猪流感病毒h1n1亚型ha1蛋白重组猪痘病毒及其制备方法

专利名称：猪流感病毒h1n1亚型ha1蛋白重组猪痘病毒及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒及其制备方法。
背景技术：
痘病毒基因组结构庞大，大的基因组为很多外来基因的插入提供了空间，作为载体能够接纳大量的外源基因，并使其有效表达(Barbara Ε. Straw, Jeffery J. Zimmerman, Sylvie DjAllairejDavid J. Taylor. . DISEASES OF SWINE. 9 EDITION. [M])。痘病毒还有良好的免疫原性，能激发宿主产生有效的免疫反应。猪痘病毒不感染其他动物，只感染猪， 在猪体只产生温和性反应，使用比较安全。因此，猪痘病毒是给猪传递免疫原的一种较为理想的载体。重组猪痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，猪痘病毒是猪专有的基因工程活载体疫苗颇具魅力的候选载体。猪流感(Swine influenza, Si)是由A型流感病毒引起的一种猪的急性呼吸道传染病。虽然单纯的猪流感病毒感染表现为发病率高(100%)，死亡率低(约5%)，但猪流感病毒在体内可以感染肺泡巨噬细胞(Jung Τ, Chol C, Chae C. Localization of Swine Influenza Virus in Naturally Infected Pigs [J] Vet Pathol, 2002, 39 :10-16.)。肺泡巨噬细胞受损严重影响肺部免疫防御机制，容易引起其它病原菌和病毒的继发感染。另外，由于猪呼吸道上皮细胞既有禽流感病毒又有哺乳动物及人流感病毒的受体，猪成为流感病毒基因发生重组的关键场所，在流感病毒的生态学和流行病学中占据重要的地位。目前欧美市场猪流感疫苗是全病毒灭活疫苗，对预防猪流感发挥了重要的作用。但灭活疫苗诱导细胞免疫的能力弱，对异源和异型病毒不能提供有效保护，很难有效控制抗原多变的猪流感病毒在猪群中的感染与传播。猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl)毒株(GenBank 收录号为 EU502884) 是我国猪群中流行的优势毒株(祁贤，我国部分地区猪流感病毒分子流行病学及致病性研究，南京农业大学博士论文，2006. 6，88-108)，HAl蛋白是猪流感病毒的主要表面抗原，可诱导机体产生保护性中和抗体，可用来抵御猪流感病毒的感染。目前还没有构建成猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的报道。

发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种猪流感病毒Hmi亚型HAl基因的转移载体PUSZ11/H1。本发明的另一目的是提供猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。本发明的又一目的是提供该重组猪痘病毒的制备方法。本发明的目的可通过如下技术方案实现一种猪流感病毒Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/Hl，该重组载体是将序列为SEQID NO. 1所示的猪流感病毒Hmi毒株HAl基因序列插入猪痘病毒载体pUSZll的 BamHI酶切位点所得。
一种猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，是由猪痘病毒和所述的转移载体pUSZll/Hl感染、转染PK15细胞，进行同源重组获得的阳性克隆。

其中，所述的猪痘病毒优选ATCC保藏号为ATGG number VR-363 的野生型猪痘病毒WtSPV0所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/Hl于2011年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC N0:V201101。该重组猪痘病毒rSPV/Hl 在分类上属于痘病毒科(Poxviridae)，猪痘病毒属(Suipoxvirus)，猪痘病毒(Swin印ox virus)ο猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，包括如下步骤(1)根据GenBank收录号为ETO02884的猪流感病毒A/swine/ Shanghai/1/2005 (HlNl)毒株HAl的基因序列，自行设计并合成序列为SEQ ID NO. 1所示的 HAl基因；(2)将所述的序列为SEQ ID NO. 1所示的HAl基因插入猪痘病毒载体pUSZll中， 然后通过PCR、酶切和测序鉴定，获得所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl基因的转移载体 pUSZll/Hl ；(3)将猪痘病毒和所述的HAl基因的转移载体pUSZll/Hl感染、转染PK15细胞，进行同源重组获得所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。步骤(2)所述的HAl基因插入猪痘病毒载体pUSZll的具体方法为利用BamHI分别对步骤(1)所述的序列为SEQ ID NO. 1所示的HAl基因和猪痘病毒载体pUSZll进行单酶切，回收大小为1031bp的HAl基因目标片段和大小为8391bp的猪痘病毒载体pUSZll线性大片段，连接两片段，得到重组质粒，经测序和测定正反向，将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为pUSZll/Hl。所述的制备方法还包括所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的蚀斑纯化步骤。所述的制备方法还包括利用IFA和Western-blot技术对所述的猪流感病毒Hmi 亚型HAl蛋白重组猪痘病毒进行表达鉴定的步骤。所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒在制备预防和/或治疗猪流感病毒Hmi亚型感染的药物中的应用。有益效果本发明首次将HAl基因插入到猪痘病毒载体pUSZll中获得重组载体pUSZll/Hl， 该质粒筛选标志LacZ基因前带有痘苗病毒启动子P11，进行同源重组后蓝斑非常明显，利于筛选和纯化。本发明首次提出了用猪痘病毒载体构建猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。试验证明，本发明构建的猪流感病毒(HlNl)重组猪痘病毒能够稳定表达外源蛋白， 而且其效价稳定，种毒的毒价稳定在107TCID5Q/mL。通过动物试验证明rSPV/Hl能诱导小鼠产生显著的体液免疫和细胞免疫反应，不仅保护豚鼠和猪抵御同源SIV HlNl的攻击，还能部分抵御异型SIVH3N2的攻击。重组猪痘病毒不感染其他动物，只感染猪，在猪体只产生温和性反应，使用比较安全。重组猪痘病毒疫苗具有弱毒疫苗的抗原增殖能力，使用方便，成本低廉。所以，猪流感重组猪痘病毒rSPV/Hl在猪流感(Hmi亚型)的防制方面具有广阔的应用前景。生物材料保藏信息猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/Hl于2011年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO :V201101。


图IpSPl质粒图谱。图2猪痘病毒转移载体pUSZll/Hl的构建示意图。图3合成的HAl基因BamHI单酶切，M =Marker, 1 =HAl 基因 BamHI 单酶切产物。图4猪痘病毒载体pUSZIlBamHI单酶切，M =Marker, 1 猪痘病毒载体pUSZ IlBamHI单酶切产物。图5重组质粒的PCR鉴定，M =Marker，1 重组质粒的PCR产物。图6重组质粒的酶切鉴定；M =Marker, 1 重组质粒BamH I酶切产物。图7重组猪痘病毒rSPV/Hl的蓝斑筛选、纯化照片。图8IFA鉴定；A 感染重组猪痘病毒的H(15细胞，有明显的荧光；B 感染野生猪痘病毒的H(15细胞，没有荧光；C 未接种病毒的H(15细胞，没有荧光。图9Western_blot鉴定；M =Marker, 1 感染重组猪痘病毒的H(15细胞，2 感染野生猪痘病毒的HQ5细胞，3 未接种病毒的H(15细胞。图10免疫后小鼠血清SIV(Hmi)中和抗体变化。图11免疫后小鼠SIV(HlNl)特异的淋巴细胞增殖检测。图12SIV (HlNl)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测。图13SIV (HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测。图14豚鼠肺脏组织病理变化。A :rSPV/Hl 免疫，HlNl 攻毒；B :rSPV/Hl 免疫，H3N2 攻毒；C :wtSPV 免疫，HlNl 攻毒；D =WtSPV免疫，H3N2攻毒；E :PK15免疫，HlNl攻毒；F :ΡΚ15免疫，Η3Ν2攻毒。图15猪攻毒(HlNl)后鼻腔排毒情况测量结果。图16猪攻毒(Η3Ν2)后鼻腔排毒情况测量结果。图17SIV (HlNl)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测。图18猪肺脏组织病理变化，A :rSPV/Hl 免疫，HlNl 攻毒；B :rSPV/Hl 免疫，H3N2 攻毒；C :wtSPV 免疫，HlNl 攻毒；D =WtSPV免疫，H3N2攻毒；E :PK15免疫，HlNl攻毒；F :ΡΚ15免疫，Η3Ν2攻毒。
具体实施例方式实施例1猪痘病毒转移载体pUSZll/Hl的构建1. 1猪痘病毒载体pUSZll的构建pUSZll质粒(黄冬艳构建)图谱如图2所示，全长为8391bp ；pUSZll质粒中的LF 为左边的猪痘病毒同源重组臂，和猪痘病毒Kasza株的12121-13268bp处同源。以野生型猪痘病毒wtSPV (购自ATCC，保藏号为ATGG number VR-363 ，下同)基因组DNA为模板，以一对引物SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3进行PCR，然后用EcoR I和Kpn I酶切扩增产物， 把LF(SEQ ID N0.4，1148bp)克隆到pUC19中；pUSZll质粒中的RF为右边的猪痘病毒同源重组臂，和猪痘病毒Kasza株的13457-14831bp处同源。同样以wtSPV基因组DNA为模板， 用引物SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6进行PCR，然后用Sal I和Hind III酶切扩增产物把 RF(SEQ ID NO. 7,1375bp)克隆进上述的pUC19中，形成pUSOl质粒。以pSPl (图1)质粒 (Junghyun Hahn, Se-Hoon Park, Jae-Young Song, et al. Construction of recombinant swinepox viruses and expression of the classical swine fever virus E2 protein Journal of Virological Methods93 (2001) 49-56)为模板，用引物对 PllZS :SEQ ID NO. 8 和P11ZX:SEQ ID NO. 9 (其中带有痘苗病毒的启动子Pll)，把LacZ基因克隆到载体pUSOl 的BamH I和Sal I位点间，其余序列为pUC19框架序列。由此形成猪痘病毒载体pUSZll (图 2)。 1. 2HA1基因的合成、克隆和猪痘病毒转移载体pUSZll/Hl的构建根据猪流感病毒A/swine/Shanghai/l/2005(Hmi)毒株HAl的基因序列(GenBank 收录号为EU502884)，自行设计序列为SEQ ID NO. 1的HAl基因(前加BamHI酶切位点、痘苗病毒Pll启动子序列、启始密码子和将534位由A替换成T的HAl基因，后加终止子TAATAA 和BamHI酶切位点)，该HAl基因片段长度为1037bp，委托上海Invitrogen公司合成，并插入pUC19 BamHI酶切位点。将含合成的HAl基因的pUC19载体和猪痘病毒载体pUSZll分别用BamHI单酶切。酶切体系如下7 μ L BamHLlOyL IOXK Buffer，50 μ L质粒，33 μ L无菌双蒸水，共 100 μ L0 30°C作用 4h。酶切完毕后，用的琼脂糖凝胶电泳，HAl片段大小为1031bp (图3)、pUSZll片段大小为8391bp(图4)，然后用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒对酶切后的产物进行回收。方法按试剂盒说明。再用连接酶连接，将其插入猪痘病毒载体pUSZll (图2)中。连接体系如下 10. O μ LHAl酶切回收产物，l.OyL载体pUSZll酶切回收产物，l.OyL 10XT4DNALigase, 2. O μ L IOXDNALigase Buffer，用无菌双蒸水补足总体积20. Ομ L0混勻后16°C连接16h。 同时设定载体自身连接对照。1. 2. 1大肠杆菌DH5 α感受态细胞的转化和重组质粒的小量提取取连接产物按常规方法转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞(购自TIANGEN BIOTECH, 下同)，然后涂布于100 μ g/mL氨苄青霉素抗性平板上，37°C培养约24h。挑取外源基因与载体连接产物转化所涂布抗性平板上的单个菌落，接种于3. OmL的含50 μ g/mL氨苄青霉素的 LB 培养基中，180rpm 过夜振荡培养。根据 Geneaid Biotech 的 High-Speed Plasmid Mini Kit小量提取重组质粒，保存于_20°C。1. 2. 2重组质粒的鉴定PCR鉴定以1. 2. 1提取的重组质粒为模板，用上游引物PlSEQ ID NO. 10(含痘苗病毒Pll启动子)和下游引物P2 SEQ ID NO. 11进行PCR。体系如下模板0. 5 μ L，Pll μ L， Ρ21 μ L, Mix 12. 5μ L，无菌双蒸水 10μ L，共 25μ L。PCR 参数为94 °C 4min，94 °C 45s， 51°C 45s, 72°C Imin ；30个循环；72°C 7min。产物用的琼脂糖凝胶电泳分析(图5)。酶切鉴定采用单酶切的方法进行鉴定。酶切反应体系为20 μ L =IyLBamHIJyLIOXK Buffer，10 μ L质粒，7 μ L无菌双蒸水。30°C水浴4h。产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分析(图6)。的琼脂糖凝胶电泳证明PCR片段与酶切大小与预期结果一致。测序 鉴定将PCR和酶切鉴定均为阳性的重组质粒送Invitrogen公司双向测序， 并用NCBIBLAST将所测得的序列及其推导的氨基酸序列与GenBank数据库中的猪流感病毒(HlNl)HAl基因的核苷酸和蛋白质进行同源性比较，再用Vector NTI和DNAstar软件进行基因的限制性内切酶和阅读框分析，证明我们所克隆入的基因与目的基因的同源性为 100%，而且克隆入的基因完全符合载体阅读框要求。将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为pUSZll/ΗΙ (图2)。实施例2猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的构建与鉴定2. 1感染与转染在6孔板中用无抗生素MEM(购自TIANGEN BIOTECH，下同)营养液培养PK15细胞 (购自ATCC，ATCC Number :CCL_33 ，下同)至形成单层，弃营养液；以0. 02M0I的野生型猪痘病毒wtSPV感染，37°C作用2h，其间摇动3次，弃感染液，用洗液洗1次，每孔加入2mL 无抗生素维持液。取10 μ L脂质体(Invitrogen公司产品)加入至250 μ L无血清MEM中， 轻轻混勻，置室温5min ；将4 μ g鉴定好的质粒加入至250 μ L无血清ΜΕΜ，轻轻混勻。将两管混勻，置室温下作用20min，将复合物加到6孔板中，来回摇晃混勻。37°C作用6h后弃转染液，加入2. 5mL/孔无抗生素维持液，37°C培养至出现明显的细胞病变，收毒用于筛选。2. 2猪流感重组猪痘病毒rSPV/Hl的筛选、纯化与表达鉴定重组病毒的蓝斑筛选上述培养物反复冻融3次，IO1UO2UO^ ΙΟ4、105、IO6倍稀释后接种单层PK15。16h后用含200 μ g/mL X-gal (购自TIANGEN BIOTECH)、1 %低熔点琼脂糖 (购自TIANGEN BIOTECH)的营养琼脂取代无血清培养基，继续培养3 5d，出现的蓝色蚀斑即为猪流感重组猪痘病毒，命名为rSPV/Hl。重组病毒的蚀斑克隆单个蓝色蚀斑以102、103、104、105、106倍稀释后接种单层卩1(15，1611后以含20(^8/1^ X_gal、l%低熔点琼脂糖的营养琼脂取代无血清培养基，继续培养3 5d，挑取单个蚀斑(图7)。重复5次。猪流感重组猪痘病毒rSPV/Hl表达鉴定IFA鉴定待接种rSPV/Hl和wtSPV的PK15细胞出现明显CPE(4_5d)后，倾去维持液，PBS洗涤2次后，用4°C冷无水乙醇固定30-45min，弃固定液，将96孔细胞板自然晾干。在接毒细胞孔加入50yL 1 50稀释的猪流感Hmi阳性血清(用北京爱德士元亨生物科技有限公司猪流感试剂盒检测的临床血清，下同)，并在未接毒细胞孔中加入等量猪流感Hmi阴性血清(用北京爱德士元亨生物科技有限公司猪流感试剂盒检测的临床血清，下同)作为对照，置37°C湿盒中作用45min，PBS洗涤3次，每次5min ；加入50 μ L SPA-FITC 标记物((购自博士德生物工程有限公司，用0. OlM pH 7.4PBS稀释100倍)，37°C湿盒作用45min，PBS洗涤3次，置倒置荧光显微镜下观察结果。rSPV/Hl感染且加猪流感Hmi阳性血清的细胞孔(A)观察到阳性细胞有典型的特异性亮绿色荧光，而wtSPV感染孔(B)和对照的细胞孔(C)内无特异性绿色荧光(图8)，可见只有重组病毒rSPV/Hl能表达HAl蛋白。Western-blot鉴定取感染96h后收集、保存的含有重组猪痘病毒的上清接种 PK-15细胞，培养72h后收集感染重组猪痘病毒的细胞，加入1. 5mL的离心管中，2000rpm,离心5min，弃上清，用PBS洗涤2次，弃上清，加入细胞裂解液100 μ L，冰浴30min，加入2 X 上样缓冲液100 μ L，煮沸3min，离心5min，取上清电泳分析。用同样的方法处理用wtSPV感染的HQ5细胞和未接毒H(15细胞作为阴性对照。细胞煮沸裂解后用12%聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，按文献(杜以军，猪α干扰素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对口蹄疫病毒VPl抗原的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2008. 6，38)方法转印。 将转印后的PVDF膜转移至封闭液(含5%脱脂乳的PBST)中，室温轻摇3 证后4°C封闭过夜；倾去封闭液，用洗涤液PBST洗膜3次，每次lOmin，然后加入一抗溶液(以封闭液 1 1000稀释的兔Hl亚型猪流感多抗血清，用猪流感病毒Hmi按常规方法免疫兔子所得)，室温下振荡1.5 2h ；再用PBST洗膜3次，每次lOmin，然后加入以封闭液1 30000 稀释的羊抗兔IgG-HRP标记物(购自博士德生物工程有限公司)，室温振荡1. 5 池；再用 PBST洗膜3次，每次lOmin。最后用HRP-DAB底物显色试剂盒(购自TIANGEN BIOTECH)进行显色。具体步骤为转印结束前在显色盒中依次加入IxHRP反应缓冲液lmL、试剂A 50 μ L、 试剂B50yL，混勻，避光保存，30min内使用。转印结束后将PVDF膜取下，放入显色盒内预先混勻的显色液中，待观察到明显的目的条带后停止显色。将PVDF膜晾干，观察。结果显示感染重组猪痘病毒的细胞有预期的目的条带，而wtSPV感染的H(15细胞和未接毒H(15 细胞无目的条带出现(图9)，可见只有重组病毒rSPV/Hl能表达HAl目的蛋白。将经鉴定的重组病毒rSPV/Hl保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，保藏地址为武汉市武汉大学，保藏号为CCTCC NO :V201101，保藏日为2011年1月6日。2. 3猪流感重组猪痘病毒rSPV/Hl的滴度测定将H(15细胞种植于96孔板，待长成单层，将重组猪痘病毒rSPV/Hl(CCTCC NO: V201101)冻融3次，用维持液将病毒作10倍比稀释；弃去长满单层H(15细胞的96孔板中的营养液，接种稀释好的病毒液，每个稀释度4个孔，100 μ L/孔；37°C、5% CO2饱和湿度下培养5d，观察CPE，积累每个稀释度的CPE孔数，按Reed-Muench法计算病毒的TCID5(1。重组猪痘病毒 rSPV/Hl (CCTCC NO :V201101)的 TCID5tl 为 107 °/mL。2. 4猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/Hl稳定性试验把重组猪痘病毒rSPV/Hl (CCTCC NO :V201101)在H(15细胞上连续传代30代，每 5代分别检测rSPV/Hl中HAl蛋白的转录与表达，同时测定其组织细胞半数感染量。结果表明，HAl蛋白在重组猪痘病毒rSPV/Hl (CCTCC NO :V201101)连续传代过程中表达稳定，其组织细胞半数感染量也未发生变化。接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在IO7TCID5tl/mL。实施例3小鼠的免疫学试验取6-8周龄雌性BALB/c小鼠45只，随机分为3组，每组15只。第1组每只肌肉免疫 rSPV/Hl (CCTCC NO :V201101)，剂量为 0. 2 X IO7'OTCID50 ；第 2 组每只肌肉注射 wtSPV 0. 2 X IO7 0TCID50, H 3组每只肌肉注射H(15细胞裂解上清0. 2mL。21d、35d后分别以相同的剂量加强免疫2次。分别于首次免疫后21、35、42d采血测定中和抗体；在首次免疫后21、 35、42d取脾脏，分离淋巴细胞，测定淋巴细胞增殖反应(5只/组/次)；首次免疫后35d 取脾脏，分离淋巴细胞，用SIVH1N1 (A/swine/Shanghai/1/2005 (HlNl))(祁贤博士分离。 GenBank收录号为ETO02884)刺激，测定培养上清中IFN-γ和IL-4的量。
3. 1中和抗体变化病毒中和试验-固定病毒稀释血清法。首先参照动物病毒学(第二版)，测定猪流感病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))(祁贤博士分离，GenBank 收录号为 EU502884)的TCID5tl。将每只小鼠的血清样品分别检测Hmi中和抗体(下同)。在病毒中和试验前3 将MDCK细胞(购自上海坤肯生物化工有限公司，下同)种植于96孔细胞板。待检血清56°C灭活30min，12000rpm离心5min除菌后，小心吸出上清，用维持液(含 2% FCS 的 DMEM(购自 TIANGENBIOTECH))分别将血清(按 1 4、1 8、1 16、 1 32，……，作 2 的连续倍比稀释；将病毒 Hmi (A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi)) 用维持液分别稀释至含200TCID5(l/100yL，然后将稀释的血清与等体积的病毒液(含 200TCID50/100 μ L)混合，于37°C水浴作用lh。弃去已长满单层MDCK细胞的96孔培养板中的营养液，将血清病毒混合液加入到细胞孔中，100 μ L/孔，每个血清稀释度作4的复孔， 37°C培养2 3d。同时设定以下对照(i)猪流感Hmi阴性血清对照；(ii)病毒一猪流感 HlNl阴性血清对照；(iii)病毒一猪流感Hmi阳性血清(中和抗体效价为1 3 作为阳性对照；(iv)空白对照。结果判定，当病毒一猪流感Hmi阴性血清对照孔出现CPE，而病毒一猪流感Hmi阳性血清、阴性血清及空白对照孔均未出现CPE时记录每个血清稀释度的 CPE孔数。以能够完全抑制CPE的血清最大稀释度作为待检血清的中和效价。血清中和试验结果(图10)显示两个对照组(即WtSPV免疫组及H(15细胞裂解上清组)小鼠血清没有猪流感Hmi中和活性；rSPV/Hl免疫组小鼠血清具有SIV (HlNl)中和活性，且二免后呈上升趋势。3. 2SIV(HlNl)特异的淋巴细胞增殖检测3. 2. 1小鼠脾淋巴细胞的制备参照文献(杜以军，猪α干扰素和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子对口蹄疫病毒 VPl抗原的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2008. 6，66-67)进行。淋巴细胞制备好后进行细胞计数，用RPMI-1640 (购自TIANGEN BIOTECH)完全培养基调节细胞密度至 5 X IO6个/mL ；铺板，将细胞悬液加到96孔细胞板中，100 μ 1/孔。3. 2. 2淋巴细胞增殖试验在种植好淋巴细胞的孔中，加入20 μ g/ml的猪流感病毒(A/swine/ Shanghai/1/2005 (HlNl))作为刺激原100 μ 1，对照孔加入IOOul RPMI-1640完全培养基， 各作3个重复孔。37°C 5% CO2温箱中培养66h，吸出上清，加入160ul新鲜的培养基，同时每孔再加入40ulMTT(5mg/ml)(购自TIANGEN BIOTECH)，37 °C下继续培养4h。吸弃培养液， 每孔加入100 μ 1 DMSO (购自TIANGEN BIOTECH)，振荡融解结晶，测定0D570nm的值。计算刺激指数刺激指数SI =刺激孔的OD值/未刺激孔的OD值检测结果(图11)显示重组猪痘病毒免疫组小鼠脾淋巴细胞经SIV(Hmi)刺激后出现特异的细胞活化增殖。组间比较免疫后21d、35d和42d，重组猪痘病毒免疫组与两个对照组淋巴细胞增殖差异显著(P < 0. 05)。3. 3SIV(HlNl)刺激小鼠脾淋巴细胞分泌细胞因子检测用Hmi 病毒(A/swine/Shanghai/1/2005 (Hmi))作为刺激抗原(终浓 10μ g/mL) 刺激分离的淋巴细胞，37°C下培养66h。用ELISA试剂盒(购自Groundwork BiotechnologyDiagnosticate)来测定培养上清中细胞因子IFN-γ和IL_4的量，按说明书来操作。一免后35d，小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN- γ和IL_4含量检测结果(图12)显示各组小鼠脾淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/Hl免疫组小鼠脾淋巴细胞培养上清中IFN- γ和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)。实施例4豚鼠的免疫学试验及攻毒保护试验

取200-300克雌性Hartly豚鼠36只，随机分为6组，每组6只。第1、2组每只免疫 rSPV/Hl，剂量为 0. 4X IO7 0TCID50 ；第 3、4 组每只免疫 wtSPV，剂量为 0. 4X IO7 0TCID50 ；第 5、6组每只注射PK15细胞裂解上清0.4mL。免疫方式为两后腿胫骨上方肌肉注射。21d分别以相同的剂量加强免疫1次。首次免疫后28d采血，分离淋巴细胞，用猪流感病毒Hmi 刺激，测定培养上清中IFN-Y和IL-4的量。35d采血测定中和抗体滴度。第35d攻毒，第 1、3、5组用ImL无针头注射器每只鼻腔注射0.2X105_°TCID5(1的HNl ；2、4、6组每只鼻腔注射 0. 2 X IO5 0TCID50的H3N2。攻毒后观察7d。临床表现记录每天喂食时，记录观察项目的出现情况，最后根据7天记录结果，进行平均，具体方法参考文献(王兴龙，猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2010.6，61)进行。观察项目有精神沉郁、食欲下降、眼睑水肿、咳嗽、呼吸困难和流鼻涕6项指标，根据严重程度每项0-3分；肺大体病变的评分参照文献(Wesley R D， Tang Μ,Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2Swine Influenza Virus [J] Vaccine, 2004, 22 (25/26) :3427_3434.)进行。42d 将全部豚鼠安乐死，取肺组织处理、接种鸡胚(盲传2代)，HA, HI试验检测流感病毒，同时取肺样本用甲醛固定做病理切片，观察病理变化。4. lSIV(HlNl)刺激豚鼠外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测无菌取豚鼠的外周血，用肝素抗凝，用生理盐水稀释1倍，轻轻加于4mL的淋巴细胞分离液面上，2000r/min，离心20min ；取界面淋巴细胞层，用PBS洗3次，悬于RPMI 1640 培养液，计算并调整细胞浓度至2 X 106/ml。将细胞悬液加到96孔板中，每孔100 μ 1。在种植好淋巴细胞的孔中，加入20μ g/ml的猪流感病毒Hmi抗原作为刺激原 100 μ 1，对照孔加入IOOul RPMI-1640完全培养基，各作3个重复孔。37°C 5% CO2温箱中培养66h，吸出上清。细胞因子的检测方法同前。一免后28d，豚鼠外周血淋巴细胞培养上清中IFN- γ和IL_4含量检测结果(图 13)显示各组豚鼠外周血淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/Hl 免疫组豚鼠外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)。4. 2豚鼠肺脏组织病理变化观察进行肺脏组织病理变化观察，病理组织切片的制备过程参照文献(王兴龙，猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2010. 6，62-63)进行。攻毒后7d，第1组(A)豚鼠肺组织无变化，第2组(B)有轻微病理变化，而对照组均发生了明显的病理变化，表现为严重的间质增生，有的充血、淋巴细胞浸润和肺泡壁破坏 (图 14)。
4. 3豚鼠免疫保护试验(表1)血清中和试验结果显示，免疫后35d，rSPV/Hl免疫组豚鼠血清中均能够检测到 SIV(HlNl)特异的中和抗体，但不同豚鼠之间抗体滴度低的为1 8，高的可达到1 64。 wtSPV, PK15免疫组血清对SIV(Hmi)没有中和活性。而经检测，所有试验豚鼠血清对 SIV(H3N2)无中和作用。一免疫后35d攻毒。攻毒7d后，不论是用SIV(HlNl)攻击还是用SIV(H3N2)攻击的免疫rSPV/Hl的豚鼠均无流感症状出现。而对照组则表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽，尤其是流鼻涕很明显，而其他症状轻微。rSPV/Hl免疫组中只有用SIV(H3N2)攻击的2/6只中有轻微肉眼可见病理变化，而所有对照组豚鼠肺部都有大范围的紫色、肉变区出现。免疫rSPV/Hl的豚鼠只从用SIV (H3N2)攻击的1/6分离到SIV (H3N2)，而对照组全都分离到SIV。实施例5猪体攻毒保护试验本部分试验在江苏省农业科学院完成。所有的猪均在无SIV的环境设施中饲养。30头6周龄的大长二元猪(SIV、PRRSV、 PCV,SPV阴性)，随机分为6组，每组5头，每一组在单独的圈舍饲养。第1组和第2组免疫 rSPV/Hl，剂量均为 lX107TCID5Q/lmL/头；第 3、4 组注射 wtSPV，剂量均为 1 X 107TCID5(1/lmL/ 头；第5、6组每头注射PK15细胞裂解上清lmL。免疫方式为肌肉注射。在免疫后21d，前腔静脉采血检测针对SIV的特异性中和抗体；同时分离外周血淋巴细胞，用SIV(HlNl)刺激，测定培养上清中细胞因子IFN-Y和IL-4的量。在免疫后21d，所有猪攻毒，攻毒方式为鼻腔注入(拔取注射器针头)。第1、3、5组每只鼻腔注入IXIO5 ciTCID5ci的SIV(HlNl)； 2、4、6组每只鼻腔注入IX 105_OTCID5tl的SIV(H3N2)。攻毒后连续5d，观察临床表现，测体温，采鼻拭子检查鼻腔排毒情况，攻毒后第5d，猪进行安乐死处理，观察肺脏病理变化。鼻拭子中流感病毒含量检测和肺大体病变的评分参照文献进行(Wesley R D，Tang Μ, Lager K Μ.Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5Recombinant VirusesExpressing the HemagGlutin in and the Nucleoprotein of H3N2 Swine Influenza Virus [J]. Vaccine, 2004, 22 (25/26) :3427_3434.)。取肺组织处理、接种 10 日龄SPF鸡胚(盲传2代)，HA, HI试验检测SIV ；同时取肺组织甲醛固定，做病理切片观察。临床表现记录每天给动物喂食时(早、中、晚3次)，观察动物，记录观察项目的出现情况，最后根据5天记录结果，进行平均，获得动物临床表现打分值，具体方法参考文献(王兴龙，猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株NSP2基因遗传变异及GM-CSF对GP3/GP5 的免疫增强作用研究，南京农业大学博士论文，2010. 6，61)进行。临床表现记录包括精神沉郁、食欲下降、眼睑水肿、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽、皮肤发红和粪便干硬8项指标，每项有 1分，无0分。5.1攻毒后体温测量结果攻毒后第一天第2、3、4、5、6组猪的直肠温度都有不同程度的升高，但上升的幅度有限，一股为40°C，2天后体温回复正常。第1组猪的直肠温度在攻毒后一直保持在正常范围 38. 7-39. 3"C。5.2攻毒后鼻腔排毒情况测量结果
从攻毒前开始采集每头猪的鼻拭子，一直到试验结束。按Wesley (Wesley R D， Tang Μ,Lager K Μ. Protection of Weaned Pigs by Vaccination with Human Adenovirus 5 Recombinant Viruses Expressing the Hemagglutin in and the Nucleoprotein of H3N2 Swine Influenza Virus [J] Vaccine, 2004, 22 (25/26) :3427-3434.)检测鼻拭子中 SIV量，结果如图15、16。用同源病毒Hmi攻毒后，PK15和wtSPV组猪的鼻腔中都有SIV分泌，而重组毒免疫组5头猪未检测到病毒。用异型病毒H3N2攻毒后，PK15和wtSPV组猪的鼻腔中也都有SIV分泌，重组毒免疫组5头猪中3头有SIV分泌，病毒量低于对照组。5. 3SIV(HlNl)刺激猪外周血淋巴细胞分泌细胞因子检测猪外周血中淋巴细胞经SIV(Hmi)刺激特异的细胞因子含量检测结果(图17)显示在免疫后21d，各组猪外周血淋巴细胞培养上清中都有细胞因子分泌。组间比较rSPV/ Hl免疫组猪外周血淋巴细胞培养上清中IFN-Y和IL-4含量显著高于其它两个对照组(P < 0. 05)。5.4猪肺组织病理变化观察(图18)攻毒后第1组(A)仔猪肺脏无变化，第2组(B)取眼观有病变的部分，有轻微的病理变化，3、4、5、6组都有明显的病理变化。主要是肺泡内淋巴细胞浸润、肺泡壁破坏、上皮细胞脱落，支气管腔内充满淋巴细胞。5.5猪体攻毒保护试验(表2)血清中和试验结果显示，免疫后21d，rSPV/Hl免疫组猪血清中均能够检测到 SIV(Hmi)特异的中和抗体，但不同猪之间抗体滴度变化较大，低的为1 8，高的达到 1 32。wtSPV、H(15免疫组猪血清对SIV(Hmi)没有中和活性。而经检测，所有试验猪血清对SIV(H3N2)无中和作用。免疫后21d攻毒，26d时，不论是用SIV(HlNl)攻击还是用SIV(H3N2)攻击的免疫 rSPV/Hl的猪均无SI症状出现。而对照组猪表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、眼睑水肿、流鼻涕、喜卧、呼吸困难、咳嗽和皮肤发红，但大多数症状轻微，持续时间较短。rSPV/Hl免疫组猪中用SIV (H3N》攻击的有3/5头有轻微肉眼可见病理变化，病变区仅约1. 5cmXl. 5cm大小。而所有对照组猪肺部都有紫色、坚实区出现，然而，约80%猪的病变区约为3cmX3cm，往往局限在某一区域。免疫rSPV/Hl的猪只从用SIV (H3N2)攻击的1头猪肺组织分离到SIV (H3N2)，而对照组猪全都分离到SIV。本研究成功构建了表达SIVH1N1 HAl的重组猪痘病毒rSPV/Hl，并在小鼠、豚鼠和猪体内分别进行了免疫及攻毒保护实验。结果显示，免疫了重组猪痘病毒rSPV/Hl的动物体内产生了 SIV(HAl)特异的抗体，免疫组的淋巴细胞增殖指数和培养上清中IFN-Y、IL-4 含量显著高于对照组。证明rSPV/Hl能够显著提高机体的体液免疫及细胞免疫反应。免疫 rSPV/Hl的豚鼠和猪攻毒后无流感症状出现。而对照组则表现为体温升高、精神沉郁、食欲下降、流鼻涕、呼吸困难、咳嗽等流感症状。rSPV/Hl免疫组中只有异型病毒SIV攻击的动物中2/6豚鼠、3/5猪有轻微肉眼可见病理变化，而所有对照组肺部都有范围大小不等的紫色、肉变区出现，豚鼠的肺部病理变化特别严重，普遍有约60%的区域呈现明显的肉样变化。用同源病毒攻毒后，PK15和wtSPV组猪的鼻腔中都有SIV病毒分泌，而重组毒免疫组5头猪未检测到病毒。用异型病毒攻毒后，PK15和wtSPV组猪的鼻腔中也都有SIV病毒分泌，重组毒免疫组5头猪中3头有SIV病毒分泌，但病毒量低于对照组。免疫rSPV/Hl的动物中只有异型病毒SIV (H3N》攻击的动物1/6豚鼠、1/5猪肺组织中分离到SIV(H3N2)，而对照组全都分离到SIV。综上所述，本研究获得了猪流感HmiHAl蛋白重组猪痘病毒rSPV/Hl。rSPV/Hl能诱导动物产生显著的体液免疫和细胞免疫反应。不仅能保护豚鼠和猪抵御同源SIV HlNl 的攻击，还能部分抵御异型SIV H3N2的攻击。表1豚鼠的免疫应答及攻毒后结果
权利要求
1.一种猪流感病毒Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/Hl，其特征在于该转移载体是将序列为SEQ ID NO. 1所示的猪流感病毒Hmi毒株HAl基因序列插入猪痘病毒载体 PUSZll的BamHI酶切位点所得。
2.一种猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于该病毒是将猪痘病毒和权利要求1所述的转移载体PUSZ11/H1感染、转染H(15细胞，进行同源重组获得的阳性克隆。
3.根据权利要求2所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于所述的猪痘病毒为ATCC保藏号为ATCC number VR-363 野生型猪痘病毒wtSPV。
4.根据权利要求3所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒，其特征在于所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒于2011年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :V201101。
5.权利要求2所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于包括如下步骤(1)根据GenBank 收录号为 EU5(^884 的猪流感病毒 A/swine/aianghai/1/2005 (HlNl) 毒株HAl的基因序列，自行设计并合成序列为SEQ ID NO. 1所示的HAl基因；(2)将所述的序列为SEQID NO. 1的HAl基因插入猪痘病毒载体pUSZll中，然后通过 PCR、酶切和测序鉴定，获得所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl基因的转移载体pUSZll/Hl ；(3)将猪痘病毒和所述的HAl基因的转移载体pUSZll/Hl感染、转染H(15细胞，进行同源重组获得所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒。
6.根据权利要求5所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于步骤( 所述的HAl基因插入猪痘病毒载体pUSZll的具体方法为利用BamHI分别对步骤(1)所述的序列为SEQ ID NO. 1的HAl基因和猪痘病毒载体pUSZll进行单酶切， 回收大小为1031bp的HAl基因目标片段和大小为8391bp的猪痘病毒载体pUSZll线性大片段，连接两片段，得到重组质粒，经测序和测定正反向，将测序结果符合目的片段且方向为正向的质粒定名为pUSZll/Hl。
7.根据权利要求5所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于所述的制备方法还包括所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的蚀斑纯化步骤。
8.根据权利要求5所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒的制备方法，其特征在于所述的制备方法还包括利用IFA和ffestern-blot技术对所述的猪流感病毒Hmi 亚型HAl蛋白重组猪痘病毒进行表达鉴定的步骤。
9.权利要求2所述的猪流感病毒Hmi亚型HAl蛋白重组猪痘病毒在制备预防和/或治疗猪流感病毒Hmi亚型感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了猪流感病毒H1N1亚型HA1蛋白重组猪痘病毒及其制备方法。根据猪流感病毒A/swine/Shanghai/1/2005(H1N1)毒株HA1的基因序列设计、合成HA1基因，并把该基因克隆入猪痘病毒载体pUSZ11中，得到转移载体pUSZ11/H1。所述的重组病毒是将猪痘病毒和转移载体pUSZ11/H1感染、转染PK15细胞，进行同源重组获得的阳性克隆。该重组猪痘病毒能稳定表达HA1蛋白，接毒后细胞病变出现规律，种毒的毒价稳定在107TCID50/mL，并能有效地刺激机体的免疫保护反应，能够在制备预防和/或治疗猪流感病毒H1N1亚型感染的药物中应用。
文档编号A61P31/16GK102154365SQ201110026879
公开日2011年8月17日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者许家荣, 陆承平, 黄冬艳 申请人:南京农业大学