
“嵌合抗体”或“人源化抗体”的技术(Morrison et al.，1984，J.Bacteriol. 159-870 ； Neuberger et al.，1984，Nature 322 604-608 ； Takeda et al., 1985，Nature 314 452-454)，通过引入来自本发明鼠抗体分子的序列以及来自具有合适生物学活性的人抗 体分子的基因进行。嵌合抗体是含人Fc部分和鼠(或其他非人)Fv部分的那些抗体。
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人源化抗体是其中鼠(或其他非人)互补决定区(CDR)掺入人抗体中的那些抗 体。嵌合和人源化抗体都是单克隆的。这类人或人源化嵌合抗体优选用于人疾病或病症 的体内诊断或治疗。本发明的另一实施方案利用构建Fab表达文库的技术(Huseetal.，1989，Science 246 1275-1281)以快速和简便鉴别对本发明抗体具有所需特异性的单克隆Fab片段或其 衍生物或类似物。含有抗体分子独特型的抗体片段可以通过已知技术产生。例如，这类片段包括 但不限于F(ab' )2片段，其可以通过抗体分子的胃蛋白酶消化产生；Fab'片段，其可 以通过还原F(ab' )2片段的二硫键而产生，以及Fab片段，其可以通过用木瓜蛋白酶和 还原剂处理抗体分子而产生。这类抗体片段可以从本发明的任何多克隆抗体或单克隆抗 体产生。在抗体的产生中，筛选需要的抗体可以利用本领域已知的技术实现，例如放射 免疫测定，ELISA(酶联免疫吸附测定)，“夹心”免疫测定，免疫放射测定，凝胶扩 散沉淀素反应，免疫扩散测定，原位免疫测定(例如使用胶体金，酶或放射性同位素标 记)，Western印迹，沉淀反应，凝集测定(例如凝胶凝集测定，血凝测定)，免疫荧光测 定和免疫电泳测定等。在一个实施方案中，通过检测一抗上的标记来检测抗体结合。在 另一个实施方案中，通过检测二抗或其他试剂与一抗的结合来检测一抗。在再一个实施 方案中，所述二抗是标记的。在免疫测定中检测结合的手段是本领域已知的并且在本发 明范围内。已经发现如下文所述的本发明5F8结合蛋白识别具有氨基酸序列CNTKCQTP的 H5N1 HA的表位。已经发现该表位在所有人和基本上所有鸡流感H5亚型以及动物其他 物种和禽类的绝大多数流感H5亚型中高度保守。具体来说，在NCBI数据库提供的1288 个流感AH5N1 HA株中，99.61% (1283)包含CNTKCQTP序列。在这1288株中，280 个是人H5N1株，它们全部包含该序列。此外，在427个鸡H5N1株中，除去一个以外 全部包含CNTKCQTP序列。总计只有5个非人H5株包含CNTKCQTP序列的变异1 个H5株获自具有序列CNTRCQTP的鸭，1株获自具有序列CNTRCQTP的鹅，2株获自 具有序列CNTKCQTL或CNAKCQTP的鸡。总共检测了来自鸡的427株，来自苍鹭的5 株，来自鸭的189株和来自鹅的62株。还发现在如火鸡，野鸭，鸽子，大拟啄木鸟(great barbet),绿孔雀，孔雀，树雀，游隼，黑头鸥，金鸡，雕鸮(eagle owl)，鹧鸪，大天鹅 (whooper swan),鸵鸟，家鸦(house crow)，鹊，麻雀和八哥中该表位高度保守。已经发现如下文所述的本发明1G5结合蛋白识别具有氨基酸序列IHPLTIGE的 H5N1HA的表位。已经发现该表位在所有人流感H5亚型以及迄今为止已知其他物种的所 有流感H5亚型中高度保守。前述抗体可用于本领域已知的关于检测或定位AIV的H5亚 型的方法，例如Western印迹，ELISA，放射免疫测定，免疫荧光测定，免疫组化测定等 等。此外，在优选的实施方案中，所述抗体可用于下文更详细描述的表位阻断ELISA。 这些测定可用于定性和定量确定AIV的H5亚型以及诊断和监测感染该病毒的动物或人。本发明还包括定性和/或定量检测AIV的H5亚型的测定法和检测试剂盒。这 类测定系统和检测试剂盒可以包括标记的成分，例如通过标记本发明的mAb或相关结合 蛋白或其结合配偶体来制备。所述测定法或检测试剂盒进一步可以包括免疫测定技术领
8域技术人员熟知的试剂、稀释剂和使用说明书。在本发明的一些实施方案中这类试剂盒至少包含本发明的mAb或相关结合蛋 白，检测所述mAb或相关结合蛋白与生物样品中AIV的免疫特异性结合的成分，以及根 据选择的方法如表位阻断、竞争性、夹心等方法的使用说明书。所述试剂盒还可以包括 阳性和阴性对照。它们可以被配置成用于自动分析仪或自动免疫组化载片染色设备中。检测试剂盒可以进一步包括二抗或结合蛋白，其可以被标记或用于附着固相支 持物(或附着于固相支持物)。这类抗体或结合蛋白可是例如结合AIV的抗体或结合蛋 白。这类二抗或结合蛋白可以是多克隆或单克隆抗体。优选的试剂盒是用于表位阻断ELISA的试剂盒。这类试剂盒包括mAb或相关结 合蛋白，其结合AIV H5亚型的HA1包膜糖蛋白的表位CNTKCQTP或表位IHPLTIGE，
包括所述表位的氨基酸的HA1糖蛋白或其部分，以及用于检测所述结合蛋白与所述表位 结合的试剂。可以通过用AIV或H5蛋白或其片段免疫动物来制备针对H5亚型血凝蛋白的单 克隆抗体。优选的方法包括扩增H5亚型HA0基因，随后表达该基因，回收及纯化H5 重组蛋白，并且使用该蛋白作为免疫原。例如，H5N1AIV通过可利用的病毒株接种鸡胚 而增殖，随后分离所述病毒RNA。从cDNA扩增HA0基因，将其克隆入细菌，然后表 达。由此产生的蛋白可用于免疫小鼠或其他合适物种以产生杂交瘤。根据其稳定产生能特异性结合H5蛋白并且能区分其与其他AIV亚型的高亲和性 mAb的能力筛选杂交瘤。根据本发明，发现一种免疫球蛋白mAb(确定是同种型IgM并 被命名为5F8)对已知的Indonesian H5亚型株以及其他H5株显示强阳性，并且不显示与 任意其他检测的亚型包括H7N1、H3N2、H4N2和H9N2的交叉反应。在本发明的第二个实施方案中，发现另一个mAb (确定是同种型IgM并被命名为 1G5)也对已知的Indonesian H5亚型株以及其他H5株显示强阳性，并且不显示与任意其 他检测的亚型包括H7N1、H3N2、H4N2和H9N2的交叉反应。mAb 5F8和1G5都识别H5m血凝素的线性表位。当这两种抗体以相同浓度使 用时，mAb 5F8的强度更大。被两种抗体识别的分离的线性表位增加了检测H5抗原的 灵敏性。mAb 5F8识别的表位是通用表位并且正如以上讨论，该表位的8个氨基酸存在 于所有已知的人和现在基因库中可获得的总共1288个已知的H5N1流感A序列的几乎全 部序列中。lG5mAb识别存在于所有人流感H5亚型以及来自目前已知的和基因库中可用 的其他物种的所有H5亚型株中的8氨基酸表位。这两个表位(氨基酸290-297和氨基酸 310-317)之间的距离允许抗原结合和检测的高亲和性。本发明提供了检测H5亚型AIV的便利的、高特异性和灵敏性的手段。一种这 样的手段是表位阻断ELISA(EBELISA)。在EBELISA中，来自阳性血清的特异抗体抑 制挑选的mAb识别其特定表位，由此当向样品添加结合所选mAb的显色试剂时颜色显 影被抑制。但是，阴性血清允许强的颜色反应。该测定法取决于生物样品中存在的H5 流感抗体阻断所选H5 HAlmAb与微量滴定板上吸附的H5N1流感抗原或重组抗原结合的 能力。更具体地，在本发明的EBELISA中，用于包被缓冲液中的最适浓度的重组HA1 或灭活H5N1株包被ELISA平板。通过使用包被抗原的双向系列稀释和已知阳性抗体的 方格板滴定并挑选在ELISA读数中产生最大光密度(O.D.)值的最佳浓度可以确定最适浓度。向包被的平板的每孔中添加检测血清样品并温育，洗涤，然后与mAb5F8或1G5上 清温育。再次洗涤平板，通过添加稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体(如HRP标 记的兔抗小鼠抗体)检测结合的mAb，所述抗体结合mAb5F8或1G5。洗涤平板，然后 与3，3'，5，5'-四甲基联苯胺或其他显色剂如2，2-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑 啉-6-磺酸或邻间苯二胺二盐酸温育。终止反应并读取显色。对每种血清样品计算样品 中(阻断5F8或lG5mAb与抗原的结合)的抗体造成的比色反应的百分比抑制。表位阻断ELISA提供了检测H5亚型AIV的便利、高特异性和灵敏性的手段。 这种优选的检测方法能够检测AIV各种H5亚型株的HA抗原而与其他AIV亚型没有交叉 反应。EBELISA可以检测到比在其他测试中一致检测到的更低水平的抗体。mAb 5F8和mAb 1G5的强反应性还意味着该抗体可用于抗原捕获ELISA(AC ELISA)，其中可以检测来自临床样品中活病毒或灭活或裂解病毒的抗原。AC-ELISA是 检测H5抗原的快速、可靠和经济的方法，可用于检测H5m的家禽和人分离物的H5HA 抗原。因此本发明的H5亚型mAb是非常有利的诊断工具。如上所述，它们对传染性 H5N1亚型AIV是高度特异性的。这种特异性已经在获自各种来源的H5N1感染的组织 样品组合中得到验证。这类高度特异的单克隆抗体体现了用于H5N1诊断的明确优势。 该mAb可在用于检测H5AIV的安全和便利的诊断测试中使用。提供下列实施例以例证本发明，其不应被理解为进行限制。实施例1I.实验病毒用于本研究和下表1所列的24种分离的Indonesian H5N1流感株(条目1-24)获 自 National Institute of Health, Research and Development, Indonesia。其他 H5 禾口非 H5 亚
型由新加坡农业食品和兽医局(AVA)(表1的条目25-31)提供。表1.本实验使用的禽流感病毒
权利要求
1.一种与禽流感病毒H5亚型的表位特异性结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗 体5F8的免疫结合特性。
2.权利要求1的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源 化抗体。
3.权利要求1的结合蛋白，其是单克隆抗体。
4.由杂交瘤5F8产生的单克隆抗体5F8，所述杂交瘤5F8保藏在美国典型培养物保藏 中心，保藏号PTA-8757。
5.一种结合蛋白，其结合H5血凝素的表位CNTKCQTP。
6.权利要求5的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源 化抗体。
7.权利要求6的结合蛋白，其是单克隆抗体。
8.一种与禽流感病毒H5亚型的表位特异性结合的结合蛋白，其基本上具有单克隆抗 体1G5的免疫结合特性。
9.权利要求8的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人源 化抗体。
10.权利要求8的结合蛋白，其是单克隆抗体。
11.由杂交瘤1G5产生的单克隆抗体1G5，所述杂交瘤1G5保藏在美国典型培养物保 藏中心，保藏号PTA-8756。
12.—种结合蛋白，其结合H5血凝素的表位IHPLTIGE。
13.权利要求12的结合蛋白，其是单克隆抗体、单链抗体、抗体片段、嵌合抗体或人 源化抗体。
14.权利要求13的结合蛋白，其是单克隆抗体。
15.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括将样品与包含禽流感病毒 H5亚型包膜糖蛋白的表位的抗原接触并确定所述样品中的抗体是否与所述表位结合，所 述表位包含序列CNTKCQTP。
16.权利要求15的方法，其进一步包括将所述样品和抗原与基本上具有单克隆抗体 5F8的免疫结合特性的结合蛋白接触并确定有多少所述结合蛋白与所述抗原结合。
17.权利要求16的方法，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
18.权利要求17的方法，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤5F8产生的抗体5F8，所述 杂交瘤5F8保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8757。
19.权利要求15的方法，其中所述确定通过表位阻断测定法进行。
20.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的方法，包括将样品与包含禽流感病毒 H5亚型包膜糖蛋白的表位的抗原接触并确定所述样品中的抗体是否与所述表位结合，所 述表位包含序列IHPLTIGE。
21.权利要求20的方法，其进一步包括将所述样品和抗原与基本上具有单克隆抗体 1G5的免疫结合特性的结合蛋白接触并确定有多少所述结合蛋白与所述抗原结合。
22.权利要求21的方法，其中所述结合蛋白是单克隆抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述单克隆抗体是由杂交瘤1G5产生的抗体1G5，所述 杂交瘤1G5保藏在美国典型培养物保藏中心，保藏号PTA-8756。
24.权利要求20的方法，其中所述确定通过表位阻断测定法进行。
25.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包括结合禽流感病毒H5亚 型包膜糖蛋白的表位CNTKCQTP的结合蛋白、包含所述表位的氨基酸的糖蛋白或其部分 以及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。
26.权利要求25的试剂盒，其中所述结合蛋白具有单克隆抗体5F8的免疫学结合特性。
27.权利要求25的试剂盒，其中所述试剂可以检测所述结合蛋白与所述糖蛋白的结合 是否被所述生物样品中抗体的存在所阻断，所述抗体识别所述糖蛋白的所述表位。
28.一种检测生物样品中H5亚型禽流感病毒的试剂盒，其包括结合禽流感病毒H5亚 型包膜糖蛋白的表位IHPLTIGE的结合蛋白、包含所述表位的氨基酸的糖蛋白或其部分以 及用于检测所述结合蛋白与所述表位结合的试剂。
29.权利要求28的试剂盒，其中所述结合蛋白具有单克隆抗体1G5的免疫学结合特性。
30.权利要求28的试剂盒，其中所述试剂可以检测所述结合蛋白与所述糖蛋白的结合 是否被所述生物样品中抗体的存在所阻断，所述抗体识别所述糖蛋白的所述表位。
31.—种试剂盒，其包括结合表位IHPLTIGE的结合蛋白和结合表位CNTKCQTP的结合蛋白。
32.一种试剂盒，其包括单克隆抗体5F8和单克隆抗体1G5。
全文摘要
对流感H5亚型HA蛋白特异的单克隆抗体和相关结合蛋白可用于血清学诊断哺乳动物和禽类血清样品包括人血清样品中流感H5感染。每种抗体均与多种H5亚型株强烈反应，但不显示与非H5流感亚型的交叉反应性。
文档编号G01N33/569GK102015765SQ200880128396
公开日2011年4月13日 申请日期2008年2月5日 优先权日2008年2月5日
发明者H-S·J·康, N·P·帕杜比德里, P·木根, S·韦卢马尼 申请人:淡马锡生命科学研究院有限公司