一种甲型h1亚型流感病毒抗体阻断elisa试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成：a）一种甲型H1亚型流感病毒A-Influ/JML-F9;b）一种特异性强的抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体；c）抗甲型H1亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；d）盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品和阴性对照样品。还公开了一种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型H1亚型流感病毒抗体检测中的应用。具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，操作简单易行，不需由专业人员操作。试剂盒稳定性好、保存期长，解决了甲型H1亚型流感病毒抗体检测的问题。
【专利说明】—种甲型H1亚型流感病毒抗体阻断ELISA试剂盒及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物病毒学与免疫学检测【技术领域】。具体地说，本发明涉及一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，还涉及一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在猪群中甲型Hl亚型流感病毒抗体检测的用途。
【背景技术】
[0002]2009年3月，墨西哥部分地区出现大量的流感样病例及严重呼吸道感染病症，4月15日和4月17日，美国⑶C在两例病例背景相互独立的临床样品中检测到了同一种新型的HA亚型流感病毒，即甲型HlNl病毒，随后证实该病毒即为导致3月份流感样病例的病原。在随后的不到6周时间内，疫情在美国、墨西哥、加拿大以外的国家和地区爆发。2009年6月世界卫生组织宣布对甲型(HlNl)流感的警戒级别升至6级，意味着甲型(HlNl)流感的世界性大流行已形成。最近一次流感的世界性大流行起源于墨西哥，一开始被称为猪流感(Swine flu),随后根据病毒的分析,改称为猪源性流感病毒感染(swine origin influenzavirus infection,简称S-OIV infection),最后为了与人的季节性流感A (HlNl)区别，改称新流感A (HlNl)，在我国则称为甲型HlNl流感。甲型HlNl流感对人及动物的健康造成巨大的影响，而且对经济造成了巨大的损失。
[0003]1975年,Kohler G和Milstein C在Nature杂志上发表了细胞融合法建立杂交瘤技术，创建了具有划时代意义的杂交瘤单克隆抗体技术。经克隆后产生结构和各种特性完全相同的高纯度抗体，称为单克隆抗体(Monoclonal Antibody, McAb),简称单抗。单克隆抗体技术的发现和使用，对现代生命科学研究的发展起到了巨大的推动作用，已经成为生物【技术领域】的一个重要方面。迄今，该技术的应用已经广泛应用于基础研究、疾病诊断、治疗、预防等方面。
[0004]1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay,简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。(焦奎等.酶联免疫分析技术及应用[M].北京:化学工业出版社，2004，84?141 ;李文敏.酶联免疫吸附反应的技术进展及应用[J].湖北职业技术学院学报，2003，4 (6):65?69)。尤其是阻断ELISA，在亚型特异性鉴定中具有很大优势。阻断ELISA(b-ELISA)基本原理是将病原抗原固定在酶标板中，加待检血清样品孵育，随后加入针对包埋抗原的酶标单克隆抗体，若待检血清中含有针对包被病原的特异性抗体，则酶标抗体不与或少量的同包埋抗原结合，反之，酶标单抗将与包埋抗原发生结合反应，显色后，血清中特异性抗体越多OD值越低，反之OD值越高。b-ELISA中，由于包被的抗原纯度很高，且单克隆抗体具有很高的抗原识别特异性，因此能解决了间接法中抗原抗体之间的非特异性反应以及交叉反应。由于b-ELISA具有鉴别诊断的优势，故常被用于不同血清型毒株间的鉴别诊断。
[0005]酶标记抗体技术是ELISA检测方法的关键技术，本发明中所用的酶标记抗体是本实验室自行生产抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素单克隆抗体，经过辣根过氧化物酶(简称HRP)标记，具有很高的酶活性，产量高及成本低。
【发明内容】
[0006]本发明的主要目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短，解决了甲型Hl亚型流感病毒抗体检测的问题。
[0007]本发明的另一个目的是在于提供了一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型Hl亚型流感病毒抗体检测中的应用。操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4°C条件下放置半年不会影响其敏感性。
[0008]本发明是这样实现的:
[0009]一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成:
[0010]a) —株甲型Hl亚型流感病毒A-1nflu/JML-F9，该毒株于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201105。(专利受理号:201110036167.X，在中国典型培养物保藏中心购买)；
[0011]b) —种特异性强的抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201106 (专利受理号:201110036167.X，在中国典型培养物保藏中心购买)；
[0012]c)抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；
[0013]d)盒体内的样品稀释液(请见具体实施例4)、10倍洗涤液(请见具体实施例4)、底物液A (请见具体实施例4)、底物液B (请见具体实施例4)、反应终止液(请见具体实施例4)，阳性对照样品(甲型Hl亚型流感猪阳性血清)和阴性对照样品(甲型Hl亚型流感猪阴性血清)组成。
[0014]一种抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体的制备方法，其步骤为:
[0015]A、腹水的制备，取5-6周龄雌性的BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心)腹腔注射弗氏完全佐剂0.5mL/只，5天后腹腔注射IX IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制(HI)法检测腹水效价，-70 V保存。
[0016]B、一种抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体的纯化。
[0017]C、一种抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体的标记。[0018]D、上述抗体经过纯化和标记后可用于制备检测甲型Hl亚型流感病毒的抗体阻断ELISA试剂盒。
[0019]一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型Hl亚型流感病毒抗体检测中的应用，其检测步骤是:
[0020](I)包被:以纯化抗原最佳包被浓度包被酶标板为100 μ I/孔，37°C孵育Ih后置4°C过夜。
[0021](2)洗板:弃包被液，PBST洗涤液，200 μ I/孔，洗涤3次，每次3min。
[0022](3)封闭:拍干酶标板，加入封闭液，200 μ I/孔，37°C孵育2h，封闭非特异性结合位点。
[0023](4)洗板:弃封闭液，同步骤(2)。
[0024](5)加待检样品:拍干酶标板,加入待检样品，100 μ I/孔，设阴性对照，37°C孵育30mino
[0025](6)洗板:弃待检样品液，同步骤(2)。
[0026](7)加酶标抗体:拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体，体积比为1:800倍稀释，100 μ I/ 孔，37°C放置 30min。
[0027](8)洗板:弃酶标抗体，同步骤(2)。
[0028](9)显色:每孔加入新配的底物A液、底物B液各50 μ 1，室温避光显色lOmin。
[0029]( 10)终止反应:每孔加入50 μ I反应终止液终止反应；
[0030](11)测定OD63tl值:酶标仪测定波长为630nm时OD值。
[0031](12)根据PI计算公式算出每孔阻断率判断阴阳性，PI (% )=(阴性对照OD值-样品OD值)/ (阴性对照OD值-阳性对照OD值)X 100%ο
[0032]与现有技术相比本发明具有如下显著优点:
[0033]1、本发明的试剂盒能直接对甲型Hl亚型流感病毒抗体进行检测，具有特异性强，灵敏度高，检测时间短的特点。
[0034]2、本发明的试剂盒适用于对甲型Hl亚型猪流感病毒抗体进行检测，对经典Hl亚型猪流感病毒抗体不反应，具有特异性。
[0035]3、本发明的试剂盒适用于对甲型Hl亚型流感病毒抗体进行检测，而对其它病毒，如:将猪瘟、乙脑、猪流感(H1、H3亚型)、口蹄疫、细小、圆环、猪蓝耳病不反应，具有很好的特异性。
[0036]4、本发明将所需的各种试剂组装成试剂盒，操作简单易行，不需由专业人员操作。本发明的试剂盒稳定性好、保存期长，在4°C条件下放置半年不会影响其敏感性。
[0037]5、本发明一次能同时处理多个样本，非常适合甲型Hl亚型猪流感病毒抗体的临床大规模检测。并能够满足试验要求，也可作为科研使用。
[0038]6、目前市场上还没有检测甲型Hl亚型猪流感病毒抗体的试剂盒。也无区分甲型Hl亚型猪流感病毒抗体和经典Hl亚型流感病毒抗体的鉴别诊断试剂盒。
【专利附图】
【附图说明】
[0039]图1为一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒技术路线示意图。
[0040]图2为一种甲型Hl亚型猪流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒的检测敏感性示意图。
[0041]图3为一种甲型Hl亚型猪流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒的检测特异性示意图。
【具体实施方式】
[0042]实施例1
[0043]一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成:
[0044]a) —株甲型Hl亚型流感病毒A-1nf lu/JML-F9，该毒株于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201105。(已申请了专利，专利受理号:201110036167.X，在中国典型培养物保藏中心购买，请见遗传资源表)
[0045]b) 一种特异性强的抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体，分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株于2011年I月27日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO:V201106 (已申请专利，专利受理号:201110036167.X，在中国典型培养物保藏中心购买，请见遗传资源表)；
[0046]c)抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素(HA)蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒；
[0047]d)盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品(甲型Hl亚型猪流感阳性血清)和阴性对照样品(甲型Hl亚型猪流感阴性血清)组成。
[0048]一种甲型Hl亚型流感病毒(保藏编号为CCTCC NO:V201105)的扩增、灭活及纯化，
其步骤是:
[0049]1、将保藏编号为CCTCC NO:V201105的甲型Hl亚型流感病毒A-1nflu/JML-F9进行扩增；
[0050](I)严格筛选9?10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司，请见遗传资源表)。
[0051]每批送过来的鸡胚要经过严格筛选。外检共4项:白壳、大小、破损及脏胚，内检共9项:去除沙壳、偏气室、游气室、倒置胚、无精蛋、终止胚、弱胚、污染胚、裂缝胚。
[0052](2)接种病毒(A-1nflu/JML-F9)于鸡胚尿囊腔
[0053]选用9?10日龄无特定病原体(Specific pathogen Free, SPF)鸡胚(购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司)，画出气室和胚位，在气室接近胚位处涂抹碘酊和酒精进行消毒，用钢锥穿一小孔，随后将ImL注射器针头沿此小孔插入(避开血管)，接种甲型Hl亚型流感病毒(A-1nflu/JML-F9)。最后用石蜡封口，并置37°C下孵育72h。每天检查鸡胚生长情况，每12h翻卵并检卵一次。24h内死亡的鸡胚，认为是非特异死亡并弃去，72h收取鸡胚，4 °C下放置过夜。
[0054](3)含甲型Hl亚型流感病毒(A-1nf lu/JML-F9)尿囊液的收获
[0055]用75%浓度的酒精消毒鸡胚气室端，用无菌镊子撕破鸡胚气室蛋壳，在绒毛尿囊膜无大血管处穿破。用无菌移液管吸取鸡胚尿囊液置于相应的收集管中。将鸡胚收获液3000r/min离心5min去除血液和细胞。然后进行红细胞凝集实验，确定鸡胚尿囊液血凝效价。
[0056]2、甲型Hl亚型流感病毒A-1nf lu/JML-F9的灭活
[0057]将含病毒A-1nf lu/JML-F9尿囊液冻融3次后，按终浓度0.8%的甲醛缓慢加入甲醛溶液，充分混合均匀，37°C灭活24小时，每隔6小时振摇I次。每个病毒灭活容器应立即取样，分别进行病毒灭活验证试验。灭活容器的甲型Hl亚型流感病毒的尿囊液经检定合格。8000r/min,离心lOmin。弃去沉淀,上清备用。
[0058]3、甲型Hl亚型流感病毒A-1nf lu/JML-F9浓缩及纯化
[0059](1)将甲型Hl亚型流感病毒A-1nflu/JML-F9进行浓缩，方法是:将甲型Hl亚型流感病毒鸡胚尿囊液于27000r/min，离心2小时，弃去上清，沉淀用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬，充分混匀备用。
[0060](2 )甲型Hl亚型流感病毒A-1nf lu/JML-F9纯化
[0061]在超速离心管中依次加入60%、45(%、30(%、20(%浓度蔗糖溶液形成密度梯度。将重悬好的病毒A-1nflu/JML_F9样品平铺于最上层，于32000r/min,离心lh。离心后取出45%、30%之间层面样品，用PBS重悬30%、45%之间层面样品取出样品，320001'/11^11，离心lh，取沉淀(即得所述的病毒A-1nflu/JML-F9)进行蛋白质含量测定。以此作为包被抗原。
[0062]一种抗甲型Hl亚型流感血凝素蛋白单克隆抗体的制备方法，其步骤是:
[0063]1、腹水的制备，选用5-6周龄雌性的BABL/c小鼠(购自湖北省实验动物研究中心，请见遗传资源表)腹腔注射弗氏完全佐剂0.5mL/只，5天后腹腔注射I X IO6个杂交瘤细胞/只，9天后收取腹水，血凝抑制法(HI)检测腹水效价，-70°C保存。
[0064]2、腹水抗体的纯化:辛酸-硫酸铵法
[0065]具体步骤如下:
[0066](1)将上述步骤3制备的腹水1500r/min离心IOmin,用0.45 μ m滤膜过滤,滤液边搅拌边加入用4倍体积60mmol/L醋酸缓冲液A(pH=4.5)；
[0067](2)边搅拌边逐滴加入正辛酸至终浓度为33μ Ι/mL，室温条件下搅拌30min，8000r/min离心30min,弃沉淀收集上清；
[0068](3)将步骤(2)的上清液经滤纸过滤一次，滤液pH调制7.4 ；
[0069](4)向步骤(3)所得的滤液边搅拌边加入饱和硫酸铵溶液％ (硫酸铵体积/总体积<45%)，待滤液程白色浑浊液时，继续搅拌30min，然后于4°C静置5h。再于4°C条件12000r/min 下离心 30min ；
[0070](5)弃上清,沉淀用 1Ommol pH=9.0Tris-HCl 重悬；在 100倍体积的 IOmmol pH=9.0的Tris-HCl中，于4°C条件下磁力搅拌透析36h,期间3次(12h/次)更换新鲜Tris-HCl液。透析结束，取上清，用SDS-PAGE电泳的方法鉴定抗体的纯度，用紫外分光光度计测定抗体浓度，分装、冻存。
[0071]上述纯化抗体试验中所用试剂按照以下配方配制:
[0072]A:醋酸缓冲液(60mmol/L):C2H3Na022.463g，用 ddH20 定容至 500mL (ρΗ=4.5)。
[0073]B: (NH4)2SO4 (饱和):每 IOOmL ddH20 中加(NH4)2S0490g，加热至 80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7.2，备用。[0074]3、辣根过氧化物酶(HRP)标记单克隆抗体(保藏编号为CCTCC NO:C201106)
[0075](I)取5.0mg的辣根过氧化物酶(HRP ) 5.0mg溶于5mLddH20，溶液呈棕红色；随后滴加Na104A(60mmol/L)0.5mL，使溶液呈草绿色，4°C条件放置30min ;滴加乙二醇(160mmol/L) B0.5mL，终止氧化反应，室温下避光条件放置30min，溶液呈棕黄色；
[0076](2)取本发明制备的单克隆抗体(保藏编号为CCTCCNO:C201106)5mL (lmg/mL)与上述步骤(I)所处理好的液体混合，IOmmol pH=9.5碳酸盐缓冲液c’ 4°C条件下磁力搅拌透析过夜。
[0077](3)向完成透析液体中加新鲜配制的浓度为5mg/mL的NaBH4110.2mL,于4°C下放置2h ;然后等体积加入饱和硫酸铵E,于4°C下静置30min, 7000r/min离心IOmin,弃去上清。PB溶液(20mmol/LpH=7.4，配制方法如后所述)F3mL重悬，在1000倍体积的PB (20mmol/LpH=7.4)中，4°C条件下磁力搅拌透析，透析36h，期间3次(12h/次)换液。
[0078](4)标记抗体完成透析后，加PB(20mmol/LpH=7.4)、甘油(终浓度30%)定容至5mL，于-20°C保存。
[0079]标记抗体试验中所用试剂按以下配方配制:
[0080]AiNaIO4 (60mmol/L) =NaIO4L 283g，用 ddH20 定容至 IOOmL;
[0081]B:乙二醇(160mmol/L):乙二醇 13.4μ 1，用 ddH20 稀释至 1.5mL;
[0082]C:碳酸盐缓冲液 IOmmol pH=9.5:Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,用 ddH20 定容至IOOOmL (pH=9.5)；
[0083]D: NaBH4 (5mg/mL) =NaBH40.05g,用 ddH20 定容至 10mL，现配现用；
[0084]E: (NH4)2SO4 (饱和):每 IOOmL ddH20 中加(NH4)2S0490g，加热至 80°C溶解，趁热滤纸过滤，降至室温既有结晶析出，所得带有结晶滤液即为饱和硫酸铵溶液。用25%氨水调pH值至7.2，备用。
[0085]F:PB (20mmol/L pH=7.4) Na2HPO4.12H20 3.58g, NaH2PO4 1.56g，用 ddH20 定容至IOOOmL (pH=7.4)。
[0086]实施例2
[0087]一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA试剂盒在甲型Hl亚型流感病毒抗体检测中的应用，其步骤是:
[0088]1、核心试剂配制:
[0089]包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)=Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g,用 ddH20 定容至IOOOmL(pH9.6)。
[0090]10 倍洗涤液:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL,用 ddH20 定容至 IOOOmL (ρΗ=7.4)。
[0091]封闭液:5g脱脂乳溶于IOOmL洗涤液。
[0092]底物液:分为底物液A和底物液B。具体组成如下:
[0093]底物液A:0.006% (体积比)浓度的H2O2缓冲液。
[0094]底物液B:取 Na2HPO4.12H2014.2g，柠檬酸 10.5g,用 ddH20 定容至 500m 配成 0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH=5.0)，然后按终浓度为20mg/L添加联苯二胺(TMB)(使用时将底物液A和底物液B等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用)。
[0095]反应终止液:0.025% (体积比)氢氟酸(HF) ；HF (40%) 625 μ L，用ddH20定容至1OOmL。
[0096]2、ELISA检测方法步骤:
[0097](I)包被抗原(保藏编号为CCTCC NO:V201105)最佳包被浓度和辣根过氧化物酶标记抗体最佳稀释浓度比采用方阵滴定法(李海燕等.禽流感病毒重组核蛋白ELISA诊断技术的研究，2000，22(3):182~185)来确定。包被抗原为灭活甲型Hl亚型流感病毒(A-1nf Iu/JML-F9)尿囊液。试验结果显示包被抗原(保藏编号为CCTCC N0:V201105)最佳包被浓度为4.438 μ g/mL，辣根过氧化物酶标记抗体最佳稀释浓度比为1:800。
[0098](2)酶标反应板的制备:纯化抗原(保藏编号为CCTCC NO:V201105)用包被液按照体积比为1:400的比例稀释，100 μ I/孔加入到酶标板中，37°C放置Ih后置4°C冷库过夜；甩干包被液，用洗涤液洗涤I次，每次5min，甩干洗涤液；加封闭液200 μ I/孔到酶标板中，于37°C封闭2h，甩干封闭液。于4°C冷藏过夜，自然干燥。
[0099]3、结果判定值的确定:
[0100]通过对158份已知背景的甲型Hl亚型流感病毒样品(76份阳性血清样本、82份阴性血清样本)进行检测，得到结果，求其C.0.值为83%，根据批内差，得出本方法灰区为76%-89%，结合其他分析结果，将灰区设定为83%-89%，即待测样品的阻断值PI≥89%则判定为阳性，值< 83%则判定为阴性，值在83%-89%之间需要重复检测。
[0101]4、阴阳性对照样品的制备:
[0102](I)阳性血清的制备:选用4周龄健康仔猪，免疫前采血用血凝抑制试验方法检测阴性后，隔离观察7日。将甲型Hl亚型流感病毒(血凝价大于27)悬液甲醛灭活后，加入等量的佐剂乳化作为免疫原。通过颈部肌肉注射途径进行3次免疫，每次剂量分别为2mL、2mL、4mL，免疫间隔时间为21日。末次免疫后7~10日采血并分离血清，进行HI试验检测抗体效价。当免疫猪抗体HI效价达到1:320以上时，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清备用(2~8°C保存，有效期为12个月)。取备用血清经56°C灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，调整到ELISA方法检测OD63tlnm值为0.8~1.6之间。按血清量的
0.01 % (体积比)加入硫柳萊,0.45 μ m滤膜过滤除菌。无菌分装,每管lmL。
[0103](2)阴性血清的制备:选用4周龄健康仔猪，经血凝抑制试验检测为甲型Hl亚型流感病毒抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用(2l°C保存，有效期为12个月)。取备用血清经56°C灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，调整到ELISA方法检测OD63tol值低于0.2。按血清量的0.01% (体积比)加入硫柳萊，0.45 μ m滤膜过滤除菌。无菌分装,每管lmL。
[0104]5、甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测方法的使用步骤:
[0105](I)包被:以纯化抗原最佳包被浓度包被酶标板为100 μ I/孔，37°C孵育Ih后置4°C过夜。
[0106](2)洗板:弃包被液，PBST洗涤液，200 μ I/孔，洗涤3次，每次3min。
[0107](3)封闭:拍干酶标板，加入封闭液，200 μ I/孔，37°C孵育2h，封闭非特异性结合位点。
[0108](4)洗板:弃封闭液，同步骤(2)。
[0109](5)加待检样品:拍干酶标板,加入待检样品，100 μ I/孔，设阴性对照，37°C孵育30mino[0110](6)洗板:弃待检样品液，同步骤(2)。
[0111](7)加酶标抗体:拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体，体积比为1:800倍稀释，100 μ I/ 孔，37°C放置 30min。
[0112](8)洗板:弃酶标抗体，同步骤(2)。
[0113](9)显色:每孔加入新配的底物A液、底物B液各50 μ 1，室温避光显色lOmin。
[0114](10)终止反应:每孔加入50 μ I反应终止液终止反应；
[0115](11)测定OD63tl值:酶标仪测定波长为630nm时OD值。
[0116](12)根据PI计算公式算出每孔阻断率判断阴阳性，PI (% )=(阴性对照OD值-样品OD值)/ (阴性对照OD值-阳性对照OD值)X 100%ο
[0117]实施例3
[0118]甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测方法的敏感性试验和特异性试验
[0119]1、甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测方法的敏感性试验
[0120]通过本发明敏感性试验，已知阳性血清HI效价为1:2560，原浓度十倍稀释后，连续两倍比稀释，结果如下图，本方法敏感性可达到HI效价为21 (殷震等.动物病毒学(第2版)[M].北京:科学出版社，1997)。结果见附图2。
[0121]2、甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测方法的特异性试验
[0122](1)经典猪流感Hl亚型(⑶株)、经典猪流感Hl亚型(TJ株)、猪流感H3亚型、猪瘟、乙脑、口蹄疫、伪狂犬、细小、圆环、蓝耳等阳性血清PI值分别为=40.04%,57.78%,82.61%、
8.91%,56.33%、16.73%,8.99%、11.57%,0.52%,51.49% ;均低于临界值 89%,说明本方法特异性良好。结果见附图3。
[0123]实施例4
[0124]甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒的组装
[0125]1、甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒包括:
[0126]I)包被甲型Hl亚型流感病毒(保藏编号为CCTCC NO:V201105)的96孔酶标板
[0127](8 孔 X 12 条 X2 块)
[0128]2)阴、阳性对照(具体配方详见:2、相关试剂的配制)
[0129]各 I 管(0.5mL/管)
[0130]3)辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体
[0131]I 瓶(25mL/瓶)
[0132]4) 10倍洗涤液I瓶(50mL/瓶)
[0133]5)底物液A、底物液B各I瓶(12mL/瓶)
[0134]6)反应终止液I瓶(12mL/瓶)
[0135]7)样品稀释液I瓶(50mL/瓶)
[0136]2、相关试剂的配制
[0137]包被液(25mmol/L碳酸盐缓冲液)=Na2CO3 1.59g, NaHCO3 2.93g，用 ddH20 定容至1000mL(pH9.6)。
[0138]10 倍洗涤液:NaCl 80g, KCl 2g, Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL,用 ddH20 定容至 1000mL (ρΗ=7.4)。
[0139]封闭液:5g脱脂乳溶于IOOmL洗涤液。[0140]底物液:底物液A:0.006%H202缓冲液；底物液B:取Na2HPO4.12H2014.2g，柠檬酸
10.5g,用ddH20定容至500mL，配成0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液(pH=5.0)，然后加上联苯二胺(TMB)。使用时将底物液A和底物液B等体积混合，混合后5分钟内使用，现配现用。
[0141]反应终止液:0.025% 氢氟酸(HF) ;HF (40%) 625 μ L，用 ddH20 定容至 100mL。
[0142]样品稀释液的配制:PBS+TritonX-100+3%BSA
[0143]阳性对照样品的配制:将制备的阳性血清用样品稀释液1:1稀释后作为阳性对照样品分装成0.5mL/管，置4°C下保存。
[0144]阴性对照样品的配制:将制备的阴性血清用样品稀释液1:1稀释后作为阴性对照样品分装成0.5mL/管，置4°C下保存。
[0145]实施例5
[0146]甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒的操作步骤
[0147]I)取酶标板(根据样品多少可拆开分次使用)，将10倍浓缩洗涤液用蒸馏水稀释后，洗板一次(200 μ I/孔)后拍干；
[0148]2)加入待检样品，100 μ I/孔，设阴性对照，37°C孵育30min ；
[0149]3)弃待检样品液，洗涤液200 μ I/孔，洗涤3次，每次3min。
[0150]4)拍干酶标板后加入HRP标记抗体，1:800倍稀释，100 μ I/孔，37°C放置30min ；
[0151]5)弃酶标抗体，加入洗涤液，200 μ I/孔，洗涤3次，每次3min ；
[0152]6)每孔加入新配的底物A、B液各50 μ 1，室温避光显色IOmin
[0153]7 )终止反应:每孔加入50 μ I反应终止液终止反应；
[0154]8)测定0D630值:酶标仪测定波长为630nm时OD值；
[0155]9)根据PI计算公式算出每孔阻断率:PI (% )=(阴性对照OD值-样品OD值)/(阴性对照OD值-阳性对照OD值)X 100%
[0156]10)结果判定:阴、阳性对照的PI值是反应试剂盒质量和试验操作规范的重要标志，我们选择免疫了灭活的甲型Hl亚型流感病毒的猪血清作为阳性对照，SPF空白猪血清作为阴性对照。ELISA试验成立的条件是阳性对照PI值大于89%，阴性对照PI值小于83%。阳性对照、阴性对照必须控制在这个范围内，否则检测结果无效。
[0157]尽管本发明的内容是结合本实施例进行说明，但是不能认为是对本发明范围的限制，本发明的范围由所附权利要求书限定。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰形式同样落在本发明的保护范围内。
【权利要求】
1.一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒，该试剂盒由以下物质组成: a)一种甲型Hl亚型流感病毒A-1nflu/JML-F9; b)一种特异性强的抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体； c)抗甲型Hl亚型流感病毒血凝素蛋白的单克隆抗体制备成抗体阻断ELISA核心试剂盒; d)盒体内的样品稀释液、10倍洗涤液、底物液A、底物液B、反应终止液，阳性对照样品和阴性对照样品； 其中: 所述的试剂组分及其配比如下: (1)样品稀释液的配制:PBS+TritonX-100+3%BSA;在121°C高压蒸汽下灭菌30分钟后分装，置4°C贮存； (2)阳性血清的制备:选用4周龄健康仔猪，免疫前采血用血凝抑制试验方法检测阴性后，隔离观察7日，将甲型Hl亚型流感病毒悬液甲醛灭活后，加入等量的佐剂乳化作为免疫原，通过颈部肌肉注射途径进行3次免疫，每次剂量分别为2mL、2mL、4mL，免疫间隔时间为21日，末次免疫后7~10日采血并分离血清，进行HI试验检测抗体效价，免疫猪抗体HI效价达到1:320时，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清备用，取备用血清经56°C灭活30分钟后用样品稀释液稀释，调整到ELISA方法检测OD63tlnm值为0.8~1.6之间，按血清量的0.01%体积比加入硫柳汞，0.45Mm滤膜过滤除菌，无菌分装，每管ImL ； (3)阴性血清的制备:选用4周龄健康仔猪，经血凝抑制试验检测为甲型Hl亚型流感病毒抗体阴性，隔离观察7日后，采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心并分离血清备用，取备用血清经56°C灭活30分钟后用样品稀释液适当稀释，调整到ELISA方法检测OD63tol值低于0.2，按血清量的0.01%体积比加入硫柳汞，0.45Mm滤膜过滤除菌，无菌分装，每管ImL ； (4)底物液A:0.006%H202缓冲液；
(5)底物液B:取 Na2HP04*12H20 14.2 g，柠檬酸 10.5g，用 ddH20 定容至 500mL 成 0.1mL磷酸盐柠檬酸缓冲液，PH5.0 ;按终浓度为20mg/L添加联苯二胺； (6)反应终止液:0.025%体积比氢氟酸；HF 625 μ L，用ddH20定容至IOOmL ；
(7)10 倍洗涤液:NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4.12H20 29g, KH2PO4 2g, Tween-20 5mL，用ddH20 定容至 1000mL，pH7.4。
2.权利要求1所述的一种甲型Hl亚型流感病毒抗体阻断ELISA检测试剂盒在甲型Hl亚型流感病毒抗体检测中的应用，其检测步骤是: (1)包被:以纯化抗原最佳包被浓度包被酶标板为100μ I/孔,37°C孵育Ih后置4°C过夜； (2)洗板:弃包被液，PBST洗涤液，200μ I/孔，洗涤3次，每次3min ； (3)封闭:拍干酶标板，加入封闭液，200μ1/孔，37°C孵育2h，封闭非特异性结合位点； (4)洗板:弃封闭液，同步骤(2); (5)加待检样品:拍干酶标板，加入待检样品，100μ I/孔，设阴性对照，37 °C孵育30min ；(6)洗板:弃待检样品液，同步骤(2)； (7)加酶标抗体:拍干酶标板后加入HRP标记的抗单克隆抗体，体积比为1:800倍稀释，.100 μ I/孔，37。。放置 30min ； (8)洗板:弃酶标抗体，同步骤(2)； (9)显色:每孔加入新配的底物液A、底物液B各50μ 1，室温避光显色IOmin ； (10)终止反应:每孔加入50μ I反应终止液终止反应； (11)测定OD63tl值:酶标仪测定波长为630nm时OD值； (12)根据PI计算公式算出每孔阻断率判断阴阳性，PP/o=阴性对照OD值-样品OD值/阴性对照OD值-阳性对照O D值X 100%ο
【文档编号】C07K16/10GK103592436SQ201210290743
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年8月15日 优先权日:2012年8月15日
【发明者】金梅林, 李淑云, 王灿, 赵刚, 郭学波 申请人:华中农业大学