肿瘤靶向腺病毒复合载体及其制备方法和用图

肿瘤靶向腺病毒复合载体及其制备方法和用图
【专利摘要】本发明涉及肿瘤靶向腺病毒复合载体及其制备方法和用途，属于基因治疗技术领域。本发明所解决的技术问题是提供了一种安全性、靶向性和转染效率均较高的肿瘤靶向腺病毒复合载体。本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体的组成为由三嵌段聚合物PEI?PEG?PEI和PEI?PEG?FA和Ad形成的复合物；其中，PEI为聚乙烯亚胺，PEG为聚乙二醇，FA为叶酸，Ad为腺病毒。
【专利说明】
肿瘤靶向腺病毒复合载体及其制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及肿瘤靶向腺病毒复合载体及其制备方法和用途，属于基因治疗技术领 域。
【背景技术】
[0002] 传统的基因治疗载体一般分为非病毒载体与病毒载体两类，其中应用比较广泛的 是病毒载体。病毒载体能够感染分裂细胞和非分裂细胞，提供长期的基因表达，转染效率较 高，但却具有致病性，靶向性不强等缺点。相比而言，非病毒载体仅转染分裂细胞，转染效率 较低，且受限于体内短暂表达。然而非病毒载体具有较低的毒性和致病性及免疫原性，比较 容易制备和生产。
[0003] 阳离子聚合物为非病毒载体之一，其在运载治疗基因方面具有很大的优势，如安 全无毒、合成方便等，因此是一种比较理想的非病毒载体。通过对它修饰，还可以获得可降 解、细胞靶向等其它优良特性。阳离子聚合物种类繁多，常用的主要有聚乙烯亚胺(PEI)、聚 赖氨酸(PLL)、明胶、壳聚糖(chitosan)等。其中聚乙烯亚胺在现有的阳离子聚合物中被公 认为最有效的基因载体。
[0004]聚乙稀亚胺(polyethylenimine，PEI)作为有机大分子，很早便为人所知，目前研 究也最为广泛。与其它阳离子聚合物相比，PEI能够更有效的保护其复合的核酸，这可能因 为它们有较高的电荷密度。在PEI结构单体(-CH2-CH2-NH2-)中每3个原子含1个氮原子，这 些氮原子在生理条件下可以发生质子化而带上正电荷，能够与DNA分子中带负电的磷酸基 团相互作用，所形成的复合物在较宽的pH范围内都能充当有效的质子海绵（proton sponge)体，具有质子缓冲能力。被PEI负载的DNA通过这种质子海绵效应在传递过程中可以 免受DNA酶或巨噬细胞的降解，从而提高转染效率。
[0005] PEI主要有支状和线状两种结构，其分子量从lOOODa到1600KDa不等。由于在生理 环境下线性PEI中90%的胺基能被质子化，所以无论在体外或者体内环境下线性PEI的转染 效率都要高于枝化PEI。另外PEI具有一定的细胞毒性，这与它较高的电荷密度有关。不同分 子量或异构体的PEI，在体内的毒性及转染效果会有所不同。一般来讲，高分子量的PEI比低 分子量的PEI转染效率更高，然而毒性也更大。而线性PEI在转染时，效果优于枝化PEI，同时 毒性更小。分子量在5KDa-25KDa之间的PEI通常比较适合基因转染，分子量如果继续增加， 则毒性就会变大。
[0006] 理想的非病毒载体基因传递系统一般需要有效到达靶细胞且安全高效的表达，同 时在体循环系统中保持稳定。然而大多数非病毒基因载体的转染效率较低，且容易在生理 环境中聚集，很快从体循环中被清除，因此限制了其应用范围。
[0007] 通过对非病毒载体进行优化，可以提高靶向性及体循环的稳定性、延长作用时间， 从而提高基因传递体系的转染率。例如大多数聚阳离子与DNA的复合物在生理环境下溶解 度小，很容易沉析出来。通过在聚阳离子中引入亲水性链段合成两亲嵌段的共聚物，就可以 很好地解决溶解性和细胞毒性的问题。除此之外，通过对聚合物表面进行靶向化修饰，引入 配体基团，如叶酸、小分子短肽、抗体等，使其与靶向细胞表面富含的受体能够相互选择并 且特异性结合，将药物更准确地送到病灶器官，在保证治疗效果的前提下就可以减少给药 剂量，从而避免人体内的许多不良反应。
[0008] 在非病毒载体的优化中，目前人们对PEI改性研究比较多。由于PEI毒性较大，本身 又不具有生物降解性，因此科学家们积极探索在降低PEI毒性的同时又尽可能提高它的转 染效率。目前报道的主要有以下两种改性策略。第一种改性方法是在PEI上共价连接一种亲 水的、具有生物相容性的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，也就是将PEI聚乙二醇化(PEGylated)。 PEG具有高度的亲水性和良好的生物相容性，在PEG链端还可以引入其它功能基团，结果表 明，通过聚乙二醇的修饰，一方面降低了细胞毒性，防止PEI与基因所形成的复合物在生理 条件下聚集，提高了在血液中的稳定性，同时还延长了血液循环时间，使PEG成为广泛应用 的亲水改性成分。另一种改性策略是对PEI直接进行化学修饰，在PEI材料上连接配体基团， 让配体与相对应的受体细胞有特异性的靶向结合，提高其基因转染效率。
[0009] 腺病毒(Ad)是目前最常用的病毒载体，它是无包膜DNA病毒，基因组为36kb长的线 状双链DNA。病毒颗粒为二十面体，表面的壳膜由252个壳粒组成。腺病毒存在于许多禽类和 哺乳动物中，在自然界分布广泛。自1953年第一次分离到腺病毒，迄今为止已分离到100种 以上不同血清型的腺病毒，其中人的腺病毒有50种以上。
[0010] 腺病毒载体起源于20世纪60年代初，主要通过去除腺病毒基因组的某些区域而获 得，目前已发展到第三代载体，但是临床和科研中应用的主要是第一代腺病毒载体。2型 (Ad2)和5型(Ad5)腺病毒对人类致病性较小，是目前常用的载体。
[0011]以腺病毒为基础构建的基因传递系统，主要治疗心血管病、遗传病、肿瘤等疾病， 具体而言有以下优点：（1)高水平的基因表达，可以在杀死肿瘤细胞后迅速降解，从而减少 外源基因引起的不良免疫反应；（2)宿主范围广，可以在肝脏、骨骼肌、心脏、脑、肺、胰腺和 肿瘤组织中表达；（3)人类是腺病毒的天然宿主，腺病毒载体对人体致病性低，可以快速感 染大多数人体细胞，所以比较安全；（4)容易获得高滴度，在体外稳定，易于制备与纯化。（5) 装载容量大。在基因治疗中大多采用缺失E1和E3基因区的腺病毒载体，比逆转录病毒和腺 相关病毒的容量大很多，可容纳约8.5kb的外源基因。
[0012] 腺病毒存在一些不足，限制了其应用和发展。主要表现在：1、缺乏特异性，它几乎 可以感染所有的细胞，因此在感染靶细胞时，可能造成非靶细胞的感染。如果治疗基因超表 达，那么就存在潜在的副作用；2、表达时间短暂，因腺病毒不能整合到宿主染色体上，所以 很快被机体的网状内皮细胞吞噬，不能持续表达所需产物，需重复给予;3、可能会刺激机体 免疫反应，引起中和抗体产生，重复给药的效果会逐渐降低。
[0013] 由于介导腺病毒吸附的柯萨奇一腺病毒受体在正常组织中分布较为广泛，而在大 多数肿瘤组织中却低表达，因而腺病毒载体易引发人体免疫反应、缺乏宿主靶向性等不足。 近年来，关于腺病毒载体进行改造或修饰已成为备受关注的研究热点。
[0014] 关于腺病毒外壳的改造：（1)由于纤毛上的头部蛋白负责识别和结合靶细胞的特 异受体，因此纤毛在腺病毒感染细胞过程中起关键作用。研究人员针对腺病毒纤毛进行改 造的策略主要是:在纤毛上连接特异靶向肿瘤的蛋白和对不同亚属的腺病毒进行纤毛嵌合 改造。（2)六邻体的改造:据调查大多数人具有5型腺病毒感染史，因此体内存在大量5型腺 病毒抗体，这样就很容易被人体的抗体免疫中和，使得最终到达肿瘤的病毒量很少，影响治 疗效果。于是有研究人员通过使用化学修饰剂掩盖六邻体或者改造5型腺病毒的六邻体，从 而改变5型腺病毒的免疫性。其中外在修饰最成功的是使用无免疫原性、无毒性、水溶性强 的聚乙二醇(PEG)对腺病毒共价修饰。
[0015] 关于腺病毒基因组的改造:腺病毒对肿瘤的杀伤性主要包括两个方面:腺病毒自 身对肿瘤细胞的杀伤性;腺病毒携带的外源基因的杀伤作用。因此一方面通过提高腺病毒 对肿瘤的靶向性来提高对肿瘤细胞杀伤的准确性，减少腺病毒对正常细胞的伤害，另一方 面可选择合适的外源基因以及提高外源基因的表达量，增强腺病毒的杀伤效果。
[0016] 病毒载体用于基因治疗主要存在安全性和靶向性问题，它容易引发机体的免疫反 应，尤其是安全性低使得病毒载体在实际应用中受到限制。另一方面，随着人们对病毒载体 的研究不断深入，结合疾病特点以及靶组织或靶细胞的特性选择相应病毒载体会显得尤为 重要。因此研究并探索病毒基因载体的改性，使病毒载体一方面保持其自身较高的转染效 率，同时又能克服细胞毒性和免疫原性缺点，也就是同时具备病毒载体与非病毒载体的各 自优势将具有十分重要的应用价值。沿着这条思路，将病毒载体与合成材料结合起来已经 获得了一些探索和发展。例如有实验者将逆转录病毒和聚合物如聚乙烯亚胺、聚赖氨酸等 结合起来。还有些研究者用PEG对腺病毒表面进行聚乙二醇化或者修饰，使得传递载体的性 能有所提高。然而，上述报道主要是单方面提高病毒载体的安全性、靶向性或转染效率，未 见有能用于基因治疗的安全性、靶向性和转染效率均较高的病毒载体的相关报道。

【发明内容】

[0017] 本发明所要解决的技术问题是提供一种安全性、靶向性和转染效率均较高的肿瘤 靶向腺病毒复合载体。
[0018] 本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体的组成为由三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA和Ad形成的复合物；其中，PEI为聚乙烯亚胺，PEG为聚乙二醇，FA为叶酸，Ad为腺病 毒。
[0019] 其中，上述的PEI和PEG可以采用常用分子量的PEI和PEG，考虑到安全性更好，以及 为了提高基因转染效率，上述的PEI分子量优选为2500~8500，上述的PEI分子量更优选为 2800，PEG分子量优选为2000。
[0020] 进一步的，上述的腺病毒优选为2型腺病毒或5型腺病毒;上述的腺病毒更优选为5 型腺病毒
[0021] 其中，上述的PEI可以为枝状或线状，为了提高转染效率，上述的PEI优选为线状 PEI。
[0022] 进一步的，上述的腺病毒优选为肿瘤靶向启动子控制复制缺陷型腺病毒，上述的 腺病毒更优选为缺失E1和E3基因区的腺病毒。
[0023] 其中，为了提高复合载体的转染效率，上述肿瘤靶向腺病毒复合载体中的PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比优选为1:2~6;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad 颗粒的摩尔比优选为1 X 1〇3~2 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的 摩尔比更优选为1.5 X 103~1.5 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的 摩尔比最优选为1.5X103:1。
[0024] 进一步的，当PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比为1:4时，复合载体的转染效率 最高。
[0025] 其中，表面电位、粒径是决定复合载体被细胞吸收的两个关键因素。一般来说，复 合物的正电性与细胞膜的负电性之间存在非特异性的正负电相互作用，所以较高表面电位 有利于复合载体进入细胞，但是过高正电性对细胞有较强的毒性;另外较小的粒径有利于 细胞内吞。综上，选择相对较小粒径、表面电荷适量的复合载体，可以更好地被细胞吸收，从 而提尚基因转染效率。考虑表面电位、粒径的影响，为了进一步提尚复合载体的转染效率， 本发明优选如下技术方案：
[0026] 当PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度为0.02~0.6mg/ml，复合 载体中的PEI-PEG-FA浓度为0.08~2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度为10 9~10nPFU;当 PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度更优选为0.6mg/ml，复合载体中的 PEI-PEG-FA浓度更优选为2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度更优选为10nPFU。
[0027] 本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其含有上述肿瘤靶向腺病毒复合载体。
[0028] 另外，本发明还提供了上述肿瘤靶向腺病毒复合载体在制备治疗抗肿瘤药物中的 用途。
[0029] 本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体，其制备方法包括如下步骤：
[0030] a、用稀释液将PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分别稀释至浓度为0.05~5mg/ml，然后 通过0 · 22um孔径的过滤器进行过滤；
[0031] b、用稀释液将腺病毒稀释至滴度为0.5 X 101Q~1 X 10nPFU;
[0032] c、将a步骤过滤后的PE I -PEG-PEI液与PE I -PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒 溶液中，混匀，在室温条件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合载体；
[0033]其中，所述的稀释液为PBS液、去离子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀释液优选为 PBS 液。
[0034] 其中，上述方法中的PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA可以采用常规方法制备得到或采 用市售产品。为了提高减少或避免副产物的生成，从而提高产品纯度，上述的的PEI-PEG-PEI优选采用下述方法制备得到：
[0035] 1)、合成 Ts〇-PEG-〇Ts
[0036] 以Et3N和CHC13为溶剂，使PEG与TsCl在室温条件下进行对甲苯磺酰化，反应时间为 0.5-2h;反应后的产物加入CHC13使其溶解，然后加入去离子水，静置分层，下层有机相溶液 用饱和NaCl溶液再进行萃取，萃取结束后蒸掉多余CHC1 3溶剂;将乙醚溶液缓慢滴入上述萃 取液中，然后静置分层，将下层乳浊液进行离心分离，制得TsO-PEG-OTs;
[0037] 该条件下进行对甲苯磺酰化可以避免反应剧烈发生危险，更为重要的是能提高 TsO-PEG-OTs 的纯度。
[0038] 2)合成 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0039] 以阳离子聚合物2-乙基-2-恶唑啉(EtOZO)为底物，Ts〇-PEG-〇Ts作为引发剂，在惰 性气体保护条件下，以乙腈为溶剂，于65-75Γ反应65-75h;反应完成后蒸掉多余的乙腈溶 剂，然后用三氯甲烷溶解产物，再将产物缓慢滴入乙醚中，静置分层，下层沉淀物离心，制得 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0；
[0040] 3)水解
[0041 ] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0在10%盐酸溶液、100°C、惰性气体保护条件下水解16小时，然 后将水解后的混合物pH值调至12.5，析出沉淀，离心分离沉淀即得PEI-PEG-PEI。
[0042]其中，上述的惰性气体为不参加反应的气体，如:氮气、氦气、氩气等，从成本考虑， 优选氮气。
[0043]进一步的，上述制备肿瘤靶向腺病毒复合载体的方法，其步骤1)中PEG、TsCl和 Et3N的摩尔比为1:2~4:3~5。PEG、TsCl和Et3N的摩尔比优选为l :3:4。CHCl3作溶剂，可适当 过量。
[0044] 本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体，其中的PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI可以通过一 侧的PEI静电作用包裹在腺病毒表面，既保持了小分子量线性PEI特有的低毒性，同时通过 叶酸连接PEG能够进一步降低载体的毒性，并且叶酸又具有肿瘤分子靶向作用，大幅提高了 转染效率(PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI物理吸附腺病毒载体模式如图26所示）。聚合物包裹 在腺病毒表面，一方面通过EPR效应能够提高腺病毒在肿瘤组织的累积量，另一方面具有较 低的肝脏摄取率，从而提高了载体的安全性。本发明为肿瘤基因治疗提供了一种新的复合 载体，该复合载体具有安全性、靶向性和转染效率均较高的特点，具有广阔的应用前景。
【附图说明】
[0045] 附图1为聚乙二醇对甲苯磺酸酯核磁表征(⑶Cl3)图；
[0046] 附图 2为PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的核磁谱表征（CDC13)图；
[0047] 附图 3 为 PEI-PEG-PEI 核磁表征（DMS0-d6)图；
[0048] 附图 4 为 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0(4900-2000-4900)的红外光谱图；
[0049] 附图 5 为 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0(8100-2000-8100)的红外光谱图；
[0050] 附图 6 为 PEI-PEG-PEI (4900-2000-4900)与 PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)红外光 谱图对照；
[0051 ] 附图7为FA-PEG-OH的合成路线图；
[0052] 附图8为FA-PEG-C00H的合成路线图；
[0053] 附图9为FA-PEG-PEI的合成路线图；
[0054] 附图10为PEI-PEG-FA核磁表征(D20)图；
[0055] 附图11为三组不同浓度的复合物粒径图；A组为Ad/PEI-PEG-PEI( 2800-2000-2800)，B组为Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)，C组为Ad/PEI-PEG-FA;
[0056] 附图12为裸腺病毒粒径和电位图；
[0057]附图13为三组不同浓度的复合物电位图；
[0058] A组为Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)，B组为Ad/PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)，C组为Ad/PEI-PEG-FA;
[0059] 附图 14为裸Ad及Ad复合物SEM图（a:裸病毒，b:Ad/PEI-PEG-PEI);
[0060] 附图 15为裸Ad及Ad复合物TEM图（a:裸病毒，b:Ad/PEI-PEG-PEI);
[0061] 附图16为腺病毒感染宿主细胞原理图；
[0062]附图17为SK-0V-3细胞在不同Μ0Ι下的荧光图片（图片从左到右的Μ0Ι值分别为0、 10、100、1000;
[0063]附图18为KB细胞在不同Μ0Ι下的荧光图片（图片从左到右的Μ0Ι值分别为0、10、 100、1000;
[0064] 附图19为KB细胞荧光图片，图中A1、B1、C1是用含叶酸的培养基筛选的KB细胞，其 中 A1: Ad; B1: Ad/PE I -PEG-PEI /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1); C1: Ad/PE I -PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEi-peg-PEi/npEi-peg-「△=1/4)42、82、02是用不含叶酸的培养基筛选的仙细 胞，其中A2 :Ad;B2:Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEI-PEG-PEI/npEI-PEG-FA=l/l)C2 :Ad/PEI-PEG-PEI /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /4)，D1: Ad/PE I -PEG-FA · D2: Ad/PE I -PEG-PEI；
[0065] 附图20为为SK-0V-3细胞荧光图片；
[0066] A1、B1、C1是用含叶酸的培养基筛选的SK-0V-3细胞，其中Al:Ad;
[0067] B1: Ad/PE I -PEG-PE I /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1)
[0068] Cl ： Ad/PE I-PEG-PE I/PE I-PEG-FA (npEi-PEG-PEi/npEi-PEG-FA= 1/4),
[0069] A2、B2、C2是用不含叶酸的培养基筛选的SK-0V-3细胞，其中A2: Ad;
[0070] B2: Ad/PE I -PEG-PE I /PE I -PEG-FA (npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa = 1 /1)
[0071] C2: Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA(npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa= 1/4)
[0072] D1:Ad/PEI-PEG-FA·D2:Ad/PEI-PEG-PEI;
[0073] 附图21为不同ELISA方法的作用原理图；
[0074] 附图22为小鼠 IgG标准曲线图；
[0075] 附图23为小鼠血清免疫球蛋白浓度图；
[0076]附图24为KB细胞荧光图片；
[0077] A:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀释20倍；
[0078] B:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀释40倍；
[0079] C:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀释20倍；
[0080] D:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀释40倍；
[0081 ] 附图25为SK-0V-3细胞荧光图；
[0082] A:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀释20倍；
[0083 ] B:注射裸腺病毒的小鼠血清，其中血清稀释40倍；
[0084] C:注射Ad/PE I -PEG-PE I /PE I-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀释20倍；
[0085] D:注射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清，其中血清稀释40倍；
[0086] 图26为PEI-PEG-FA和PEI-PEG-PEI物理吸附腺病毒载体模式图；
[0087]图27为肿瘤抑制实验结果图。
【具体实施方式】
[0088]本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体的组成为由三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA和Ad形成的复合物；其中，PEI为聚乙烯亚胺，PEG为聚乙二醇，FA为叶酸，Ad为腺病 毒。
[0089] 其中，上述的PEI和PEG可以采用常用分子量的PEI和PEG，考虑到安全性更好，以及 为了提高基因转染效率，上述的PEI分子量优选为2500~8500，上述的PEI分子量更优选为 2800，PEG分子量优选为2000。
[0090]进一步的，上述的腺病毒优选为2型腺病毒或5型腺病毒;上述的腺病毒更优选为5 型腺病毒
[0091] 其中，上述的PEI可以为枝状或线状，为了提高转染效率，上述的PEI优选为线状 PEI。
[0092] 进一步的，上述的腺病毒优选为肿瘤靶向启动子控制复制缺陷型腺病毒，上述的 腺病毒更优选为缺失E1和E3基因区的腺病毒。
[0093]其中，为了提高复合载体的转染效率，上述肿瘤靶向腺病毒复合载体中的PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比优选为1:2~6;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad 颗粒的摩尔比优选为1 X 1〇3~2 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的 摩尔比更优选为1.5 X 103~1.5 X 105:1 ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的 摩尔比最优选为1.5X103:1。
[0094] 进一步的，当PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比为1:4时，复合载体的转染效率 最高。
[0095] 其中，表面电位、粒径是决定复合载体被细胞吸收的两个关键因素。一般来说，复 合物的正电性与细胞膜的负电性之间存在非特异性的正负电相互作用，所以较高表面电位 有利于复合载体进入细胞，但是过高正电性对细胞有较强的毒性;另外较小的粒径有利于 细胞内吞。综上，选择相对较小粒径、表面电荷适量的复合载体，可以更好地被细胞吸收，从 而提尚基因转染效率。考虑表面电位、粒径的影响，为了进一步提尚复合载体的转染效率， 本发明优选如下技术方案：
[0096] 当PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度为0.02~0.6mg/ml，复合 载体中的PEI-PEG-FA浓度为0.08~2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度为10 9~10nPFU;当 PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度更优选为0.6mg/ml，复合载体中的 PEI-PEG-FA浓度更优选为2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度更优选为10nPFU。
[0097] 本发明还提供了一种抗肿瘤药物，其含有上述肿瘤靶向腺病毒复合载体。
[0098] 另外，本发明还提供了上述肿瘤靶向腺病毒复合载体在制备治疗抗肿瘤药物中的 用途。
[0099] 本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体，其制备方法包括如下步骤：
[0100] a、用稀释液将PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分别稀释至浓度为0.05~5mg/ml，然后 通过0 · 22um孔径的过滤器进行过滤；
[0101] b、用稀释液将腺病毒稀释至滴度为0.5X101Q~lX10nPFU;
[0102] c、将a步骤过滤后的PE I -PEG-PEI液与PE I -PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒 溶液中，混匀，在室温条件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合载体；
[0103] 其中，所述的稀释液为PBS液、去离子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀释液优选为 PBS 液。
[0104] 其中，上述方法中的PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA可以采用常规方法制备得到或采 用市售产品。为了提高减少或避免副产物的生成，从而提高产品纯度，上述的的PEI-PEG-PEI优选采用下述方法制备得到：
[0105] 1)、合成 Ts〇-PEG-〇Ts
[0106] 以Et3N和CHC13为溶剂，使PEG与TsCl在室温条件下进行对甲苯磺酰化，反应时间为 0.5-2h;反应后的产物加入CHC13使其溶解，然后加入去离子水，静置分层，下层有机相溶液 用饱和NaCl溶液再进行萃取，萃取结束后蒸掉多余CHC1 3溶剂;将乙醚溶液缓慢滴入上述萃 取液中，然后静置分层，将下层乳浊液进行离心分离，制得TsO-PEG-OTs;
[0107] 该条件下进行对甲苯磺酰化可以避免反应剧烈发生危险，更为重要的是能提高 TsO-PEG-OTs 的纯度。
[0108] 2)合成 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0109] 以阳离子聚合物2-乙基-2-恶唑啉(EtOZO)为底物，Ts〇-PEG-〇Ts作为引发剂，在惰 性气体保护条件下，以乙腈为溶剂，于65-75Γ反应65-75h;反应完成后蒸掉多余的乙腈溶 剂，然后用三氯甲烷溶解产物，再将产物缓慢滴入乙醚中，静置分层，下层沉淀物离心，制得 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0；
[0110] 3)水解
[0111] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0在10%盐酸溶液、100°C、惰性气体保护条件下水解16小时，然 后将水解后的混合物pH值调至12.5，析出沉淀，离心分离沉淀即得PEI-PEG-PEI。
[0112] 其中，上述的惰性气体为不参加反应的气体，如:氮气、氦气、氩气等，从成本考虑， 优选氮气。
[0113] 进一步的，上述制备肿瘤靶向腺病毒复合载体的方法，其步骤1)中PEG、TsCl和 Et3N的摩尔比为1:2~4:3~5。PEG、TsCl和Et3N的摩尔比优选为l :3:4。CHCl3作溶剂，可适当 过量。
[0114] 下面结合实施例对本发明的【具体实施方式】做进一步的描述，并不因此将本发明限 制在所述的实施例范围之中。
[0115] 试验例1三嵌段聚合物PEI-PEG-PEI的合成
[0116] 1、试剂
L0121」3、合成方法
[0122] 3.1制备 Ts〇-PEG-〇Ts
[0123] 3.1.1PEG 的除水
[0124] 称取PEG(3.6g，1.8mmol)于50ml圆底烧瓶中，用电吹风进行适当加热，让上层固体 部分溶解，以防止后面加热时向瓶口冲。设置电加热器温度为ll〇°C，烧瓶内的温度为60°C， 在加热烧瓶的同时抽真空、通氮气约2h。关闭时，先通氮气，然后抽吸气交替进行三次后关 掉阀门。实验室所用的氮气在预处理中已除去微量的氧气和水。
[0125] 3.1.2蒸馏三乙胺溶液
[0126] 在50ml圆底蒸馏瓶中倒入三乙胺溶液5ml，加入两勺氢化钙固体后连接回流冷凝 管和温度计，最上端口通入保护气体氮气。蒸馏瓶内温度设为110°c，电加热器的温度设为 150°C，回流大约3h后开始蒸馏，弃去初馏分，收集纯度更高的三乙胺。
[0127] 3.1.3反应过程
[0128] (1)在第一个反应瓶中加入1.03g对甲苯磺酰氯(TsCl)，用6ml三氯甲烷溶解后，让 其充分搅拌lh。
[0129] (2)称取3.6g PEG于第二个反应瓶中，然后加入lml三乙胺溶液以及7.2ml三氯甲 烷溶剂，将其充分搅拌约lh。
[0130] (3)将第二个反应瓶于室温条件下，在通他的情况下，缓慢将第一个反应瓶中的所 有溶液加入到PEG中，反应进行lh。
[0131] (4)反应后处理
[0132] ①萃取
[0133] 在上述所得产物中，加入一定量的三氯甲烷(体积为样品溶液的30%_50%)，让其 充分溶解混合，然后转移到分液漏斗中，同时加入去离子水，静置分层。最后将下层有机相 溶液转移到分液漏斗中，用饱和NaCl溶液再进行萃取，步骤同上。萃取结束后在旋转蒸发仪 上蒸掉多余三氯甲烷溶剂。
[0134] ②过滤
[0135] 将60ml乙醚倒入烧杯后开启磁力搅拌器，用滴管缓慢滴入上述萃取液，同时观察 产生沉淀情况，若为絮状物，则说明溶液浓度适宜，将浓缩液全部滴完。关闭搅拌器，静置分 层后，将下层乳浊液转移到离心管中进行离心分离，转速设为4000r/min，时间为5min。最后 将所得样品进行抽真空，干燥保存。
[0136] 3·2制备PEt0Z0-PEG-PEt0Z0
[0137] 3.2.1蒸馏 2-乙基-2-恶唑啉(EtOZO)
[0138] 反应瓶中加入2-乙基-2-恶唑啉、2勺氢化钙固体，通入保护气体N2，开启搅拌，进 行除水4h，不加热以防止聚合。然后进行常压蒸馏，反应瓶内温度设定在160°C(2-乙基-2-恶唑啉沸点为128 °C)，电加热器温度为210°C。大约4h后蒸馏开始，将前馏分5-6滴弃掉后得 到纯度更高的产物。
[0139] 3.2.2反应过程
[0140] 首先将反应体系进行无水无氧处理，用加热枪加热反应装置同时对反应体系抽真 空、通氮气，重复三次。将乙腈溶剂用氢化钙进行除水。将〇.2184g聚乙二醇对甲苯磺酸酯 (Ts〇-PEG-〇Ts)以及0 · 993ml 2-乙基-2-恶唑啉加入到两 口瓶中（η(Ε?_)/η(Τ3〇-peg-QTs) = 104/ 1)，待溶解完全后再加入l〇ml乙腈溶剂。开启循环水，油浴温度设为70°C，反应过程中通小 量他保证史兰克双排管内有足够正压，反应进行3天。
[0141] 3.2.3反应后处理
[0142] 首先在旋转蒸发仪上蒸掉多余的乙腈溶剂，然后用一定量的三氯甲烷溶解产物。 在烧杯内倒入过量的冰乙醚，将产物缓慢滴入乙醚中，观察出现的是絮状物时，将其全部滴 加完毕。静置分层，将下层沉淀物转移到离心管中进行离心。最后将所得产物抽真空4h。
[0143] 3·3制备PEI-PEG-PEI
[0144] 称取1.05g PMeOZO-PEG-PMeOZO加入到圆底烧瓶中，安装反应装置并对其进行无 水无氧处理，抽真空、通氮气重复3次。氮气保护下加入6ml盐酸溶液（10wt%)，接上回流冷 凝管和温度计，在l〇〇°C通氮气条件下回流12h。
[0145] 反应结束待产物冷却后，用1M氢氧化钠调节反应产物的PH值，当PH调至11时，混合 物开始变为乳浊液，当调至12.5左右时，观察发生沉淀现象。然后将聚合沉淀物进行高速离 心分离，转速设为l〇〇〇〇r/min，时间8min，取下层沉淀，用去离子水对产物洗涤两次后，再重 复离心分离一次，最后将产物冷冻干燥后得到浅黄色固体粉末。
[0146] 4、结果分析
[0147] 4.1 Ts〇-PEG-〇Ts的合成结果分析
[0148] 产物的核磁谱图（如图1所示）显示的信号分别在S2.44(PEG-0S02C 6H4CH3,6H)， 3.63(PEG，180H)，4.16(CH2CH 20S02C6H4CH3，4H)从这几个基峰能够确定对PEG甲苯磺酰化可 以定量得到聚乙二醇对甲苯磺酸酯(TsO-PEG-OTs)，并且本发明方法没有引入其他杂质，产 率达到95 %。
[0149] 4.2 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的合成结果分析
[0150] PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的典型核磁表征（CDC13)如图2所示。其中δ2.00-2.20的共振 态以及δ3.42分别是PEtOZO中的乙基和亚甲基。δ3.64的单峰是PEG中的亚甲基部分。通过对 峰3.42和3.64的氢谱积分面积，可以计算出三嵌段共聚物的分子质量为4900-2000-4900 8/ mo 1，与预期的分子量4500-2000-4500g/mo 1比较接近。
[0151] 4.3 PEt0Z0-PEG-PEt0Z0的合成结果分析
[0152] PEI-PEG-PEI的核磁谱图如图3所示。其中有两个单峰分别在δ2.55和3.60，它们分 别是PEI和PEG的亚甲基，由这两个峰的积分面积可以计算出三嵌段共聚物PEI-PEG-PEI的 相对分子质量是2800-2000-2800g/mol，在δ?.95附近有个非常小的峰，应该是还有部分残 余的乙酰基。根据95和2.55的积分面积可以看出，超过99%的乙酰基被移走，产物的纯 度较高。通过改变mEtozco/mTso-PEG-QTs) = 208/1，用类似的方法还合成出了PEI-PEG-PEI相对 分子质量为8100-2000-8100g/mol。
[0153] 4.4聚合物的表征
[0154] 不同分子量PEtOZO-PEG-PEtOZO红外谱图以及红外对照谱图分别见图4、5、6所示。 在2940cm- 1附近，-CH3和-CH2不对称伸缩振动；1638cm-1附近，酯键中C = 0伸缩振动；1424(^1 附近，C-N伸缩振动；1376CHT1附近，-CH3对称弯曲振动；1195cnf1附近，C-0伸缩振动;750CHT 1 附近，NH2面外摇。红外谱图结果与聚合物的预计结构相一致，且由不同分子量的红外谱图 对照显示，两者特征峰的位置基本相同。
[0155] 试验例2 FA-PEG-PEI的合成
[0156] 1、实验试剂和仪器 叶酸 97% 阿拉丁 羟基琥珀酰亚胺（NHS) 98% 阿拉丁 丁二酸酐（SA) 98% 阿拉丁 二甲亚砜(DMS0) Μ 成都市科龙化工试剂厂 二甲硅油 紐成都市科龙化工试剂厂 氯仿 AR 成都市科龙化工试剂厂
[0157] 二氯甲烷 AR 成都市科龙化工试剂厂 乙醚 AR 成都市科龙化工试剂厂 三乙醇胺(TEA) AR 成都市科龙化工试剂厂 α -羟基-ω-氨基聚乙二醇（Mn=3400) 上海西宝生物科技有限公司 聚乙烯亚胺（PEI Μη=1400) 99% 阿拉丁 N，N-二环己基碳二亚胺(DCC) 99% 阿拉丁 电子天平 PL203 瑞士 METTLER TOLEDO公司 恒温磁力搅拌器 85-2 巩义予华仪器有限公司 集热式恒温加热磁力搅拌器 DF-101S 上海标和仪器有限公司
[0158] 旋转蒸发仪 R206 上海申生科技 核磁共振仪 AM400 瑞士 Bruker公司 旋叶式真空泵 XI)-020 上海南光真空泵厂 冷冻千燥机 \fFD2000 北京博医康公司
[0159 ] 2、α-羟基-ω -叶酸聚乙二醇(FA-PEG-OH)的合成
[0160] 合成路线如图7所示。叶酸的活化:将0.22g叶酸加至50ml的两口瓶中，真空干燥4 小时后，加入20ml无水DMS0,然后依次加入0.12g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，0.21g N，N-二 环己基碳二亚胺(DCC)，避光反应12h，在6000r/min，10min条件下离心，去掉反应的不溶物。
[0161] 将活化的叶酸加入到预先溶有H0-PEG-NH2 (0.86g，Mn = 3.4kDa)的5ml DMS0溶液 中，用三乙胺将反应体系pH值调到8,避光反应24h。反应结束后用透析袋(MWC0=lkDa)在蒸 馏水中透析76h，平均4h换一次蒸馏水，最后经冷冻干燥得黄色粉末状产物:叶酸功能化的 端羟基聚乙二醇(FA-PEG-OH)。
[0162] 3、α-羧基-ω -叶酸聚乙二醇(FA-PEG-C00H)的合成
[0163] 合成路线如图8所示。将FA-PEG-OH(0.50g)加入反应瓶中，真空干燥8h。用20ml三 氯甲烷将其溶解后，再加入〇.125g过量丁二酸酐，70°C搅拌回流反应进行49h。减压除掉过 量溶剂三氯甲烷，然后在蒸馏水中溶解，用透析袋(MWC0= lkDa)透析48h。最后冷冻干燥后 得到白色粉末状产物:FA-PEG-C00H。
[0164] 4、叶酸偶联聚乙二醇接枝聚乙烯亚胺FA-PEG-PEI的合成
[0165] 合成路线如图9所示。FA-PEG-C00H的活化:称取0.10g FA-PEG-C00H加入到50ml的 反应瓶中，加入1 〇ml二氯甲烷（氢化钙除水）将其溶解，然后依次加入0.60g NHS、0.15g DCC，避光反应24h，最后离心去掉反应生成的不溶物。
[0166] 称取0.22g聚乙烯亚胺(PEI)加入两口瓶中，溶解在10ml roS(pH=7.4)中，然后把 已活化的FA-PEG-C00H加入到PEI溶液中，室温下避光反应24h。将反应后的产物在过量蒸馏 水中透析48小时，最后冷冻干燥得到浅黄色粘稠状产物:FA-PEG-PEI。
[0167] 5、产物 FA-PEG-PEI 的表征
[0168] 产物FA-PEG-PEI的核磁表征（D20)如图10所示。其中δ2.40-2.80归属为-012012順-，-〇(0 = 0)0120120)-质子的化学位移的重叠。66.4、7.5及8.6是叶酸分子结构中 苯环质子的化学位移。S3.65为PEG上亚甲基质子的化学位移，由此可以确定目标产物被成 功合成。
[0169] 实施例1 Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合载体的制备
[0170] 1、实验材料
[0171]本实验所用腺病毒购买自汉恒生物科技有限公司，细胞株选用293A细胞。腺病毒 包装系统为两质粒系统，其组成为穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和骨架质粒pBHGlox (delta)El,E3Cre〇
[0172] 2、实验流程及方法
[0173] 由汉恒生物技术公司合成CMV启动子，GFP基因扩增所需引物，选用缺失Ela及Elb 启动子的Ad5腺病毒，在缺失Ela启动子的部位插入经过修饰的CMV启动子，在Ela与Elb之间 插入插入GFP基因，E3保留。制备腺病毒穿梭质粒后，分别对腺病毒穿梭质粒和骨架质粒进 行高纯度无内毒素抽提，通过试剂盒共转染293A细胞，转染6h后将培养基更换为完全培养 基，在四天左右更换一次新鲜培养基，共培养十几天。
[0174] 在病毒收集前，首先要观察病毒空斑是否形成。通常为了更好的形成空斑及限制 病毒扩散，会在培养液中加入一定量的琼脂糖。转染7天左右便可以在显微镜下看到小的空 斑，最后将空斑和琼脂糖一起挑起，放入新鲜培养基中过夜。第二天给含有病毒的培养基中 加入新鲜的293A细胞培养液，进行病毒少量扩增。至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清 液，反复冻融三次后收集病毒，最后以2000rpm离心5分钟，取细胞上清液即为病毒初代原 液。连续三代反复扩增收集病毒后，进行病毒的大量扩增。然后通过CsCl密度梯度离心-透 析联用法纯化病毒，最后进行病毒颗粒数(0PU)的测定，方法如下：
[0175] 以适当倍数对CsCl离心纯化得到的病毒进行稀释，使0D值在0.1-1.0之间，测波长 在260nm下的0D值，估算病毒颗粒数，OPU/ml = 0D26Q X稀释倍数X 1.1 X 1012。由于此种方法 测出的是病毒的物理浓度，没有考虑生物学活性，因此经验上估算PFU/ml =0PU/100。
[0176] 3、Ad/PE I -PEG-PEI /FA 复合物的制备
[0177] 准备不同分子量的聚合物 PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800、8100-2000-8100)以及 PEI-PEG-FA，用roS将其浓度稀释为2mg/ml至0.05mg/ml不等，然后通过0.22um孔径的过滤 器进行过滤。用PBS将腺病毒稀释至滴度为10 1()PFU。将一系列不同浓度的聚合物溶液分别逐 滴加入到等体积的腺病毒溶液中，轻轻地混匀之后，在室温条件下孵育25-30min，带负电的 腺病毒与带正电的聚合物形成静电粒子，分别制得Ad/PEI-PEG-PEI符合载体和Ad/PEI-PEG-FA复合载体。
[0178] 另外，采用上述方法将过滤后的PEI-PEG-PEI液与PEI-PEG-FA液混合，然后滴加入 到的腺病毒溶液中，混匀，在室温条件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合载体。
[0179] 4、复合物的粒径和表面电位测定
[0180] 三元共聚物PEI-PEG-PEI及PEI-PEG-FA与腺病毒所形成的复合物粒径分布及表面 电位使用Zetasizer Nano ZS纳米粒度电位仪(英国Malvern公司）进行测量。在测量之前， 准备200ul的裸病毒溶液及不同浓度的Ad/PEI-PEG-PEI、Ad/PEI-PEG-FA复合物样品（各包 含10ul 101QPFU的Ad)，然后分别溶解在lml的超纯水中。在25°C下进行测量，散射光以90°检 测并在自动加速器上收集。待测样品组分见表1、2、3所示，对于每组样品，取三次测量的平 均值，每次测量保持一分钟间隔进行。检测表面电位时使用专用的微量检测样品池，以提高 检测数据的准确性。复合物粒径和表面电位的测量能够为体外转染研究筛选出最优的聚合 物浓度。
[0181] 表 1 PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)组分
[0182]
[0184] 表2 PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)组分
[0185]
[0186] 表3 PEI-PEG-FA组分
[0187]

[0188] 5、复合物的扫描电子显微镜(SEM)
[0189] 用导电胶将抛光的单晶硅片贴到扫描电镜样品台上，取适量样品稀释至不同浓度 梯度，然后将其滴到硅片上，液体样品烘干后进行扫描电镜分析。工作距离8.4mm、电子束电 压3kv、电子密度1 ΟμΑ、放大倍数10K~50K倍。
[0190] 6、复合物的透射电子显微镜(ΤΕΜ)
[0191] 裸病毒以及Ad5/PEI-PEG-PEI复合物的形貌通过透射电子显微镜(ΤΕΜ)进行观察， 加速电压为20KV。将最优比例的20ul裸病毒溶液及20ul的Ad/PEI-PEG-PEI复合溶液待测样 品（各包含IX l〇9PFU的Ad5)，滴到碳支持膜铜网上，放置10分钟，保证有足够的吸收，然后 在37°C下烘干后检测。应用Image Pro Plus 6.0图像分析软件分析TEM数据。
[0192] 7、结果分析
[0193] 7.1聚合物/Ad复合物的粒径
[0194] 粒子尺寸大小是影响细胞转染效率和运输过程的一个重要因素。粒子被细胞吸收 的效率很大程度上取决于粒径大小。如果基因传递载体的尺寸太大会影响细胞吸收，从而 导致转染效率下降。我们将靶向聚合物(PEI-PEG-FA)及非靶向聚合物PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800、8100-2000-8100)分别以不同浓度复合腺病毒，并对其粒径进行检测，结果如图 11所示。对于A组Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)而言，当聚合物浓度为0.2mg/ml时，它 的粒径最小，为237.97nm。对于B组Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)而言，当聚合物浓度 为0. lmg/ml时，它的最小粒径是520.13nm。对于C组Ad/PEI-PEG-FA，当聚合物PEI-PEG-FA的 浓度为〇. 2mg/ml时，它的最小粒径是355.55nm。裸腺病毒的粒径和电位如图12所示。与裸病 毒粒径(122.16nm)相比，三种复合物粒径均有所增加，且聚合物浓度不同，粒径增加的幅度 也不相同。结果表明，PEI-PEG-PEI以及PEI-PEG-FA均能通过静电作用与腺病毒复合。
[0195] 7.2聚合物/Ad复合物的表面电位
[0196] 将聚合物连接到带负电荷的腺病毒表面会改变复合物表面总的电荷数。裸腺病毒 及复合物(Ad5/PEI-PEG-PEI，Ad5/PEI-PEG-FA)的表面电荷通过纳米粒度电位仪进行测量， 结果如图13所示。随着聚合物浓度的增加，复合物的电位逐渐增大，且由负电逐渐变为正 电。对于三组而言，只有当聚合物的浓度均为0.05mg/ml时，其表面带负电荷，且最小值为-4.323mV。在其他浓度下，复合物的表面电荷均呈现正电，与裸病毒(-17.13mV)表面电位相 比，说明聚合物通过离子键已经固定在腺病毒表面，形成了新型混合载体。
[0197] 表面电位，粒径是决定复合载体被细胞吸收的两个关键因素。一般来说，复合物的 正电性与细胞膜的负电性之间存在非特异性的正负电相互作用，所以较高表面电位有利于 复合载体进入细胞，但是过高正电性对细胞有较强的毒性;另外较小的粒径有利于细胞内 吞。基于以上认识，我们认为选择相对较小粒径、表面电荷适量的复合载体，可以更好地被 细胞吸收，从而提高基因转染效率。
[0198] 结合图11与图12的数据可知，对于Ad/PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)而言，当 PEI-PEG-PEI (2800-2000-2800)的浓度为 0.2mg/ml 时，其粒径为 237.97nm，表面电荷为+ 3.765mV，有着较为理想的粒径和适量表面正电。对于Ad/PEI-PEG-PEI (8100-2000-8100)而 言，当PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)的浓度为0. lmg/ml，其粒径为520.13nm，表面电荷为+ 1.5mV较为适合。对于Ad/PEI-PEG-FA来说，当PEI-PEG-FA的浓度为0.2mg/ml时，它的粒径为 355.55nm，表面电荷为+1.277mV，粒径和表面电位较为合适。因此对于这三种复合物Ad/ PEI-PEG-PEI(2800-2000-2800)，Ad/PEI-PEG-PEI(8100-2000-8100)及Ad/PEI-PEG-FA而 言，我们分别选取浓度为〇. 2mg/ml、0. lmg/ml、0.2mg/ml用于扫描电镜和透射电镜的表征以 及其他各项生物学检测。
[0199] 7.3聚合物/Ad复合物的扫描电镜
[0200] 图14为裸Ad以及Ad复合物在最优聚合物浓度下的SEM图，可以看出裸病毒及Ad复 合物是球状颗粒，体积大小均一且分布较为均匀。
[0201] 7.4聚合物/Ad复合物的透射电镜
[0202]图15显示了裸病毒以及聚合物/Ad复合物在最优比例下的TEM图，裸Ad以及复合物 均显示出有规律的形态，且分布较好。相比裸病毒而言，Ad/PEI-PEG-PEI复合物显示出明显 的包裹结构，这个结果表明聚合物已经通过离子键固定在腺病毒的蛋白表面，形成了包裹 的腺病毒载体。
[0203] 试验例3 Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合物体外活性研究（复合载体中的PEI-PEG-PEI的 分子量为 2800-2000-2800)
[0204] 3.1细胞培养
[0205] 3.1.1试剂 DMEM高糖培养基 Hye.lone 新生胎牛血清（Fetal Rrovine. Serum FES). B：i.o 1 ogical Indust.r.ies 0· 25%胰酶-乙二胺四乙酸（trypsin-EDTA) Gibco
[0206] 青-链霉素混含液 碧云天 二甲亚砜（DMS0) Α0ΚΕ 台盼蓝染色液 Beyotime ELISA 试剂盒 Elabscience
[0207] 卵巢癌细胞SK0V-3、人口腔表皮癌细胞KB均由四川大学华西科技园细胞库赠送。
[0208] 3.1.2主要仪器 仪器 型号 厂家 二氧化碳细胞培养箱 Thermo 311 Thermo scientific 生物安全柜 BSC-1300IIA2 苏净安泰 倒置显微镜 CKX41 Olympus 台式冷冻离心机 Centrifuge5810R Eppendorf 水浴锅 SSW-600 上海博讯 立式压力蒸汽灭菌器 LDZM-80KCS-II 上海申安医疗器械厂
[0209] 电热鼓风千燥箱 GZX-9246MBE 上海博讯 .多功能酶标仪 EPOCH Β?α lek Instrument. 激光共聚焦荧光显微镜 1X83 Olympus 细胞计数板 BD Falcon公司 24孔板 BD Falcon公司 移液枪 KC14091O 德国Eppendorf公司 微型真空泵 GL-802B 海门市其林贝尔仪器制造公司
[0210] 3.1转染效率研究
[0211] 腺病毒感染细胞的过程一般是：1.先结合CAR等细胞表面受体，再结合整合素。2. 内吞作用将腺病毒内化到细胞中并进入溶酶体。3.从溶酶体中释放。4.腺病毒颗粒转位到 细胞核。5.通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内。6.转录，复制，病毒包装在细胞核中进行。 见图16所示。
[0212] 因为不同细胞的感染复数(multiplicity of infection，M0I)不同，所以在病毒 正式感染目的细胞之前，需要先确定目的细胞中加入的病毒数。传统的Μ0Ι概念起源于噬菌 体感染细菌的研究，其含义是感染时噬菌体与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染 噬菌体的数量。噬菌体的数量单位为pfu。一般认为Μ0Ι是个比值，没有单位，其实隐含的单 位是pfu number/cell。后来Μ0Ι被普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与 细胞数量的比值。
[0213] 然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使Μ0Ι产生了不同的含义。能 产生细胞裂解效应的病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒等习惯上仍用pfu表示病毒数量，因此其 Μ0Ι的含义与传统的概念相同。而对于某些病毒如AAV病毒，采用活性单位表示病毒数量，如 TU或IU，M0I的含义是指平均每个细胞感染病毒的活性单位数。如果采用病毒颗粒或基因组 数表示病毒数量，如v. P或v. g，Μ0Ι的含义便是指平均每个细胞感染病毒的病毒颗粒或基因 组数。这两种表示方法在数值和含义上都有所不同，因此在使用过程中需要注意Μ0Ι的具体 含义和单位。
[0214] 各病毒载体在感染目的细胞时，实验操作均有所不同，具体情况见表4所示。
[0215]表4各病毒载体感染目的细胞比较
[0216]
[0217] ；3.丄.丄佛疋敢1兀恐栄一見数觀丄
[0218] 本实验所用的细胞株为叶酸受体高表达的SK-0V-3细胞和KB细胞，其中SK-0V-3细 胞用RPMI MEDIUM 1640培养液，加10%胎牛血清(FBS)和1%双抗(青霉素/链霉素），KB细胞 用DMEM培养液，加10%胎牛血清和1 %的双抗，将这两种细胞置37°C、5 %C02培养箱中培养。 当细胞生长密度为80 %左右时，用0.25%的胰酶消化并传代。
[0219] 细胞转染过程：
[0220] 1、细胞铺板:准备24孔板，先向第一个孔内加入少量无血清培养基，晃动浸润整个 孔底，然后用移液枪吸至第二孔，其他孔依次类推，目的是让细胞铺板时分散更均匀。将SK-0V-3细胞、KB细胞以1X10 5细胞每孔接种到24孔板，每孔分别加入500ul完全培养基，加完 后放工作台静置一下，然后在37°C、5%C〇2培养箱中培养24h。
[0221] 2、感染贴壁细胞
[0222] (1)若细胞汇集度为50 %左右，则准备下述实验。吸走原有培养基，更换为250ul不 含血清的培养基。
[0223] (2)冰上解冻腺病毒，计算需要添加的病毒量，并对其浓度进行稀释。吸取lOOul病 毒原液(C〇 = l X 101()PFU/ml)，加入到900ul培养目的细胞所用的培养基中，混匀，标记浓度 为(& = 1 X 109PFU/ml)，类似方法得到浓度为(C2 = 1 X 108PFU/ml)
[0224] Μ0Ι(感染复数）=病毒个数/转染时细胞数
[0225] 所需的病毒体积=病毒个数/病毒滴度
[0226] (3)将浓度曲线设为0、10、100、1000，其中^)1为0作为负性控制来检测细胞生长与 死亡。在各孔中加入特定Μ0Ι值的腺病毒各10ul，8字混匀后放入培养箱感染2h，然后补充 250ul含有血清的新鲜培养基。
[0227] (4)在37°C继续培育细胞24h。
[0228] (5) 24h后换液，在荧光显微镜下观察细胞形态。
[0229] 如图17、18所示，对于SK-0V-3细胞、KB细胞而言，当感染复数Μ0Ι = 0，也就是不加 入腺病毒时，两个细胞不表达荧光，从白光下观察细胞生长状况良好。当M0I = 10时，两种细 胞均能看到些许荧光，荧光强度不高，说明转染效率一般。当Μ0Ι = 100时，荧光强度明显增 强，表明转染效率有所提高。当Μ0Ι = 1000时，SK-0V-3细胞荧光强度很高，而KB细胞荧光强 度没有明显提高。一般高数量的病毒能够引起细胞毒素的副作用，因此，在实验中在保证转 染效率的前提下应尽量选择较低点的Μ0Ι，减少对其他正常细胞的损伤。因此，将最优感染 复数确定为100。
[0230]将筛选出的叶酸受体阳性SK-0V-3细胞及KB细胞进行培养，传代几次后将这2种细 胞分别接种到24孔板，每孔加入500ul含血清培养基，使细胞浓度为1 X 105/ml细胞，在37 °C、5 %⑶2培养箱中培养24h。然后更换为250ul新鲜培养基，分别在每孔加入不同比例的 PEI-PEG-PEI/FA聚合物（10ul)与腺病毒（10ul)的复合物，37°C下培养2h后补充250ul的含 血清培养基继续培养24h，最后观察GFP表达情况。
[0231] 为了对比实验结果，将之前筛选出的叶酸受体表达阴性的SK-0V-3细胞及KB细胞 也做上述实验。结果如图19、20所示。对于KB细胞而言，裸病毒转染KB细胞时，荧光强度很 弱，表明转染效率非常低。用Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA复合物转染KB细胞时，随着PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA摩尔比的不断降低，荧光强度进一步增强。特别是当二者的摩尔比 nPEI-PEG-PEl/nPEI-PEG-FA= 1/4时，焚光强度显著增强，转染效率大幅度提高。同时，不含叶酸的 培养基筛选的KB细胞其荧光表达量更强一些，这是因为若细胞培养的环境中缺乏叶酸，则 细胞为叶酸受体高表达，而叶酸受体阳性其亲和力更好，因此在转染过程中荧光强度更高， 结果表明：Ad/PE I -PEG-PEI /PE I-PEG-FA三元复合物的病毒转染效率明显高于Ad/PE I-PEG-FA二兀复合物和Ad/PEI-PEG-PEI二兀复合物的病毒转染效率，且npEi-peg-PEi/npEi-peg-fa= 1/4 时，Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA三元复合物的病毒转染效率最高。
[0232] 对于SK-0V-3细胞而言，实验结果与KB细胞类似。裸病毒转染SK-0V-3细胞时，荧光 强度很弱，转染效率低。用Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA复合物转染SK-0V-3细胞时，随着 PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA摩尔比的降低，荧光强度逐渐增强。当二者的摩尔比nPEI-PEG- PEI/ nPEI-PEC-FA= 1/4时，焚光强度较大，转染效率同样最高。另一方面，从图中可以看出叶酸受体 阳性细胞总体荧光强度要更强。
[0233] 3.2免疫原性研究
[0234] 选用年龄6-8周岁雌雄各半的SPF级C57小鼠（购买于北京维通利华实验动物技术 有限公司）适应环境一段时间过后，将实验动物分为三组，其中A组注射腺病毒，B组注射聚 合物修饰的腺病毒，C组注射生理盐水。
[0235] 采用尾静脉注射的方式，每只动物均给予50ul的剂量(其中腺病毒为101()VP)。实验 第1天和第14天分别给药后，第28天动物框静脉采血。最后分离血清，将其保存于-80°C冰 箱，用于后续血清样品中和抗体的检测。
[0236] 3.2.1 ELISA 实验
[0237] ELISA-般可用于测定抗原和抗体，它的原理是:抗原与抗体的特异反应。测量时， 抗原(抗体)先结合在固相载体上，保留其免疫活性，然后加抗体(抗原）与酶结合成的偶联 物(标记物），此偶联物保留原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)特 异反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色，所产生的颜 色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比，可以用酶标仪定量测定。
[0238] 根据具体条件可设计出不同类型的检测方法，用于临床检验的ELISA主要有以下 几种类型：1.直接法2.间接法3.双抗体夹心法测抗原4.双抗原夹心法测抗体5.竞争法测抗 体等，如图21所不。
[0239] 本实验中利用小鼠免疫球蛋白G(IgG)酶联免疫分析试剂盒测定小鼠血清中免疫 球蛋白G(IgG)的含量。该试剂盒采用双抗原夹心法测定标本中小鼠免疫球蛋白G(IgG)水 平。双抗原夹心法的原理同双抗体夹心法原理类似，是以包被抗原和酶标抗原检测待检抗 体，反应层次为:包被抗原一待检抗体一酶标抗原一底物。操作步骤是：1、将已知抗原包被 固相载体，形成固相抗原。洗涤除去未结合物。2、加入待捡标本，温育，使待检抗体和固相抗 原结合。洗涤取出未结合物。3、加入酶标抗原，温育，形成固相抗原-待检抗体-酶标抗原复 合物。洗涤除去未结合物。4、加底物显色。具体的操作过程如下：
[0240]从冰箱中取出试剂盒，放置20min平衡至室温。用双蒸水将25倍的浓缩洗涤液稀释 成原倍洗涤液。在冻干标准品中加入lml标准品稀释液，静置10分钟，待其充分溶解后，用移 液器将其轻轻混匀，标记浓度为l〇〇ng/mL，然后稀释成以下浓度：100、50、25、12.5、6.25、 3.13、1.56、0ng/ml。取所需数量的酶标包被板，固定在框架上。分别设空白孔、标准孔和待 测样品孔。在空白孔加样品稀释液l〇〇ul，标准孔加入标准品lOOul，待测样品孔内分别加入 样品原液、稀释5倍样品及稀释10倍样品各100ul。给酶标板覆膜，37 °C恒温箱孵育90min。弃 去液体，甩干，每个孔中加入生物素化抗体工作液1 〇〇ul，酶标板加上覆膜，在37 °C温育 60min。弃去孔内液体，甩干后，每孔加入350ul洗涤液，浸泡l-2min后甩干，在吸水纸上轻拍 将孔内液体拍干，如此重复洗板3次。每孔加100ul酶结合物工作液，加上覆膜后在37°C温育 30min。弃去孔内液体，甩干，洗板5次。每孔加入90ul底物溶液，酶标板加上覆膜37 °C避光显 色15min，当标准孔出现明显梯度时即可终止。每孔加入终止液50ul，终止反应，此时观察到 蓝色转为黄色。用酶标仪在450nm波长下测量各孔的吸光值(0D值），根据标准品的0D值，计 算出标准曲线的直线回归方程，然后将样品的0D值代入方程式，计算出对应的样品浓度，最 终浓度为稀释倍数乘以实际测定浓度。
[0241] 将原样品稀释10倍后，采用ELISA法测得的标准曲准及小鼠血清中腺病毒IgG抗体 水平分别如图22、23所示。从图中可以看出，正常小鼠体内抗腺病毒抗体的水平较低，如果 注射裸病毒后，会促使小鼠体内产生大量的抗腺病毒抗体。但是将腺病毒与聚合物结合而 成的复合物注射在小鼠体内，则小鼠的抗腺病毒抗体水平有所下降。因为腺病毒能被免疫 系统识别，产生的野生腺病毒抗体和反复给药后诱发的中和抗体会抑制病毒复制，所以我 们希望这种抑制作用降到最小，结合实验结果可以看出，我们构建的PEG松散修饰的溶瘤腺 病毒基因传递系统能够在一定程度上减少小鼠体内抗腺病毒抗体的产生。
[0242] 3.2.2中和抗体的分析
[0243] ELISA实验初步证实，包裹后的病毒刺激小鼠免疫系统的能力较弱，血清内抗病毒 抗体的浓度相对比较低，为进一步评价腺病毒刺激机体所产生抗体对病毒复制、转染效率 的影响，我们希望通过使用含抗体的小鼠血清与携带GFP基因的裸病毒孵育，考察中和抗体 的情况。
[0244]将生长状态良好的SK-0V-3细胞和KB细胞分别接种到24孔板，使细胞浓度为IX 105/ml，分别加入500ul RPMI 1640培养基和DMEM培养基，在培养箱中培养24小时。保证第 二天进行病毒感染时，细胞汇合率介于50%至70%之间。24小时后更换为250ul的新鲜培养 基，然后在孔中加入l〇ul含抗体的小鼠血清及10ul腺病毒，为使结果具有可比性，每孔中的 腺病毒感染复数相同，每个梯度下设2个复孔。在37°C感染2小时后，不换液，追加250ul的完 全培养液，继续感染过夜。24小时后，在激光共聚焦荧光显微镜下观察GFP表达。结果如图 24、25所示。
[0245] 对于KB细胞而言，将两种血清分别稀释20倍及40倍后与腺病毒孵育，相比而言，注 射Ad/PEI-PEG-PEI/PEI-PEG-FA的小鼠血清与腺病毒孵育后，荧光表达量要更强，转染效率 更高，并且稀释40倍的血清其荧光表达量均要高于稀释20倍的血清。
[0246] 腺病毒特定的中和抗体能够修饰腺病毒衣壳蛋白，且抑制病毒在体内的复制，因 此腺病毒传递载体面临的阻碍之一就是中和抗体的诱导作用。实验结果表明，与裸腺病毒 相比，通过聚合物修饰溶瘤腺病毒表面，腺病毒特定中和抗体的产生明显减少。另一方面， 在适应性免疫反应中，PEG共价结合腺病毒起到更好的保护作用，相比裸腺病毒，PEG在降低 适应性免疫反应中具有重要作用。
[0247] 由于中和抗体抑制腺病毒的复制，从而导致腺病毒载体无法重复起作用，若通过 静脉注射，腺病毒特定中和抗体的减少能够使腺病毒重复且多次起作用，从而具有很好的 治疗效果。对于SK-0V-3细胞，研究结果与KB细胞类似。注射Ad/PE I-PEG-PEI/PE I-PEG-FA的 小鼠血清与腺病毒孵育后，荧光表达量要强于注射裸病毒的小鼠血清，说明其转染效率显 著提高。上述实验结果均表明：用阳离子聚合物"物理吸附"包裹病毒的复合基因载体能够 减少体内中和抗体的产生，从而降低机体的免疫反应。
[0248] 试验例4 Ad/roi-PEG-TOI/FA复合物抑制肿瘤活性的动物试验（复合载体中的 PEI-PEG-PEI 的分子量为 2800-2000-2800)
[0249] BALB/c-nu小鼠，SPF级，4-6周龄，体重（20-30)g，雄雌不限，15只，右前肢腋下部位 接种人口腔上皮癌KB细胞，1 X 107/mL，150ul。小鼠成瘤后（~80mm3)，尾静脉给药，隔天一 次，连续3次。包括生理盐水组、治疗组(Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合物，现用现配，终浓度病毒 浓度0·5X10 11PFU，PEI-PEG-PEI浓度0·6mg/mL和/FA-PEG-PEI浓度2·4mg/mL)，连续观察35 天。病毒载体为删除Elb-55kb序列，具有一定肿瘤靶向启动活性，并携带IL-24的工具病毒。 [0250]实验结果显示（如图27所示），生理盐水组的肿瘤持续生长，使用了病毒的肿瘤生 长都不同程度受到了抑制，其中，包裹病毒的Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合物的抑瘤率显著高于 裸病毒(P〈〇.〇5)。
[0251] 试验例5 Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合物体内分布研究
[0252] BALB/c-nu小鼠，SPF级，4-6周龄，体重（20-30)g，雄雌不限，3只，右前肢腋下部位 接种人口腔上皮癌KB细胞，1 X 107/mL，150ul。小鼠成瘤后（~200mm3)，尾静脉给药，隔天一 次，连续3次。最后一次给药后72小时，安乐死后取肿瘤组织和肝脏，匀浆后，荧光定量PCR检 测病毒体内分布情况。
[0253] (PCR检测所用引物:AE-F: CGGAGCTATGCTAACCAGCGTA，
[0254] AE-R:TGAGCATGACTACGATGTGCTTTC，
[0255] ΑΕρ:fam+CGATATAAAATGCAAGGTGCTGCTCAAA+BHQl)。
[0256] 结果显示，肝脏组织中未检测出病毒基因，肿瘤组织中测得平均绝对1.03 X 106拷 贝，即本发明肿瘤靶向腺病毒复合载体的包裹可以大大提高病毒在肿瘤组织中的定向分 布，减少在肝脏中的蓄积。
【主权项】
1. 肿瘤靶向腺病毒复合载体，其特征在于：其组成为由三嵌段聚合物pei-peg-pei和 PEI-PEG-FA和Ad形成的复合物;其中，PEI为聚乙烯亚胺，PEG为聚乙二醇，FA为叶酸，Ad为腺 病毒。2. 根据权利要求1所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体，其特征在于:所述的PEI分子量为 2500~8500,所述PEG分子量为2000;所述的腺病毒为2型腺病毒或5型腺病毒;所述的PEI分 子量优选为2800;所述的腺病毒优选为5型腺病毒。3. 根据权利要求2所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体，其特征在于：所述的PEI为线状 PEI;所述的腺病毒为肿瘤靶向启动子控制复制缺陷型腺病毒，所述的腺病毒优选为缺失El 和E3基因区的腺病毒。4. 根据权利要求1~3任一项所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体，其特征在于= PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比为1:2~6 ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的摩 尔比为IX IO3~2 X105:l ;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的摩尔比优选为 1.5 X IO3~1.5 X IO5:1;PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔总量与Ad颗粒的摩尔比最优选为 1.5X10 3:1〇5. 根据权利要求4所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体，其特征在于:PEI-PEG-PEI与PEI-PEG-FA的摩尔比为1:4;当PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度为0.02~ 0.6mg/ml，复合载体中的PEI-PEG-FA浓度为0.08~2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度为 IO9~IO11PFU;当PEI分子量为2800时，复合载体中的PEI-PEG-PEI浓度优选为0.6mg/ml，复 合载体中的PEI-PEG-FA浓度优选为2.4mg/ml，复合载体中的腺病毒浓度优选为10 nPFU。6. 抗肿瘤药物，其特征在于:含有权利要求1~3任一项所述的肿瘤靶向腺病毒复合载 体。7. 权利要求1~3任一项所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体在制备治疗抗肿瘤药物中的 用途。8. 制备权利要求1~5任一项所述的肿瘤靶向腺病毒复合载体的方法，其特征在于包括 如下步骤： a、 用稀释液将PEI-PEG-PEI和PEI-PEG-FA分别稀释至浓度为0.05~5mg/ml，然后通过 0 · 22um孔径的过滤器进行过滤； b、 用稀释液将腺病毒稀释至滴度为0.5 X IOiq~I X IO11PFU; c、 将a步骤过滤后的PEI-PEG-PEI液与PEI-PEG-FA液混合，然后滴加入到的腺病毒溶液 中，混匀，在室温条件下孵育25-30min，制得Ad/PEI-PEG-PEI/FA复合载体； 其中，所述的稀释液为PBS液、去离子水或5wt%葡萄糖溶液;所述的稀释液优选为PBS 液。9. 根据权利要求8所述的制备肿瘤靶向腺病毒复合载体的方法，其特征在于：所述的 PEI-PEG-PEI采用下述方法制备得到： 1)、合成 TsO-PEG-OTs 以Et3N和CHCl3为溶剂，使PEG与TsCl在室温条件下进行对甲苯磺酰化，反应时间为0.5-2h;反应后的产物加入CHCl 3使其溶解，然后加入去离子水，静置分层，下层有机相溶液用饱 和NaCl溶液再进行萃取，萃取结束后蒸掉多余CHCl3溶剂;将乙醚溶液缓慢滴入上述萃取液 中，然后静置分层，将下层乳浊液进行离心分离，制得TsO-PEG-OTs; 2) 合成 PEtOZO-PEG-PEtOZO 以阳离子聚合物2-乙基-2-恶唑啉(EtOZO)为底物，TsO-PEG-OTs作为引发剂，在惰性气 体保护条件下，以乙腈为溶剂，于65-75Γ反应65-75h;反应完成后蒸掉多余的乙腈溶剂，然 后用三氯甲烷溶解产物，再将产物缓慢滴入乙醚中，静置分层，下层沉淀物离心，制得 PEtOZO-PEG-PEtOZO; 3) 水解 PEtOZO-PEG-PEtOZO在10 %盐酸溶液、100°C、惰性气体保护条件下水解16小时，然后将 水解后的混合物pH值调至12.5，析出沉淀，离心分离沉淀即得PEI-PEG-PEI。10.根据权利要求9所述的制备肿瘤靶向腺病毒复合载体的方法，其特征在于：步骤1) 中PEG、TsCl和Et3N的摩尔比为1:2~4:3~5;PEG、TsCl和Et3N的摩尔比优选为1:3:4。
【文档编号】C12N15/64GK105907787SQ201610326722
【公开日】2016年8月31日
【申请日】2016年5月17日
【发明人】雷宁, 张青
【申请人】成都理工大学