专利名称：腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建 方法。
背景技术：
腺病毒有三种核心蛋白，分别为pVII、pV和mu。这些核心蛋白与腺病毒基因组DNA 结合，在腺病毒感染细胞后，核心蛋白会随着病毒基因组DNA进入细胞核。因此，如果对腺 病毒的核心蛋白进行荧光蛋白的标记则可以观察到病毒感染细胞的整个过程。由于腺病毒基因组DNA核心蛋白基因区域没有合适的限制性内切酶的位点，因此 通过同源重组的方法对腺病毒核心蛋白进行成功的彻底的遗传标记非常困难。目前研究报 道标记核心蛋白的方法是在不删除腺病毒基因组原有的核心蛋白基因的前提下，在腺病毒 基因组E3区域插入CMV启动子启动的核心蛋白-荧光蛋白基因表达元件，通过这种方法研 究获得了荧光 标记核心蛋白的腺病毒。经过该方法标记的腺病毒基因组同时编码野生型核 心蛋白和荧光标记的核心蛋白，这两种蛋白要竞争结合到腺病毒基因组DNA上，荧光标记 后的核心蛋白由于分子量和蛋白体积变大，很难与野生型核心蛋白竞争，因此荧光蛋白标 记的核心蛋白结合到病毒基因组DNA上的效率很低，这样得到病毒大部分是未经标记或部 分标记的病毒颗粒。
发明内容
本发明所要解决技术问题在于克服上述荧光蛋白标记的核心蛋白结合到病毒基 因组DNA上效率很低的缺点，提供一种能快速、腺病毒核心蛋白完全能够标记的腺病毒核 心蛋白遗传标记载体的构建方法。解决上述技术问题采用的技术方案它是由下述步骤组成1、构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，pUC19质粒载体为 市场上销售的商品，由英国NEB公司生产，获得的阳性克隆命名为PUG19M，采用聚合酶链式 反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载 体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的PUC19M载体，获得向 腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体。2、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体将步骤1中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿 梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获 得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体。3、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋 白上下游序列的PUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；
4、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体将步骤3中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得 标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体。5、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分 离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内-80°C保存。本发明的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游SOObp IOkb DNA序 列的任何载体。本发明的筛选基因包括抗性基因或半乳糖苷酶基因。本发明的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。本发明的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含 有的任何酶切位点。本发明的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种(1)用数均分子量为4000 8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载 体；(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；(3)条件复制型重组腺病毒载体；(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体；本发明的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白ΥΠ或核心蛋白V或核心蛋白X。本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋 白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心 蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100%被荧光蛋白标记 的病毒颗粒。
图1是用于组装核心蛋白pVII上下游同源臂的穿梭质粒载体示意图。图2是核心蛋白pVII上下游同源臂连入穿梭质粒载体后的结构示意图。图3是通过同源重组获得的引入特异SfuI酶切位点的腺病毒骨架载体结构示意 图。图4是核心蛋白pVII被红色荧光蛋白mCherry标记后的腺病毒载体的结构示意 图。图5是核心蛋白pVII被绿色荧光蛋白eGFP标记后的腺病毒载体的结构示意图。图6是核心蛋白pVII被荧光素酶Luciferase标记后的腺病毒载体的结构示意 图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明并不限于这些实施例。实施例1以红色荧光蛋白(mCherry)标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构 建方法步骤如下1、构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入单一酶切位点的穿梭载体通过酶切连接方式将合成的DNA序列连入pUC19质粒载体，pUC19质粒载体为市 场上销售的商品，由英国NEB公司生产，通过质粒提取酶切鉴定以及测序获得阳性克隆，将 阳性克隆命名为PUC19M，载体结构如图1所示，由图1可见，合成的DNA序列包含以下酶切 位点=Xbal-BamHl-SfuI-XhoI-ClaI。以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白DNA序列上下游1500bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA 序列。Ρ1-Ρ4为两对引物的序列
Pl:ATCTAGACATTCCCGCACTGTTGGATGTGGACGCCTAP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATTGCGCCTGCAAGGCCACGGATGCAATT聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5 μ 1，聚合 酶链式反应回收产物4 μ 1，2 X T4DNA快速连接酶缓冲液5 μ 1，T4DNA快速连接酶0. 5 μ 1， 25°C反应1个小时后转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时 后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆。将所获得的阳性克隆 分别命名为 pGEMT/pVII no stop up 和 pGEMT/pVII HRdown。将 pVII no stop up 片段从 pGEMT/pVII no stop up载体上经XbaI和BamHI双酶切下来，经1 %的琼脂糖凝胶电泳回收 后连入同样经XbaI和BamHI酶切过的穿梭载体中。连接条件是4μ 1酶切纯化片段，5 μ 1 2父140嫩连接酶缓冲液，0.5111酶切载体，0.5111 Τ4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方 法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up shuttle。将pVII HR down片段从pGEMT/pVII HR down载体上经XhoI和ClaI双酶切下来，经1 %琼脂糖凝 胶电泳回收后连入同样经XhoI和ClaI双酶切的pUC19M pVII up shuttle载体中。连接 条件是4μ 1酶切纯化片段，5μ 1 2XT4DNA连接酶缓冲液，0. 5μ 1酶切载体，0. 5μ 1 Τ4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为 PUC19M pVII up down shuttle，该载体的结构如图2所示，由图2可见，核心蛋白pVII基 因及其上下游基因序列连入PUC19M载体中。将两端酶切位点为BamHI和SfuI位点的β -半乳糖苷酶基因(LacZa)表达元件 连入经过BamHI和SfuI双酶切的pUC19M-pVII up down shuttle载体，该β -半乳糖苷酶 基因(LacZa)表达元件也可采用氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素等筛选基因中的任意一种 替换。连接条件是4μ1酶切纯化片段，5μ1 2\140嫩连接酶缓冲液，0.541酶切载体， 0.5μ1 Τ4 DNA连接酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为 pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle。2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体将pUC19M-pVII up down/LacZa shuttle 经 XbaI 和 ClaI 双酶切，经 1 %琼脂糖 凝胶电泳回收大片段后与用数均分子量为4000 8000的聚乙二醇化学修饰的重组腺病 毒质粒载体pAd5EB214共转化Bj5183感受态细胞，也可用不经数均分子量为4000 8000 的聚乙二醇化学修饰的重组腺病毒载体，涂布于含有100μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板并 加入50 μ 1的40mg/ml的Χ-gal进行蓝白斑筛选。经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳 性克隆，命名为pAd5EB214/LaCZa ，该腺病毒骨架质粒载体中被引入单一 SfuI的酶切位点， 该载体的结构如图3所示，上述的单一 SfuI的酶切位点，也可采用PacI、SwaI中的任意一 个。由图3可见穿梭载体的pVII up down/LacZaDNA序列与腺病毒骨架质粒同源重组后 将SfuI位点引入腺病毒骨架质粒载体中。3、构建红色荧光蛋白(mCherry)标记核心蛋白pVII穿梭载体根据mCherry基因序列设计一对引物扩增mCherry基因，P1-P2为mCherry基因 扩增引物Pl:AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGP2 TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCAT聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5 μ 1，聚合 酶链式反应回收产物4 μ 1，2 X T4DNA快速连接酶缓冲液5 μ 1，T4DNA快速连接酶0. 5 μ 1， 25°C反应1个小时后转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时 后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/mCherry。将mCherry基因片段从pGEMT/mCherry载体上经BglII和SalI双酶切回收后连 入经BamHI和XhoI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是4 μ 1酶 切纯化片段，5 μ 1 2 X T4DNA连接酶缓冲液，0. 5 μ 1酶切载体，0. 5 μ 1 T4DNA连接酶。连接 产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up down/mCherry shuttle。4、构建红色荧光蛋白mCherry标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体将pUC19M-pVII up down/mCherry shuttle 质粒载体经 ClaI 和 XbaI 双酶切， 经琼脂糖凝胶电泳大片段后与经SfuI线性化的腺病毒骨架载体pAd5 EB214/LacZa 共转化Bj5183，涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB平板并加入50 μ 1的40mg/ml 的X-gal用来蓝白斑筛选。经摇菌、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pAd5 EB214/mCherry，此载体即为红色荧光标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体，该载体的结构 如图4所示，由图4可见，红色荧光蛋白基因mCherry插入在核心蛋白pVII下游，形成 pVII-mCherry 融合蛋白。5、红色荧光蛋白mCherry标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化将PacI线性化的荧光标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体pAd5 EB214/mCherry转染HEK293细胞，7-10天后收获病毒，经过HEK293细胞大量扩增后采用氯化铯密度梯度离 心纯化病毒，获得mCHerry标记核心蛋白的腺病毒Ad5/pVII-mCherry，在冰箱内_80°C内保存。实施例2以绿色荧光蛋白(eGFP)标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构建方 法步骤如下1、腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入单一的酶切位点的穿梭载体
以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白DNA序列上下游800bp的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA 序列。Ρ1-Ρ4为两对引物的序列Pl:ATCTAGACGCGCCCGCCAGCCCCCACCATCACCACCGP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATGAGGCAACCGGGGACGTTTGTGTCTCC聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 1分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。该步骤中的其他步骤与实施例1相同2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例1相同，获得成功引 入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体pAd5EB214/LaCZa。3、构建绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII穿梭载体以绿色荧光蛋白eGFP基因序列为模板设计引物扩增eGFP基因，P1-P2为eGFP基 因扩增引物Pl:AAGATCTGGAGGTGGCGGAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGP2 TGTCGACTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5 μ 1，聚合 酶链式反应回收产物4 μ 1，2 X T4DNA快速连接酶缓冲液5 μ 1，T4DNA快速连接酶0. 5 μ 1， 25°C反应1个小时后转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时 后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/eGFP。将eGFP基因片段从pGEMT/eGFP载体上经BgIII和SalI双酶切回收后连入经 BamHI和XhoI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是4 μ 1酶切纯化 片段，5μ1 2\140嫩连接酶缓冲液，0.5111酶切载体，0.5111 T4DNA连接酶。连接产物采 用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M-pVII up down/ eGFP shuttle。
4、构建绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体的构建过程与实施例1相 同，获得eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体PAd5EB214/eGFP，该载体的结构如图5 所示，由图5可见，绿色荧光蛋白基因eGFP插入在核心蛋白pVII下游，形成pVII-eGFP融
合蛋白ο5、绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化
绿色荧光蛋白eGFP标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化与实施例1相同，最 终获得eGFP标记核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII_eGFP。本实施例中用于标记核心蛋白pVII的绿色荧光蛋白基因eGFP也可用黄色荧光蛋 白基因YFP、蓝色荧光蛋白基因EBFP、青色荧光蛋白基因ECFP等荧光蛋白基因替换。实施例3以荧光素酶Iuciferase标记核心蛋白pVII腺病毒载体的构建过程为例其构建方 法步骤如下1、构建腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3、端引入单一的酶切位点的穿梭载体以腺病毒基因组DNA为模板设计两对引物分别用来扩增用于同源重组的核心蛋 白DNA序列上下游IOkb的DNA序列，上游DNA序列包含腺病毒的核心蛋白ΥΠ本身的DNA序 列。Ρ1-Ρ4为两对引物的序列Pl:ATCTAGAAAGGTCAACGCTGGTGGCTACCTCTCCGCGP2 :TGGATCCACCTCCACCTCCGTTGCGCGGGGGGCGGGTGCGP3 :ACTCGAGATTGCAAGAAAAAACTACTTAGACTCP4 :TATCGATTCGGCGAACGGGCAGTGCCGGCGGCGC聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 10分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。该步骤中的其他步骤与实施例1相同。2、引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体引入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体的构建过程与实施例1相同，获得成功引 入单一的酶切位点的腺病毒骨架载体pAd5EB214/LaCZa。3、构建荧光素酶Iuciferase标记核心蛋白pVII穿梭载体以荧光素酶Iuciferase基因序列为模板设计引物扩增Iuciferase基因，P1-P2为 Iuciferase基因扩增引物Pl:AAGATCTATGGAAGACGCCAAAAACATAAAGAAAGGP2 :TTCTAGATTACACGGCGATCTTTCCGCCCTTCTTGG聚合酶链式反应的条件是94°C 30秒，98°C 10秒55°C 5秒72°C 2分钟，30个循 环。聚合酶链式反应扩增产物经质量浓度为的琼脂糖凝胶电泳后回收片段。将回收的 聚合酶链式反应产物与pGEMT-easy载体连接。连接条件为pGEMT-eaSy载体0. 5 μ 1，聚合 酶链式反应回收产物4 μ 1，2 X T4DNA快速连接酶缓冲液5 μ 1，T4DNA快速连接酶0. 5 μ 1， 25°C反应1个小时后转化感受态的DH5 α细胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的 LB平板中。挑取菌落接种到含有100 μ g/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，14 16小时后，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆。将所获得阳性克隆命名为 pGEMT/luciferase。将Iuciferase基因片段从pGEMT/luciferase载体上经BglII和XbaI双酶切回 收后连入经BamHI和XhaI双酶切的pUC19M pVII up down shuttle载体中。连接条件是 4μ 1酶切纯化片段，5μ 1 2\140嫩连接酶缓冲液，0.5111酶切载体，0.5111 T4DNA连接 酶。连接产物采用同样的方法转化、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pUC19M pVII up down/luciferase shuttle。4、构建荧光素酶luciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体荧光素酶Iuciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体的构建过程与实施例1 相同，获得Iuciferase标记核心蛋白pVII腺病毒质粒载体pAd5EB214/luciferase，该载 体的结构如图6所示，由图6可见，荧光素酶基因Iuciferasw插入在核心蛋白pVII下游， 形成pVII-luciferase融合蛋白。5、荧光素酶Iuciferase标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化荧光素酶Iuciferase标记核心蛋白pVII腺病毒的包装及纯化与实施例1相同， 获得Iuciferase标记核心蛋白pVII的腺病毒Ad5/pVII_luciferase。实施例4在以上的实施例1 3的步骤1中，所用的pVII no stop up片段用pVno stop up片段替换，pVIIHR down片段用pV HR down片段替换，pGEMT/pVII HR down载体用 pGEMT/pV HR down载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤2中，所用的 pUC19M-pVII up down/LacZashuttle 用 pUC19M-pV up down/LacZa shuttle 替换，该步骤 的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤3中，所用的pUC19MpVII up down shuttle载体 用pUC19M-pV up down shuttle载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤 4 中，所用的 pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle 质粒载体用 pUC 19M-pV up down/ mCherry shuttle质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤5中，所 用的PVII腺病毒质粒载体用pV腺病毒质粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例 相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。实施例5在以上的实施例1 3的步骤1中，所用的pVIIno stop up片段用pXno stop up片段替换，pVIIHR down片段用ρΧ HR down片段替换，pGEMT/pVII HR down载体用 pGEMT/pX HR down载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤2中，所用的 pUC19M-pVII up down/LacZashuttle用pUC 19M_pX up down/LacZa shuttle替换，该步骤的其他步骤与相应 的实施例相同。在步骤3中，所用的pUC19M-pVII up down shuttle载体用pUC19M_pX up down shuttle载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤4中，所用的pUC 19M-pVII up down/mCherry shuttle质粒载体用 pUC19M_pX up down/mCherry shuttle质 粒载体替换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。在步骤5中，所用的pVII腺病毒质 粒载体用PX腺病毒质粒载体替 换，该步骤的其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒 核心蛋白遗传标记载体。实施例6
在以上的实施例1 5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000 8000的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的 重组腺病毒载体替换。其他步骤与相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载 体。实施例7在以上的实施例1 5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000 8000的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用条件复制型重组腺病毒载体替换。其他步骤与 相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。实施例8在以上的实施例1 5的步骤2中，所用的经数均分子 量为4000 8000的聚乙 二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带2个治疗基因的条件复制型重组腺病毒 载体替换，也可用携带1个小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与 相应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。实施例9在以上的实施例1 5的步骤2中，所用的经数均分子量为4000 8000的聚乙
二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体用携带1个治疗基因的非复制型重组腺病毒载 体替换，也可用携带2个小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体替换。其他步骤与相 应的实施例相同。构建成腺病毒核心蛋白遗传标记载体。
权利要求
一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于它是由下述步骤组成(1)构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体采用酶切连接的方式将合成的DNA片段连入pUC19质粒载体，获得的阳性克隆命名为pUC19M，采用聚合酶链式反应扩增核心蛋白DNA序列上下游序列，将获得的核心蛋白上下游DNA片段连入pUC19M载体；将含有一个酶切位点的筛选基因连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，获得向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体；(2)引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体将步骤(1)中获得的腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体经双酶切回收后与重组腺病毒载体质粒共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体；(3)构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体采用聚合酶链式反应获得标记基因的DNA序列，将标记基因序列连入含有核心蛋白上下游序列的pUC19M载体，经过鉴定获得标记基因标记核心蛋白的穿梭载体；(4)构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体将步骤(3)中获得的标记基因标记核心蛋白的穿梭载体经双酶切回收后与经过线性化的引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体共转化Bj5183感受态细胞，经过鉴定后获得标记基因标记核心蛋白的腺病毒质粒载体；(5)标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化将线性化的标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体转染HEK293细胞，扩增、分离、纯化，得到标记基因标记核心蛋白的腺病毒，在冰箱内 80℃保存。
2.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于所 说的穿梭载体为任何含有核心蛋白开放阅读框上下游SOObp IOkb DNA序列的任何载体。
3.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于所 说的筛选基因包括抗性基因或半乳糖苷酶基因。
4.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于所 说的标记基因包括荧光蛋白基因或荧光素酶基因。
5.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于所 说的核心蛋白DNA序列3’端引入的酶切位点为重组腺病毒载体本身所不含有的任何酶切 位点。
6.按照权利要求1所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于所 说的重组腺病毒载体为下列载体中的任意一种(1)用数均分子量为4000 8000的聚乙二醇化学修饰或不修饰的重组腺病毒载体；(2)腺病毒载体衣壳蛋白的遗传修饰或不修饰的重组腺病毒载体；(3)条件复制型重组腺病毒载体；(4)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的条件复制型的重组腺病毒载体；(5)携带至少一个治疗基因或小干扰RNA的非复制型的重组腺病毒载体。
7.按照权利要求1或2所述的腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，其特征在于 所说的核心蛋白为腺病毒的核心蛋白VD或核心蛋白V或核心蛋白X。全文摘要
一种腺病毒核心蛋白遗传标记载体的构建方法，由构建向腺病毒基因组核心蛋白DNA序列3’端引入一个酶切位点的穿梭载体、引入一个酶切位点的腺病毒骨架载体、构建标记基因标记核心蛋白穿梭载体、构建标记基因标记核心蛋白腺病毒质粒载体、标记基因标记核心蛋白腺病毒的包装及纯化组成。本发明采用一种新的标记腺病毒核心蛋白的方法，该方法实现了对腺病毒核心蛋白真正意义的遗传水平上的荧光标记，这种标记方法删除了腺病毒基因组中的原有的核心蛋白基因，因此采用本发明的方法标记腺病毒核心蛋白，可以获得的100％被荧光蛋白标记的病毒颗粒。
文档编号C12N15/65GK101935671SQ20101021477
公开日2011年1月5日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者夏海滨, 赵俊丽 申请人:陕西师范大学