一种甲型流感病毒分子检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩 增检测试剂盒及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 甲型流感病毒属于正粘病毒科，基因组由8个负链单股RNA节段组成，至少编码11 种蛋白。甲型流感病毒的宿主分布广，可感染禽、人、猪、马、狗、猫、海洋哺乳动物（海豹、鲸 等）等。在整个甲型流感病毒的生态分布中，野生水禽和海岸鸟是主要的自然贮存宿主和 基因库，目前发现的大多数甲型流感病毒亚型（16个Η亚型和9个N亚型）都存在于野生 水禽中。20世纪人类经历了 3次流感大流行，分别是1918年西班牙流感（Η1Ν1)、1957年亚 洲流感（Η3Ν2)和1968年香港流感（Η3Ν2)。据WHO估计，全球每年约有25-50万人死于季 节性流感引发的疾病。甲型流感是人类季节性流感病毒主要成员，可以感染所有人群，对一 些特殊人群（如孕妇、老年人和基础性疾病患者）能引起严重疾病乃至死亡。季节性流感 是由流感病毒引起的一种人类重要的全球性呼吸道传染病，热带地区常年流行，而在温带 地区主要发生在冬季，具有一定的季节性流行特点。目前在人群中流行主要是甲型H1N1和 H3N2亚型流感病毒。WHO在全球建立了季节性流感监测网络，以了解病毒流行情况，为流感 全球防控和疫苗研制提供科学依据。
[0003] 甲型流感病毒是人类流感监测和临床诊断关注的重点病毒。甲型流感病毒的检 测方法主要包括血清学和核酸检测，血清学方法主要用标准血清对分离到的病毒株进行 抗原分型，耗时费力，不适合临床快速分型诊断。目前核酸检测方法主要包括普通PCR法、 Real-timetimePCR法和环等温扩增（LAMP)法等。Real-timetimePCR法和LAMP法具 有很好的特异性和敏感性，但前者依赖昂贵的仪器和试剂；而后者法难以实现多重检测。相 比之下，普通PCR敏感性较差且需要琼脂糖电泳进行结果判定，不适合大规模标本的检测。 因此，需要建立快速敏感、不依赖于昂贵仪器的甲型流感核酸检测方法，以提高流感监测和 临床诊断水平。
【发明内容】
[0004] 本发明需要解决的问题是提供一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增 (RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。
[0005] 本发明提供的甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒由RT-RPA反应体系、Μ片段阳性质 粒Puc-AM、阴性质控品、Μ片段RPA引物和exo探针组成，Μ片段RPA引物和exo探针为：
[0006] M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3' ；
[0007] M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3' ；
[0008] M-exo-probe,5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF] G[dT-BHQ]CACCTCTGACTAAGG[3'-block]3'
[0009] 本发明所述甲型流感病毒RT-RPA检测试剂盒的制备方法；
[0010] (1)病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本 或病毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置 3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上 清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20°C静置2h;取 出于4°C下，12000g，离心20min;弃上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min;弃上 清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置备用；
[0011] (2)RT-RPA反应：采用英国TwistDx公司的TwistAmpRTexos试剂盒，取29.5yL 反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2. 1μL，2. 6μL RPAexo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本RNA模板，涡旋震 荡，短暂离心，再加入2. 5μL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪 中，反应温度为40°C，时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴性对照组。
[0012] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0013] 设计针对甲型流感病毒Μ基因的RPA引物和exo探针，通过反转录-重组酶多聚 酶扩增方法，反应温度为40°C等温条件下，20min即可对临床流感标本和病毒分离物进行 核酸分子鉴定，无需昂贵仪器设备，便于操作，具有快速、敏感、特异等特点，为甲型流感监 测和临床救治提供一种新的检测方法。
【附图说明】
[0014] 图1检测甲型流感病毒Μ节段RPA引物琼脂糖凝胶电泳筛选
【具体实施方式】
[0015] 下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于 实施例。
[0016] 实施例1 :靶基因质粒构建
[0017] 设计针对甲型流感病毒Μ片段的特异性引物，通过PCR法扩增获得1027bp基因片 段，回收纯化后的与T载体连接，获得靶基因阳性质粒，命名为Puc-AM。
[0018] 实施例2 :引物探针设计与筛选
[0019] 通过序列分析软件分析，以甲型流感病毒较为保守的Μ片段序列为模板，共设计 8条正向引物和12条反向引物，引物长度为30-35bp;同时设计1条exo探针（命名为 M-exo-probe)，长度为53bp，其中33位碱基T标记荧光物质FAM，36位碱基由四氢呋喃代 替，38位碱基标记荧光物质BHQ，同时封闭3'末端碱基。
[0020] 采用TwistAmpBasickit(TwistDx公司，英国），以革巴基因克隆质粒Puc-AM为模 板，以琼脂糖凝胶电泳为结果指示手段，对上述设计的引物进行筛选。引物优劣的评价指标 包括特异性、敏感性、扩增效率和引物噪音等。取29. 5μL反应缓冲液，分别加入下列组分： 上下游引物（10mM)各2. 4yL，12. 2yL超纯水，lyL质粒Puc-L模板。再加入2. 5yL醋酸 镁（280mM)。混合离心后，放入40°C，温育5min。涡旋震荡8-10次，短暂离心，放入40°C， 反应20min。取反应产物2ul放入18ul水中，用酚-氯仿法对DNA进行纯化。1.5%琼脂糖 凝胶电泳检测纯化DNA产物，结果筛选到一组引物，命名为L-rpaF和L-rpaR(图1)。
[0021] 实施例3 :RT-RPA的敏感性
[0022] 将靶基因克隆质粒Puc-AM稀释100倍，再按10倍梯度稀释成10 2-10 9共八个 浓度，以此为模板，进行RT-RPA反应：采用TwistAmpRTexos试剂盒（TwistDx公司，英 国）。取29. 5μL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各 2. 1μL，2. 6μLRPAexo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本 RNA模板。涡旋震荡，短暂离心。再加入2. 5yL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放入Twista 实时荧光检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min。
[0023] 本实验中所建立的RT-RPA方法可以检测下限是15copies/ μ L，具有较好的敏感 性。
[0024] 实施例3 :RT-RPA的特异性
[0025] 以乙型流感、登革热病毒、呼吸道冠状病毒、鼻病毒、呼吸道合胞体病毒核酸为模 板、，用设计的RPA引物和exo探针进行RT-RPA实验。结果对上述毒核酸都没有荧光信号 检出，表明建立的RT-RPA方法具有较好的特异性。。
[0026] 实施例3:临床标本检测
[0027] 收集45份甲型流感病毒临床样本，所有标本都通过细胞培养进行病毒分离。
[0028] (1)病毒RNA提取
[0029] 采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：1.取血清标本100μL，加入含有200ul水 饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g 室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M 醋酸钠约40ul，充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C下，12000g，离心20min。3.弃上清， 加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min。4·弃上清，室温干燥，加入40ulDEPC水溶解 RNA〇
[0030] (2)RT-RPA反应：采用公司的TwistAmpRTexos试剂盒（TwistDx公司，英国）。取 29. 5yL反应缓冲液，分别加入下列组分：引物L-rpaF(lOmM)和L-rpaR(lOmM)各2.lyL， 2. 6μLM-exo探针（10mM)，1μLRNA酶抑制剂（5U)，7. 2μL超纯水，5μL标本RNA模板。 涡旋震荡，短暂离心。再加入2.5yL醋酸镁（280mM)。混合离心后，放入Twista实时荧光 检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min时间为20min。本实验同时设阳性对照和空白阴 性对照组。
[0031] 结果45份临床样本，RT-RPA检测阳性的有30份，阴性15份，结果与病毒分离结 果完全一致。
【主权项】
1. 一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂盒，其特征是试剂盒 由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、Μ片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、Μ片段RPA引物 和exo探针组成，Μ片段RPA引物和exo探针为： M-rpaF, 5'ACCGAGGTCGAAACGTATGTTCTCTCTATCGTTCC3'； M-rpaR, 5'CCAAACAAAAGTGCGAGTGGCACGGGTCACTC3'； M-exo-probe, 5'GGCTCTCATGGAATGGCTAAAGACAAGACCAA[dT-FAM]TC[THF]G[dT-BHQ]CAC CTCTGACTAAGG[3' -block]3'〇2. 根据权利要求1所述一种基于反转录-重组酶多聚酶扩增的甲型流感病毒检测试剂 盒的制备方法，其特征是由以下步骤构成： (1) 病毒核酸提取：采用酚氯仿法提取病毒RNA，具体步骤：取临床鼻咽拭子标本或病 毒培养物核酸100μL，加入含有200ul水饱和酚的1. 5mlEP中，剧烈震荡混匀，静置3min， 加入200ul氯仿，充分震荡混匀，12000g室温离心15分钟；吸取上清液，加入两倍上清体积 的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠35-45ul，充分混匀后-20°C静置2h;取出于4°C 下，12000g，离心20min;弃上清，加入75%乙醇lml，4°C，12000g，离心20min;弃上清，室温 干燥，加入40ulDEPC水溶解RNA，-70°C冰箱放置备用； (2) RT-RPA反应：采用TwistAmp RT exos试剂盒，取29. 5 μ L反应缓冲液，分别加入下 列组分：引物1-1?^卩1〇1111和1^-1?^1?1〇1111各2.141^，2.6 41^1?^61〇探针1〇1111，141^1?熟 酶抑制剂5U，7. 2 μ L超纯水，5 μ L标本RNA模板；涡旋震荡，短暂离心；再加入2. 5 μ L醋酸 镁280mM，混合离心后，放入Twista实时荧光检测仪中，反应温度为40°C，时间为20min。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种甲型流感病毒反转录-重组酶多聚酶扩增(RT-RPA)检测试剂盒及其制备方法。本发明涉及的检测试剂盒由RT-RPA反应体系、RNA酶抑制剂、甲型流感病毒M片段阳性质粒Puc-AM、阴性质控品、M片段RPA引物和exo探针组成。用特异性引物和探针，通过配制RT-RPA反应体系，置入Twista实时荧光检测仪进行实时荧光检测，建立了一种快速、敏感、特异的甲型流感病毒等温实时荧光核酸检测方法。本发明涉及特异性RPA引物和exo探针在甲型流感病毒感染临床鉴别诊断和病毒分离株鉴定中的用途。
【IPC分类】C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105296673
【申请号】CN201510875032
【发明人】祁贤, 宋勇春, 焦永军, 张洪英, 汤奋扬, 鲍倡俊
【申请人】江苏省疾病预防控制中心
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月3日