基于pHrodo分析腺病毒诱导胞内体裂解的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生命科学领域，特别涉及一种基于pHrodo分析腺病毒诱导胞内体裂解的方法。
【背景技术】
[0002]腺病毒对靶细胞的感染过程主要包括如下环节:病毒与细胞表面受体成功结合后，即开始了受体介导的胞吞；病毒被包裹入胞吞小泡中进入细胞，不久胞吞小泡与胞内体(endosome)融合，病毒随即进入胞内体(Intracellular trafficking ofadenovirus:many means to many ends.Adv Drug Delivery Rev, 2007, 59(8):810-821.)；胞内体膜上ATP驱动的质子栗将H+栗进胞内体腔中，维持pH值在6左右。腺病毒进入胞内体后，在酸性环境下诱导部分病毒衣壳的解聚，从而引起胞内体膜的裂解，病毒随之进入细胞质(Endocytic recycling.Nat Rev Mol Cell, 2004, 5 (2): 121-132 ；Endocytosis, Phys1l Rev, 1997, 77 (3): 759 - 803.);病毒逃脱进入细胞质后，病毒通过与胞内分子马达蛋白(molecular motors)相互作用从而沿着微管靠近细胞核；病毒衣壳蛋白停留在核孔处，基因组被注入核内完成基因的转录。
[0003]目前关于腺病毒诱导胞内体裂解的研究已成为腺病毒感染途径研究中的热 点(Adenovirus protein VI mediates membrane disrupt1n followingcapsid disassembly.J Virol.2005, 79 (4): 1992-2000 ；Funct1nal Geneticand B1physical Analyses of Membrane Disrupt1n by Human Adenovirus.JVirol.2011,85 (6):2631-2641 ；Spat1temporal Dynamics of Adenovirus MembraneRupture and Endosomal Escape.J Virol.2012, 86 (19): 10821-10828.) 0 由于病毒在胞内体停滞时间比较短暂，使得通过显微镜观察的方法来分析病毒逃脱过程存在困难。目前主要通过sarcin assay来分析病毒裂解胞内体的情况，sarcin为一种核糖体抑制蛋白，可抑制蛋白合成。该方法的原理为细胞在缺乏甲硫氨酸的培养基中培养后，同时加入腺病毒与sarcin，此时sarcin随病毒胞吞进入细胞并到达胞内体，胞内体裂解后进入细胞质中；然后加入35S标记的甲硫氨酸继续培养，病毒裂解胞内体的能力越强，进入细胞质中的sarcin分子越多，被35S标记的蛋白质越少；使用同位素液闪仪测定裂解细胞的放射性读数，通过放射性读数的大小，间接反映出病毒裂解胞内体能力的强弱。此方法存在使用同位素的安全性、规范性、复杂性，不适合在普通的实验室开展。
[0004]pHrodo为一种pH值敏感的荧光染料，仅在酸性环境中能被激发出荧光，在中性的细胞质环境中不发焚光(High-resolut1n intravital imaging reveals thatblood-derived macrophages but not resident microglia facilitate secondaryaxonal dieback in traumatic spinal cord injury.Exp Neurol.2014, 254:109-120 ；Beclin 1 is required for neuron viability and regulates endosome pathwaysvia the UVRAG-VPS34 complex.PLoS Genet.2014，10(10):el004626.)。 目前 5 型腺病毒是最常用的腺病毒载体(Unity and diversity in the human adenovirusesexploiting alternative entry.B1chem J.2010,431(3):321-336 ；The Influenceof Adenovirus Fiber Structure and Funct1n on Vector Development for GeneTherapy.Mol Ther.2005, 12 (3):384-393 ；Adenovirus recruits dynein by anevolut1nary novel mechanism involving direct binding to pH-primed hexon.Viruses.2011, 3 (8): 1417-1431.)。目前基于同位素标记的sarcin assay是分析腺病毒裂解胞内体的主要方法。因其基于使用同位素标记的安全性及繁琐性，需要进一步寻找更为方便、安全、有效的实验方法。
【发明内容】
[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于pHrodo分析腺病毒诱导胞内体裂解的方法。
[0006]本发明的目的通过下述技术方案实现:
[0007]—种基于pHrodo分析腺病毒诱导胞内体裂解的方法，包括如下步骤:
[0008]将腺病毒与荧光染料pHrodo同时加入细胞中进行感染，然后分析胞内荧光密度值随时间的变化情况。
[0009]所述的腺病毒为腺病毒Ad5 ;
[0010]所述的细胞优选为T淋巴瘤细胞；更优选为Jurkat细胞；其中，细胞的浓度优选为 5X105?IX 10 6个 /mL ；
[0011]所述的焚光染料pHrodo 为 pHrodo Red dextran ；
[0012]所述的焚光染料pHrodo的终浓度优选为50 μ g/mL?100 μ g/mL ;更优选为80 μ g/mL ?100 μ g/mL ；
[0013]所述的感染的孵育时间优选为lOmin?30min ;更优选为lOmin?15min。
[0014]所述的分析为利用激光共聚焦显微镜进行分析。
[0015]本发明的原理是:将腺病毒Ad5与pHrodo Red dextran同时加入细胞，pHrodoRed dextran随病毒胞吞进入细胞并达到胞内体，在胞内体的酸性环境中可被激发出荧光；当病毒裂解胞内体后，pHrodo Red dextran进入到细胞质中，失去发射荧光的能力；病毒裂解胞内体的能力越强，荧光强度比值的下降幅度就越大，分析荧光强度比值的变化情况，即可反映病毒裂解胞内体的情况。
[0016]本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果:
[0017]目前Ad5是基因治疗中最常用的腺病毒载体，其感染细胞的天然受体为柯萨奇受体(Coxsackie receptor，CAR)，可实现对人类多种细胞的高效感染。本实验中选取T淋巴瘤Jurkat细胞，建立基于pHrodo分析腺病毒裂解胞内体的方法。此方法主要包括摸索病毒感染Μ0Ι值、摸索pHrodo工作浓度、摸索pHrodo孵育时间、绘制荧光强度比值随时间变化曲线图四个步骤。
[0018]本实验发现，在高Μ0Ι值(Μ0Ι = 400)时，能实现对靶细胞的有效感染。对于pHrodo工作浓度的摸索，建议分析50 μ g/mL?100 μ g/mL即可，使用太低浓度的pHrodo会导致发射荧光强度太弱而无法观察。考虑到病毒诱导胞内体裂解时间短暂的缘故，对于pHrodo孵育时间的摸索，建议分析病毒感染30min以内的荧光强度以确定最佳的孵育时间。在确定了合适的pHrodo工作浓度及孵育时间后，该方法的关键就是绘制荧光强度比值随时间变化的曲线图。本实验发现，在感染后lOmin至30min之间荧光强度比值出现明显下降(仅为51 % )，而30min至240min的焚光强度比值趋于稳定，表明Ad5诱导Jurkat细胞胞内体裂解的过程发生在病毒感染后的lOmin至30min之间，在感染后30min病毒已完成裂解过程进入到细胞质，这与以往发现的腺病毒逃脱发生在感染后30min以内的实验结果相符合。同时证明了经特异性抑制H+栗活性后，感染后30min荧光强度比值未出现大幅减少(仍为90%)，表明该处理导致病毒裂解胞内体能力下降，大部分病毒仍停留在胞内体中，这些实验结果证明了此方法的可行性。
[0019]综上所述，本文建立了一种基于pH值敏感性荧光染料定性分析病毒裂解胞内体的方法。相比于传统的使用同位素标记的分析方法，此方法具有简单、安全、可操作性强的优点，有望在腺病毒裂解胞内体的研究中发挥重要作用。
【附图说明】
[0020]图1是Ad5-GFP感染Jurkat细胞的效率的结果图；其中，*p < 0.05，#p < 0.01，相对于 MOI = 20，Mean土SD，η = 30
[0021 ] 图2是病毒以M0I值400感染细胞15min后，在不同pHrodo浓度下的荧光强度值；其中，*p < 0.05，N.S.= No significance (无显著性差异)，相对于 50 μ g/mL，Mean±SD，η = 10。
[0022]图3是病毒以MOI值400感染细胞，同时加入终浓度为80 μ g/mL的pHrodo Reddextran，分别孵育5min，lOmin及15min后，激光共聚焦显微镜观察的焚光结果图；其中，*p< 0.05，**p < 0.01，Mean土SD，η = 10。
[0023]图4是病毒以Μ0Ι值400感染细胞，同时加入pHrodo Red dextran终浓度为80 μ g/mL孵育lOmin，经PBS洗涤后再依次于细胞培养箱中继续放置不同时间段(Omin，20min，50min，110min，230min)，以Omin的荧光强度设为100 %，测定不同时间点胞内荧光强度与Omin荧光强度比值的变化情况；其中，*p < 0.05，Mean土SD，η = 10。
【具体实施方式】
[0024]下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
[0025]实施例1
[0026]1.材料与方法
[0027]1.1 材料
[0028]Jurkat细胞(T淋巴瘤细胞株)购买自上海细胞库，293细胞购自美国菌种保藏中心，穿梭载体PDC315、骨架载体购自Microbix公司，无血清1640培养基、胎牛血清、阳离子脂质体购自Gibco公司，pHrodo Red dextran购自Invitrogen公司，032细胞培养箱购自Thermo公司，流式细胞