S100a9重组腺病毒、其构建及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及一种重组腺病毒，具体设及一种S100A9重组腺病 毒、其构建及应用。
【背景技术】
[0002] 在严重危害女性健康的恶性肿瘤中，宫颈癌的发病率仅次于乳腺癌，位于第二。据 全球范围统计，宫颈癌每年的新发病例大约有50万，其中发展中国家占80%W上。且近年 宫颈癌的发病有年轻化趋势。大量的研究表明，高危型人乳头瘤病毒（HPV)持续感染是宫 颈癌发病的首要因素，但大多数HPV感染的女性并未发展为宫颈癌。说明宫颈癌的发生发 展是一个多因素、多步骤、多基因参与的过程，但具体的发生发展机制还尚未明确。故深入 探讨宫颈癌发生发展的机制，将为宫颈癌的治疗提供新的思路和实验依据。C33A细胞是人 宫颈鱗癌细胞系，是宫颈癌研究常用的细胞系。
[0003]S100属于巧结合蛋白家族，是一类只在脊柱动物中发现的小分子酸性蛋白。 S100A9为其中一个成员，常与S100A8结合形成异二聚体。通过与第二信使之一Ca2+结合， W及与祀蛋白的相互作用，参与多种生物学功能，如细胞的分化、增殖、黏附、迁移和信号转 导等。S100A9位于1号染色体长臂2区1带（lq21)，该区段稳定性差，容易发生染色体缺 失、重排、易位或重叠等，故推测其可能参与肿瘤的发生发展。近年来研究表明，S100A9在 多种恶性肿瘤中表达上调，如口腔舌癌、未分化的甲状腺癌、肺癌、乳腺癌、膀脱癌和卵巢癌 等。
[0004] 在前期研究中，采用免疫组织化学的方法，发现S100A9在正常宫颈组织、宫颈上 皮内瘤变、宫颈鱗癌中的表达逐渐增高，但S100A9在宫颈癌发生发展中的具体机制尚缺乏 客观的依据。
[000引前期的研究中，比较分析C33A，MS751，Si化，CaSki等宫颈鱗癌细胞系中S100A9mRNA和S100A9蛋白的表达，发现S100A9mRNA和S100A9蛋白均在C33A宫颈鱗癌细 胞系中的表达最低，所W本发明选择宫颈鱗癌C33A细胞作为进一步研究S100A9重组腺病 毒转染细胞使S100A9高表达对细胞生物学行为影响的细胞。
【发明内容】
[0006] 本发明通过重组腺病毒技术，构建宫颈鱗癌C33A细胞的S100A9重组腺病毒，探讨 S100A9对宫颈鱗癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响。
[0007] 本发明提供了一种S100A9重组腺病毒载体质粒，将S100A9蛋白编码基因重组至 pHBAd-MCMV-RFP载体得到所述S100A9重组腺病毒载体质粒，所述S100A9蛋白编码基因的 序列如SEQIDN0:1所示。
[0008] 优选地，上述的S100A9重组腺病毒载体质粒由经I和化iI双酶切的 pHBAd-MCMV-RFP载体与S100A9蛋白编码基因连接、转化后构建而成。
[0009] 本发明提供上述的S100A9重组腺病毒载体质粒的构建方法，包括如下步骤； (1) 设计引物 S100A9蛋白编码基因的引物如下； S100A9-Afo幻-F:ACACGCGGCCGCATGACTTGCAAAATGT; S100A9-化il-R:ACACGATGCATTTAGGGGGTGCCCT; (2) W含有S100A9蛋白编码基因的RNA逆转录后为模板，用所述引物和DNA聚合酶进 行聚合酶链式反应扩增，纯化，得到扩增产物； (3) pHBAd-MCMV-RFP载体扩增和双酶切 将pHBAd-MCMV-RFP载体用I和化il双酶切，酶切完成后，胶回收纯化； (4) 将步骤2)得到的扩增产物和步骤3)经过双酶切的载体进行连接、转化、提取，即可 得到重组腺病毒载体质粒pHBAd-MCMV-RFP-S100A9。
[0010] 优选地，步骤4)中的转化包括如下步骤；步骤2)得到的扩增产物和步骤3)经过 双酶切的载体进行连接后得到的连接产物中加入感受态细胞，冰上解育20-30min，40~45°C 下水浴60~120sec，于冰上速冷2-3min，加入LB培养基，35~40°C振荡温育，离心取重悬沉 淀，混匀后取适量均匀涂于平板，置于37°C培养箱中倒置培养；在LB培养基中加入氨节青 霉素构成培养基，取平板上培养得到的单克隆接种到所述培养基中，37 °C培养箱中，振荡。
[0011] 进一步优选地，所述感受态细胞为D册a感受态细胞。
[0012] 本发明还提供一种S100A9重组腺病毒，其上述的S100A9重组腺病毒载体质粒和 骨架质粒转染肥K293细胞得到重组腺病毒Ad-S100A9。
[001引优选地，所述骨架质粒为pHBAd-BHG。
[0014] 更优选地，转染肥K293细胞所用的转染试剂为LipofiterTM。
[00巧]本发明还提供上述的S100A9重组腺病毒的应用；将所述重组腺病毒Ad-S100A9转 入宫颈鱗癌C33A细胞，研究S100A9对宫颈鱗癌生物学行为包括细胞增殖、侵袭和迁移的影 响。
[0016] 本发明构建人宫颈鱗癌C33A细胞的S100A9重组腺病毒，介导S100A9的高表达， 为研究S100A9对宫颈鱗癌生物学行为包括细胞增殖、侵袭和迁移提供良好的实验基础及 依据，及其在细胞内的功能提供了更直接便捷的工具。且pHBAd-MCMV-RFP载体及限制性内 切酶和连接酶等试剂购买方便，操作简单，重组腺病毒稳定。
【附图说明】
[0017] 图1为pHBAd-MCMV-RFP过表达载体图谱。
[001引图2为pHBAd-MCMV-RFP载体胶回收，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。
[0019] 图3为S100A9PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。
[0020] 图4为S100A9单克隆鉴定PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果示意图。
[0021] 图5为Westernblot检测S100A9蛋白表达的示意图。
[0022] 图6为S100A9重组腺病毒转染C33A细胞后对细胞侵袭能力的影响示意图。
[0023] 图7为S100A9重组腺病毒转染C33A细胞后对细胞迁移能力的影响示意图。
【具体实施方式】
[0024] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，W使本领域的技术人员可W 更好的理解本发明并能予w实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[00巧]一、重组腺病毒载体质粒pHBAd-MCMV-RFP-S100A9的构建及鉴定 1. 酶切 附图1是pHBAd-MCMV-RFP过表达载体的示意图和其中的关键点。
[0026]I和化iI为插入位点，pHBAd-MCMV-RFP载体用I和化iI双酶切，酶切 体系如下： 20uL酶切体系 37°C化
2. 胶回收及纯化 (l)DNA电泳结束后，用洁净刀片在紫外线灯下切出相应片段。仔细将胶块中无DNA部 分去除掉。
[0027] (2)含DNA的琼脂糖胶块装入1. 5血离屯、管，估算其体积。加入500yL(< 150yL 凝胶）或3-4倍（> 150yL凝胶）凝胶体积的BufferPS(溶胶结合液)。
[0028] (3)离屯、管置于50-60°C水浴5-lOmin，每隔2-3min取出混悬振荡lOsec，至琼脂 糖凝胶完全溶解，室温放置5min冷却。
[0029] (4)将少于700UL融化胶液转移至插入套管的离屯、柱内，于台式离屯、机上高速离 屯、Imin，弃去套管内废液，再将离屯、柱插入套管。
[0030] (5)多于700化的剩余融化胶液，加入同一离屯、柱内，重复步骤（4)。
[0031] (6)向离屯、柱内加入BufferPW(洗漆液）700uL，高速离屯、Imin，弃去套管内废 液，将离屯、柱插入套管。
[0032] (7)高速离屯、l-2min后，小屯、取出离屯、柱，不要沾上套管内的废液。弃去套管。 [003引 （8)将离屯、柱插入一个新的1. 5mL离屯、管，在离屯、柱内硅胶膜中屯、位置加入 30-50yLElutionBuffer(洗脱液)，不要触及硅胶膜；室温放置2-5min，高速离屯、Imin， 离屯、管中即得纯化的DM溶液。
[0034] (9)获得的DNA溶液，可直接应用于后续实验中，或保存于-20°C备用。
[0035]pHBAd-MCMV-RFP载体胶回收，琼脂糖凝胶电泳结果如图2,图2中Lane1 (左）为 标记；Lane2 (右）为pHBAd-MCMV-RFP载体胶回收结果（在eOOObp左右的地方可见电泳 条带）。（标记从上至下依次为；12000bp, 8000bp, 6000bp,SOOObp, 4000bp,SOOObp, 2500bp, 2000bp, 1500bp,lOOObp, 750bp, 500bp, 250bp)。
[0036] 3.S100A9 片段PCR回收 PCR扩增S100A9ORF序列，如SEQIDNO: 1 所示;__
酶切完成后胶回收。
[0037] S100A9PCR产物，琼脂糖凝胶电泳结果如图3。图3中Lane1 (左）为标记，Lane 2 (右）为S100A9PCR产物（在350bp左右的地方可见电泳条带）。
[003引4.处理好的目的片段（酶切后S100A9序列）与酶切后的pHBAd-MCMV-RFP过 表达载体连接，反应体系：
W上连接液在16 °C过夜 5.转化 (1)取100yL的D册a感受态细胞，置于冰上融解5-lOmin。
[0039] (2)融解后立即向感受态细胞加入10uL的连接产物，柔和混匀后，冰上解育 20-30min〇
[0040] (3) 42它水浴箱中放置90sec，立即于冰上速冷2-3min (4)加入900yL的LB培养基，37°C振荡温育比。
[0041] (5) 3000巧m离屯、3min，弃部分上清，留下约200yL重悬沉淀，混匀后取适量均匀 涂于平板，将平板置于37°C培养箱中倒置培养过夜。
[0042] (6)离屯、管中加入5mL含100yg/mL氨节青霉素的LB培养基，在超净工作台内用 枪头挑取步骤（5)平板上培养的单克隆接种到离屯、管的培养基中，37°C培养箱中，250rpm 振荡过夜。
[0043] 6.鉴定 菌液进行PCR鉴定，将阳性克隆菌液进行测序。重组序列与S100A9编码序列相比，两 者完全相同。如图4(Lane1为标记，Lane2-7 ;S100A9单克隆鉴定PCR产物（在6(K)bp 左右的地方可见电泳条带））所示；本实验PCR鉴定使用的为载体通用引物，所WPCR条带 会比目的基因片段大25化P左右。
[0044] 二、重组腺病毒质粒pHBAd-MCMV-RFP-S100A9的提取 1.将对数生长期的菌液2血加入100血含100yg/mL氨节青霉素的LB培养基中。
[0045] 2. 37°C300巧m振荡摇菌过夜。
[004引3.提取质粒 (1)取过夜培养菌0. 5-3血菌液，装入1. 5血或2血离屯、管中，12,OOOxg于室温离屯、 2min沉淀菌体，完全弃除上清。
[0047] (2)加入150yLBufferP1，充分混悬振荡菌体沉淀10-15sec，使其完全分散开， 至无絮块存在。
[0048] (3)加入150uLBufferP2,轻轻颠倒离屯、管3-5次，室温放置Imin，使细菌完全 裂解，溶液透明。菌体较多时，可放置3-5min,W充分裂解细菌。