专利名称：：弹状病毒的重组突变体及其应用方法
技术领域：
：本发明涉及除了表达其基因组内包含的至少一种外源核酸之外还表达包括一种突变的基质蛋白(M)和/或一种突变的糖蛋白(G)的弹状病毒蛋白的重组弹状病毒科病毒。本发明还涉及其应用方法，包括其在体内的应用、抗癌应用如治疗神经胶质瘤。本发明的重组弹状病毒科病毒还用于基因治疗和疫苗应用中。
背景技术：
：尽管在治疗应用中针对基因输送的合适载体的研发取得了巨大进展，但仍存在许多障碍，特别是在针对基因治疗的有效输送系统的研发和疫苗研发及其对抗癌治疗的影响中存在许多障碍。基因治疗的病毒载体典型地不裂解其靶向的细胞。用于基因治疗的病毒载体被工程化以输送相对安全的治疗有效的DNA，如药物(见例如D.T.Curiel等的美国专利No.5,547,932)。这些载体中有一些能在感染基础上复制，但仅在靶细胞内(F.McConnick，美国专利No.5,677,178)。其它基因治疗载体被工程化以便其不能复制。非复制的基因治疗载体通常使用辅助质粒产生(见例如G.Natsoulis，美国专利No.5,622,856；M.Mamounas，美国专利No.5,646,034)或使用授予病毒基因组中缺少的遗传元件的包装细胞。病毒基因治疗载体的广泛应用受到这样的事实的限制，即利用的病毒载体自然的野生型向性通常不易于克服。近年来，已经授予了许多基因治疗专利，这些专利描述了腺病毒载体(M.Cotton等，美国专利No.5,693,509)、腺伴随病毒载体(J.S.Lebkowski等，美国专利No.5,589,377)、逆转录病毒载体(B.O.Palsson等，美国专利No.5,616,487)、含有嵌合融合糖蛋白的载体(S.Kayman等，美国专利No.5,643,756)、含有病毒外壳蛋白的抗体的载体(cotton等)、工程化的以允许在猴(通常不能被HIV-1感染的物种)中用人免疫缺陷型1病毒(HIV-1)感染的杂种病毒(J.Sodroski等，美国专利No.5,654,195)、及含有疱疹性口腔炎病毒(VSV)的G蛋白的假型逆转录病毒载体(J.C.Bums等，美国专利No.5,512,421和5,670,354)。对基因治疗载体加以一些修饰以尝试克服各个载体固有的向性限制，同时保持用于基因治疗中的载体的效力。也已经产生了病毒输送载体以进行瞬时基因治疗，其中输送于细胞的基因的表达不是持久的(I.H.Maxwell等，美国专利No.5,585,254)。疫苗研发和促进有效的免疫应答是生物医学研究中的另一个领域，这将有益于更好地设计合适的基因输送系统，尤其是病毒输送载体。已经充分证明了在对侵入的病原或疫苗制剂的免疫应答的初级阶段期间产生的细胞因子在抗原特异性Th细胞的产生中起关键作用。一些迹象表明T辅助细胞分化为与保护作用相关的表型的“决定(decision)”受到细胞因子环境的强烈影响，在其中发现了T辅助细胞(1)。另外，许多不同的细胞因子当作为治疗或作为佐剂成分给予时，已经示出具有免疫调节作用，能促进细胞介导的、抗原特异性免疫应答的产生。为了充分利用这种细胞因子的免疫调节和佐剂性质，许多研究人员已经开始评价使用载体如质粒DNA(2)、工程化细胞(3，4)或重组病毒(5)在体内输送大量的这些细胞因子。在其它领域中已经示出病毒载体用于治疗肿瘤，尤其是治疗脑部肿瘤。在癌症基因治疗中取得的快速进展重申了这样的希望，即这种技术可为外科手术提供一种成功的辅助手段。已经揭示了用这些工具治疗癌症的两种治疗策略。一种策略称为病毒治疗(virotherapy)或肿瘤消解治疗，利用溶细胞的病毒的固有破坏能力杀死肿瘤细胞。将这些所谓的肿瘤消解病毒加以遗传修饰以便它们特异性靶向肿瘤细胞或者在正常组织中复制受限，从而优先破坏肿瘤细胞。复制受限的肿瘤消解病毒的一个实例是ONYX-015。ONYX-015是一种腺病毒，其E1B基因缺失并且在具有野生型p53基因的正常细胞中复制受限，但在缺少功能性p53的肿瘤细胞中复制并杀死其(6)。另一种策略包括将治疗性或胞毒性基因输送至肿瘤细胞。这些基因的产物直接或间接抑制肿瘤生长。在临床前和临床研究中已经测试了许多不同的基因，包括人细胞因子基因，肿瘤抑制基因，细菌或病毒前体药物激活酶编码基因(自杀基因)和使实体瘤对放疗和化疗更敏感的基因。弹状病毒科病毒是包膜(membrane-enveloped)病毒，其广泛分布于自然界，感染脊椎动物、无脊椎动物和植物。疱疹性口腔炎病毒(VSV)是弹状病毒科病毒家族的一部分，其分为6个属，VSV是其中之一。弹状病毒科病毒具有11-12,000个核苷酸的单负链RNA基因组(RoseandWhitt，2001，Chapter38，RhabdoviridaeThevirusesandtheirreplication，inFieldsVirology，4thedition，pp.1221-1244)。病毒颗粒含有由基因组RNA和蛋白质组成的一个螺旋状核壳核心。通常地，发现三种称为N(核壳，其紧紧地包住基因组)、P(先前称为NS，最初表示非结构的)和L(大型)的蛋白质与核壳相关。一个额外的基质(M)蛋白位于包膜中，也许与膜和核壳核心均相互作用。一个糖蛋白(G)物种跨越膜并在病毒颗粒的表面形成突起。G负责与细胞和膜融合体结合。由于基因组是负义的(即与发挥mRNA功能以直接产生编码的蛋白质的RNA序列(正义)互补)，因此弹状病毒科病毒必须在病毒体中编码和包装RNA依赖性RNA聚合酶(Baltimore等，1970，Proc.Natl.Acad.Sci.USA66572-576)，其由P和L蛋白组成。这种酶转录基因组RNA产生编码5-6个病毒蛋白的亚基因组mRNA，并且还复制全长正义和负义RNA。基因在基因组的3’末端开始相继被转录。VSV的基质蛋白在病毒的生活周期中起两种关键作用。首先，其对病毒装配和病毒颗粒从感染的细胞中释放是必需的。其次，其负责抑制宿主细胞基因表达，这允许病毒利用所有宿主细胞翻译机制合成病毒蛋白。M蛋白对宿主基因表达的抑制被认为是造成VSV感染相关的严重和快速致细胞病变作用的原因。M蛋白诱导的致细胞病变作用导致编程性细胞死亡的诱导并典型地导致细胞在感染后12-16小时内死亡。M蛋白单独从真核表达载体中瞬时表达足以诱导典型的VSV致细胞病变作用，包括宿主细胞的细胞骨架的解体和细胞成为圆形(rounding)，表明VSV诱导的致细胞病变作用不需要其它的VSV蛋白。VSVG蛋白介导病毒附着于宿主细胞以及在胞吞后病毒包膜与内体膜的融合。G蛋白胞外域的第118-136位残基的突变分析结果以及VSV的疏水性光标记实验结果提供了这样的证据，即这个区域是内在的融合肽并且其在酸性pH插入靶膜中(9-14)。也已经示出在第395-418位残基之间区域的插入或取代影响G蛋白的膜融合活性(15，16)。在融合肽和第395-418位残基中均有取代的双突变体对融合抑制具有加性效应(17)，表明胞外域的C末端区域在G的融合活性中特异性起重要作用。因此意识到需要开发病毒载体以用于基因输送，疫苗研发和抗癌治疗。研发基于VSV的载体，特别是不具有致细胞病变作用的那些载体，不经历广泛的细胞-细胞播散，并且专门在胞质中复制的那些载体消除了与病毒载体治疗相关的许多问题，包括关于在靶细胞染色体中的插入诱变的问题。发明概述本发明在一个实施方案中揭示了重组弹状病毒科病毒，其中基质蛋白M和/或弹状病毒糖蛋白(G)的近膜(membrane-proximal)胞外域被突变或部分缺失。本发明在其它实施方案中进一步提供了这种重组弹状病毒科病毒在基因转移方案中，作为疫苗和抗癌治疗中的应用。在一个实施方案中，重组弹状病毒是非致细胞病变的并进一步包含插入编码第二种多肽的一个异源核酸序列。第二种多肽在一个实施方案中可以是治疗性多肽，或者在另一个实施方案中可以是免疫原性的。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产非致细胞病变的重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸，所述弹状病毒蛋白包括在基质蛋白(M)内的突变或缺失，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括在基质蛋白(M)内的突变或缺失，插入编码标记多肽的多核苷酸序列及包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区(trailerregion)的多顺反子cDNA；(B)在选择所述细胞的非致细胞病变表型的条件下培养细胞；(C)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养所述细胞；及(D)分离所述非致细胞病变的重组弹状病毒。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码非致细胞病变的弹状病毒的基因组的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在编码基质蛋白(M)的基因中具有突变或缺失。在另一个实施方案中，本发明提供了一种重组弹状病毒，其包含弹状病毒基因组的核酸，其中弹状病毒基因组在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内包含缺失或突变。在另一个实施方案中，弹状病毒基因组进一步包含在基质蛋白(M)中的突变或缺失。在一个实施方案中，根据本发明的这个方面，弹状病毒基因组进一步包含插入编码第二种多肽的异源核酸序列。在一个实施方案中，所述第二种多肽是治疗性多肽。在其它实施方案中，所述第二种多肽是免疫原性的，是一种自杀基因或者是一种标记多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸，所述弹状病毒蛋白包括在糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺失或突变，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺失或突变，插入编码标记多肽的多核苷酸序列及包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区的多顺反子cDNA；(B)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养细胞；及(C)分离所述重组弹状病毒。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，所述方法进一步包括将编码第二种多肽的异源核酸插入所述细胞的步骤。在其它的实施方案中，所述第二种多肽是治疗性多肽，或者是免疫原性的。在另一个实施方案中，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码弹状病毒基因组的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因中具有缺失或突变。在另一个实施方案中，本发明提供了治疗患有与缺陷的基因相关的疾病的个体的方法，所述方法包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组非致细胞病变的弹状病毒接触的步骤，其中所述弹状病毒的基因组包括在编码基质蛋白(M)的区域内的突变或缺失和/或糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突变或缺失及能在靶细胞内表达的异源基因，从而治疗疾病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种使免疫个体抗一种疾病的方法，所述方法包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含弹状病毒基因或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的缺失或突变及编码能在靶细胞内表达的免疫原性蛋白质或肽片段的异源基因，从而使得对疾病免疫。在另一个实施方案中，本发明提供了一种癌细胞裂解的方法，包括将癌细胞与重组弹状病毒接触的步骤，其中所述弹状病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，其中所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)非弹状病毒核酸。在其它实施方案中，所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括将癌细胞与重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)非弹状病毒核酸。在其它实施方案中，所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别具有肿瘤消解活性的试剂的方法，包括如下步骤获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动(vibrotome)切片，在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养所述切片，用标记的癌细胞接种所述切片培养物，将所述接种的培养物与一种候选试剂培养，确定癌细胞存活力，其中癌细胞存活力降低表明该候选试剂是肿瘤消解的，从而鉴别具有肿瘤消解活性的试剂。在一个实施方案中，癌细胞是神经元来源的。在另一个实施方案中，癌细胞是用荧光的、发光的、生色或电子致密材料(electrondensematerial)标记的。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括用标记的重组弹状病毒接种所述切片，和/或将接种的切片培养物与细胞因子培养的步骤。附图简述图1是用于分离非致细胞病变的VSV突变体的方法的示意图。图2A-D示出用野生型(wt)VSV感染的细胞的相差图像(A)；VSV的温度敏感性突变体(tsO82)，其在M基因中含有突变(B)；用于选择NCP突变体的M33；51A重组病毒(C)；及噬斑纯化的NCP变体之一(NCP-12)(D)。图2a-d示出用野生型(wt)VSV感染的细胞的相差图像(A)；VSV的温度敏感性突变体(tsO82)，其在M基因中含有突变(B)；用于选择NCP突变体的M33；51A重组病毒(C)；及噬斑纯化的NCP变体之一(NCP-12)(D)。注意NCP-12感染的细胞已经生长铺满并具有不能与未感染的BHK细胞区别的形态学(未示出)。图3是用于克隆和测序NCP突变体之一(NCP-12)的方法的示意图。图4是用于回收编码NCP变体的重组病毒的示意图。图5A-E示出wt-VSV(A-B)和rVSV/MNCP12.1(C-E)突变体感染的BHK-21细胞的免疫荧光和相差图像。图5E是细胞单层的放大图。图6示出来自真核表达载体的MNCP12.1突变体蛋白的表达水平分析。将BHK-21细胞用2μg的pCAGGS-Mwt(左侧)，pCAGGS-NCP-12.1(中间两组)，或pCAGGS-MCS质粒(右侧)瞬时转染。使用M特异性单克隆抗体(23H12)和罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体分析。图7A-H示出由rVSV/MNCP12.1感染的不同类型细胞的相差(A-D)和荧光(E-H)分析。图8是用于回收缺少M蛋白的原型VSV基因输送/基因治疗载体的方法的示意图。图9示出回收和传代rVSV-ΔM(VSV复制子)的方法和分析使用N特异性单克隆抗体和罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体进行分析。图10示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI为5的情况下感染胰岛细胞样品176的荧光(上部)和相差(下部)图像。图11示出用缺失M蛋白及缺失G和M蛋白的VSV在MOI为5的情况下感染胰岛细胞样品163的荧光(上部)和相差(下部)图像。图12示出用MOI为25感染胰岛细胞样品176，在感染后3天的荧光(上部)和相差(下部)图像。图13示出用MOI为25感染胰岛细胞样品163，在感染后3天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像。图14示出用MOI为5感染胰岛细胞样品176，在感染后8天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像。图15示出用MOI为25感染胰岛细胞样品176，在感染后8的荧光(上部)和相差(下部)图像。图16示出用MOI为5感染胰岛细胞样品163，在感染后8天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像。图17示出用MOI为25感染胰岛细胞样品163，在感染后8天的荧光(上部)和相差(下部)显微图像。图18示出用MOI为5或25感染胰岛细胞样品176在感染后3天的荧光分析(分别为上部和下部)。图19示出用MOI为5或25感染胰岛细胞样品163在感染后3天的荧光分析(分别为上部和下部)。图20示出水泡性病毒糖蛋白的近膜结构域的序列对比。所示序列来自VSVIndiana的SanJuan(37)和Orsay毒株(19)，VSVNewJersey(18)，Cocal病毒(2)，Chandipura病毒(28)，Piry病毒(4)及鲤鱼病毒的春季病毒血症病毒(SVCV)(3)。淡灰色背景中的黑色字体残基在所有水泡性病毒中是保守的。黑色背景中的白色字体残基是在测试的病毒序列中相同的残基。深灰色背景中的黑色字体残基表示具有相似性质的残基。在序列底部的星号表示在测试的序列中不变的残基。图21是VSVG的近膜“主干(stem)”区域中突变的示意图。在上部示出了具有分界的胞外域、近膜G-主干(GS)区域、跨膜(TM)和胞质结构域的全长G蛋白的线性图。还示出了42个氨基酸的主干区域的序列。在序列的开始和末端的数字表示VSVGIND(SanJuan毒株)的N末端氨基酸残基的位置。氨基酸K462是TM结构域和胞外域之间的界限。示出了保守的色氨酸(W)残基(第457和461位)，谷氨酸(E452)，甘氨酸(G456)和苯丙氨酸(F458)中的突变。还示出了插入、缺失和反向序列突变体的序列。蛋白质G(AXB)在胞外域TM结合处导入两个额外的丝氨酸。图22表明了突变的蛋白质的表达和稳定性。将COS-1细胞用编码指定的G蛋白的质粒转染，将该蛋白质用[35S]-甲硫氨酸标记然后用多克隆抗G抗体免疫沉淀随后通过SDS-PAGE分析。(A)取代突变体和野生型G蛋白(WT-G)。(B)缺失和插入突变体。泳道标记的VSV是从用野生型VSV感染的细胞中免疫沉淀的蛋白质并用[35S]-甲硫氨酸标记。标示了G和N蛋白的位置。图23示出野生型和突变体G蛋白的转运动力学。将表达野生型G或突变体蛋白的BHK-21细胞用35S-甲硫氨酸标记15分钟。除去培养基并加入含有过量的未标记的甲硫氨酸的培养基0，10，30或60分钟。将G蛋白使用抗G尾肽抗体从细胞裂解物中免疫沉淀出。将一半免疫沉淀物用内切糖苷酶H消化。将蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上解离并通过荧光自显影观测。蛋白质的EndoH抗性和敏感性形式的量使用ImageQuant软件(MolecularDynamics，Co)量化。(A)检测野生型(WT)；GΔ13和Gsrev11的实验结果。(B)对比WT，G10DAF，ΔF440-N449和GΔ9-10DAF的单独实验的结果。图24示出WT和突变体病毒感染的细胞合胞体形成。将大约5×105个BHK-21细胞在感染复数为10在37℃感染1小时。在感染后6小时，将细胞用缓冲为pH5.9、5.5或5.2的融合培养基在室温处理1分钟。将培养基用DMEM+5％FBS替换并将培养物在37℃保温20分钟至1小时。然后将细胞固定并加工以使用G-特异性mAb(I1)进行间接免疫荧光检验。罗丹明缀合的山羊抗小鼠抗体用作二级Ab。使用具有10倍可浸入水中的陶瓷物镜的ZeissAxiophot显微镜上装配的ZeissAxiocam数字化捕捉荧光和相差图像。然后将图像使用AdobePhotoshop处理以调节亮度和相差。(A)在用缓冲为pH5.9的融合培养基处理后，用rVSV-wt，-GΔ9，-GΔ13和-GΔ9-10DAF感染的细胞中诱导的合胞体形成。箭头指向突变体感染的细胞中的小合胞体。(B)在pH5.2处理后，用rVSV-ΔF440-N449，-G10DAF和-G(+9)gBG感染的细胞。图25示出WT和突变体病毒感染性。将BHK-21细胞用WT或G补足的突变体病毒在感染复数10感染1小时，然后将细胞用生长培养基洗3次。在感染后16小时，取等份上清并使用噬斑分析在BHK-21细胞上测定病毒效价。感染后36小时，计数噬斑数目并在至少两个稀释液之间取平均值以确定效价。示出的病毒效价是至少三个独立实验的平均值。图26示出在病毒体中掺入WT和突变体G蛋白。将BHK-21细胞用编码野生型或突变体蛋白的病毒在感染复数10进行感染，如图5所述。感染16小时后，释放入上清中的病毒通过20％蔗糖垫(sucrosecushion)粒状沉淀。将病毒沉淀重悬于样品缓冲液中，并将1/5的病毒沉淀通过SDS-PAGE解离。蛋白质通过用考马斯蓝染色而观测。凝胶的数字图像使用具有35-80mm的Nikkor镜头的Nikon照相机获得。蛋白质量通过光密度测定法使用ImageQuant软件(MolecularDynamics，Co.)确定。掺入病毒体中的G蛋白的相对量通过计算G蛋白与N蛋白的比率而确定。结果以相对于在野生型VSV对照中发现的G∶N比率的百分比表示。图27示出WT和突变体病毒结合。将放射标记的病毒体(～80,000cpm)重悬于缓冲为pH7.0或5.9的结合培养基中并在室温保温30分钟。然后将悬浮液在冰上冷却10分钟，随后加入预冷的铺满单层的BHK-21细胞中。在冰上进行病毒结合3小时。除去培养基并确定放射性量。这表示未结合的病毒级分。然后将细胞用冰冷的结合缓冲液在与结合相同的pH下洗涤3次，收集洗涤物并量化。将细胞在含有1％TX-100的PBS中裂解，并确定裂解物(结合的级分)中放射性量。病毒结合以结合的病毒与全部病毒的百分比表示。图28示出表达IL-12融合蛋白的重组复制受限的VSV的构建。生物活性的小鼠IL-12融合构建体通过除去p40亚基的终止密码子，除去p35亚基上前22个密码子，并插入编码Gly-Ser接头区域的序列而产生，如A图所示。VSVΔG-IL12F的重组反基因组的示意图示于B图。所述反基因组编码VSV的核壳(N)，聚合酶(P和L)和基质(M)蛋白。另外，代替编码包膜糖蛋白(G)，完整的G编码区已经除去并用多克隆位点(MCS)替代。将编码IL-12融合构建体的cDNA插入这个MCS中。为生产精确的VSV反基因组RNA的3’末端，将来自丁型肝炎病毒的核酶(RBZ)置入紧邻VSV尾部之后。这个反基因组RNA从pBluescript背景中表达，其转录由T7启动子驱动。图29示出在VSVΔG-IL12F感染的细胞中vIL-12F的产生和分泌。将BHK-21细胞用VSVΔG-IL12F感染(MOI＝5)，并在无血清的培养基中培养17小时。收获上清并将已经与平板分开的BHK细胞通过低速离心除去(预澄清的上清)。病毒体通过在100,000×g经过20％蔗糖垫沉淀而从预澄清的上清中除去(澄清的上清)。为评估vIL-12F的产生，将预澄清的和澄清的上清样品以及沉淀的病毒体在10％凝胶上进行SDS-PAGE。解离的蛋白质通过考马斯蓝染色而观测(A)。样品组分如下泳道1)100μl预澄清的上清，泳道2)50μl澄清的上清，泳道3)100μl澄清的上清，及泳道4)从500μl上清中沉淀的病毒。并行地，将一种相似的凝胶移至硝酸纤维素上用IL-12-p40-特异性单克隆抗体制品进行Western印迹(B)。样品组分如下泳道1)100μl预澄清的上清，泳道2)100μl澄清的上清，及泳道3)从500μl上清中沉淀的病毒。标示了每个病毒表达的蛋白质的相同性。图30示出抗原特异性T细胞应答利斯特菌属(listerial)抗原的vIL-12F增强作用。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。在第20天，处死小鼠并通过灌洗收集腹膜溢泌物细胞，集合并制备未贴壁于塑料的细胞群(PNA)。将PNA(1.5×106/ml)在体外用预先确定的最佳浓度的培养基(未刺激)，ConA(2μg/ml；多克隆刺激物)，HKLM(107/ml)或SLP(8μg/ml)再刺激(在37℃，24小时)。无细胞上清中IL-2(A)和IFN-□(B)以测定抗原特异性T细胞应答而量化。所有分析均一式三份进行，结果以平均值±SD表示。图31示出当共同给予利斯特菌属抗原和vIL-12F时独特固有细胞群的诱导。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。在第20天，处死小鼠并通过灌洗收集腹膜溢泌物细胞，集合并制备未贴壁塑料的细胞群(PNA)。将PNA(5×105/ml)用指定的荧光染料缀合的抗体制品染色；也进行用同种型对照抗体制品染色，以评估非特异性抗体结合。对每个样品的淋巴细胞群(通过前向散射(forwardscatter)/侧向散射(sidescatter)门控选择)进行流式细胞计量术。(A)将细胞用抗CD5PE和抗CD45R/B220FITC(或用大鼠IgG2aPE和大鼠IgG2aFITC作为同种型对照)双染，并进行流式细胞计量术分析。淋巴细胞群内T细胞的出现次数针对每个测试组标示。(B)将细胞用抗-CD3PE和抗-αβTCRFITC，抗-γδTCRFITC，抗-CD4FITC，或者抗-CD8FITC双染并进行流式细胞计量术分析。为定性TCR或CD4/CD8在CD3+细胞上的表达，将样品在CD3+群上进一步进行门控。在淋巴细胞群内指定细胞类型的出现频率如下图示示出(C)T细胞，常规B细胞，及B1B细胞，(D)CD3+细胞。在CD3+群内αβ和γδTCR表达(E)以及CD4和CD8表达(F)的频率也以图示示出。图32示出在共同给予利斯特菌属抗原和vIL-12F后，保护性利斯特菌属免疫性的激发。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0、5和15天用PBS(运载体)，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg+0.5μgvIL-12F或者LMAg+5.0μgvIL-12P免疫。将5只小鼠的另外一组在第0天经i.p.接种次致死剂量的存活的利斯特菌属(6×103/小鼠或0.12×LD50)。在第45天，每只小鼠均接受(i.p.)攻击剂量的存活的利斯特菌属(6.4×105或者12.9×LD50)。4天后处死小鼠(第49天)，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷载的细菌。图33示出用利斯特菌属抗原和IL-12F免疫授予的长期活性的保护性免疫性。将C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)在第0，5和15天用PBS(运载体)，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg(109HKLM+8μg可溶的利斯特菌属蛋白)+PBS或者LMAg+5.0μgvIL-12F免疫。将5只小鼠的另外一组在第0天经i.p.接种次致死剂量的存活的利斯特菌属(6×103/小鼠或0.12×LD50)。在第120天，每只小鼠接受(i.p.)攻击剂量的存活的利斯特菌属(3.8×105或7.6×LD50)。4天后(第124天)处死小鼠，并定量每只小鼠的脾(A)和肝(B)中荷载的细菌。图34示出C6神经胶质瘤的VSV-wt感染。将生长于6孔板中的C6-GFP细胞用105pfu的rVSV-DsRed感染。示出了在(A)时间0点，(B)感染后10小时，(C)感染后24小时及(D)感染后48小时的细胞的相差图像。图像使用安装在具有10倍物镜的ZeissAxioskop显微镜上的ZeissAxiocam数码相机收集。图35示出rVSV-DsRed对C6-GFP神经胶质瘤细胞的胞毒性。将C6-GFP神经胶质瘤细胞以90％铺满铺板于96孔平板中，并用10、1,000或10,000pfu的rVSV-DsRed感染。使用CellTiterMTS分析监测培养物的细胞存活力，直至96小时。不论使用的病毒剂量如何，在感染后30小时，细胞存活力降低到50％，在感染后72小时，检测到很低的代谢活性至无代谢活性。图36示出大鼠器官型脑切片培养物和脑切片-C6-GFP神经胶质瘤共培养物。培养物使用大鼠脑的三部分(黑质，纹状体和皮质)确定，如(A)所示。培养2周后切片的TH和MAP-2免疫反应性分别示于B和C。(D)示出了使用荧光显微镜的C6-GFP细胞的低倍(4×)显微照片，(E)示出了高倍(40×)细胞图像。图37示出了在经过3天保温期后，正常的和切片-神经胶质瘤共培养物的rVSV-DsRed感染。(A)在用104pfu的rVSV-DsRed接种后正常切片组织的感染。(B)在与IFN-β预保温切片培养物后用104pfu的rVSV-DsRed对正常切片组织的感染。(C)在与IFN-β预保温切片-神经胶质瘤共培养物之后用104pfurVSV-DsRed接种对C6-GFP神经胶质瘤细胞的破坏。(D)在与IFN-β预保温切片-神经胶质瘤共培养物之后用104pfu的rVSV-DsRed接种，在切片组织中观测到的红色荧光(例如rVSV-DsRed感染)。这些数据表明正常切片组织的野生型VSV感染明显由IFN-β阻断，rVSV-DsRed能有效破坏切片培养物中生长的C6-GFP神经胶质瘤。图38示出在感染后3天用rVSV-DsRed接种的切片的MAP-2免疫反应性。(A)在用rVSV-DsRed感染3天后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(B)在与1,000U的IFN-β保温后24小时用rVSV-DsRed接种染后3天，正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(C)在用IFN-β预处理后用rVSV-DsRed感染后，切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性。红色染色鉴别感染的细胞，绿色染色鉴别C6-GFP细胞，蓝色代表MAP-2染色。(D)在与IFN-β保温3天后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。这些数据表明与IFN-β预保温可降低单独使用rVSV-DsRed可见的毒性作用，但在切片-神经胶质瘤共培养物中则否。这些数据还示出单独的IFN-β对切片组织不表现出直接毒性。图39示出在3天的保温期之后，正常的和切片-神经胶质瘤共培养物的rVSV-ΔG感染。(A)在用106感染单位的感染性ΔG-DsRed接种后正常切片组织中病毒复制的时程，如通过Ds-Red的表达示出(例如红色荧光)。(B)与IFN-β预保温的切片培养物在用106感染单位的ΔG-DsRed接种后防止正常细胞的感染。(C)在用1000U的IFN-β预处理后，用106感染单位的ΔG-DsRed接种对C6-GFP神经胶质瘤的破坏。(D)用IFN-β预处理切片-神经胶质瘤共培养物在用106感染单位的ΔG-DsRed接种后防止正常细胞感染。这些数据表明正常切片组织的ΔG-DsRed感染明显由IFN-β阻断，ΔG-DsRed可有效破坏在切片培养物中生长的C6-GFP神经胶质瘤。图40示出在用ΔG-DsRed接种后，正常切片培养物和切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性。(A)在用ΔG-DsRed接种3天后，正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(B)在用1,000UIFN-β预处理后用ΔG-DsRed接种后正常切片培养物的MAP-2免疫反应性。(C)在用IFN-β预处理后用ΔG-DsRed接种后，切片-神经胶质瘤共培养物的MAP-2免疫反应性。这些数据表明VSV-ΔG比VSV-wt的毒性低，而且VSV-ΔG的整体毒性通过与IFN-β预保温而降低。图41示出体内大鼠脑肿瘤模型的显微照片。将大鼠注射C6-GFP肿瘤细胞并在两周后处死。A.对冷冻的大鼠脑冠状切片进行H&E染色表明在右半球中有中央坏死的大肿瘤。B.使用荧光显微镜观测GFP表达的相邻切片，分别在4×(C)和10×(D)观测的GFP荧光肿瘤细胞。图42示出取自体内大鼠C6神经胶质瘤的中央(A)和周围(B)的冷冻切片的ITGA-3(611045，BDTransductionLaboratories)免疫反应性的显微照片。将GFPC6细胞用红色的神经胶质瘤标记ITGA-3复染。如期望的，使用荧光聚焦显微镜示出肿瘤细胞是免疫反应性的(分别在10×，40×)。发明详述本发明提供了重组病毒，重组弹状病毒科病毒，包含其的载体和组合物。在一个实施方案中，本发明的弹状病毒核酸序列包含被突变或部分缺失的基质蛋白(M)和/或糖蛋白(G)，并因此可用于生产基于弹状病毒的基因治疗载体，疫苗和/或抗癌治疗。在其它实施方案中，本发明提供了重组弹状病毒科病毒，载体和组合物的生产和治疗应用的方法。在一个实施方案中，重组弹状病毒科病毒提供了一种非常通用的外源基因输送的方式，因为它们感染人体内的许多不同类型的细胞。在另一个实施方案中，对其操纵以表达异源蛋白质提供了将外源基因输送至广泛细胞类型的系统，这是在用于基因输送的许多先前的具有更狭窄的细胞向性的载体中缺少的一种应用。重组弹状病毒科病毒的先前的应用导致致细胞病变作用同时由于弹状病毒感染的副产物一细胞蛋白合成的降低而具有最小的外源蛋白表达。然而在本发明中，在一个实施方案中，M蛋白突变或缺失的重组弹状病毒科病毒感染细胞，但不是致细胞病变的(实施例1)。异源蛋白质表达易于实现，同时突变的病毒中蛋白质表达增强。M蛋白的突变不改变细胞向性，因此感染多重的细胞类型(实施例2)，并易于回收(实施例3)。用突变的病毒感染胰岛细胞导致高水平的外源基因表达，同时致细胞病变作用最小(实施例4)。另外，用缺失M和G糖蛋白的毒株感染导致高水平的感染和表达，甚至在培养8天后也如此。因此突变或缺失M蛋白同时有或无G蛋白突变或缺失的重组弹状病毒科病毒提供了一种非致细胞病变的基因输送/基因治疗载体。在一个实施方案中，提供了一种包含弹状病毒基因组核酸的重组弹状病毒，其中所述弹状病毒基因组在编码基质蛋白(M)的区域内包含缺失或突变。根据本发明的这个方面，在一个实施方案中，重组弹状病毒是非致细胞病变的。如本文所用，术语“重组弹状病毒”和“重组弹状病毒科病毒”是指遗传工程化的以表达在弹状病毒科病毒中不天然表达的蛋白质的病毒。病毒以这种方式工程化因此产生随后可被分离的“假型”或“嵌合”病毒。如本文所用，术语“非致细胞病变的弹状病毒”是指弹状病毒的非致细胞病变变体，其在病毒装配中仍起作用但对感染的细胞无致细胞病变作用。如本文所用，术语“基质蛋白(M)”是指在弹状病毒基因组中编码的蛋白质。基质蛋白位于膜包膜内，也许与膜和核壳核心均相互作用。弹状病毒的基质蛋白在病毒的生活周期中起两种关键作用。首先，其是病毒装配及病毒颗粒从感染的细胞中释放所必需的。其次，其负责抑制宿主细胞基因表达，这使得病毒可以利用所有宿主细胞翻译机制合成病毒蛋白。M蛋白对宿主基因表达的抑制被认为负责与弹状病毒感染相关的严重和快速致细胞病变作用。在一个实施方案中，本发明的重组非致细胞病变的弹状病毒包含在基质蛋白M中的一个突变或缺失。在另一个实施方案中，突变在编码基质蛋白N末端部分(half)的区域中，其可以包含编码核定位信号(NLS)的区域。如本文所用，术语“核定位序列”或“NLS”是指一种肽或其衍生物，其指导与NLS相关的表达的肽、蛋白质或分子的转运，跨过核膜从细胞质转运至细胞核。在一个实施方案中，突变编码代替例如在基质蛋白(M)的第33或51位的甲硫氨酸残基的丙氨酸残基。在另一个实施方案中，突变编码例如在第226位用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。在另一个实施方案中，突变编码例如在第133位用丙氨酸残基取代苏氨酸残基。在另一个实施方案中，突变还可以包含在完整M蛋白编码区内的一个缺失。导致弹状病毒科病毒的致细胞病变作用降低的M蛋白表达中的任何改变均被认为是本发明的一部分。在另一个实施方案中，M蛋白突变体具有相应于SEQIDNO1、2、3、4或5的氨基酸序列。在本发明的一个实施方案中，重组非致细胞病变的弹状病毒可进一步包含在编码糖蛋白(G)的区域内的一个突变。由弹状病毒科病毒编码的糖蛋白(G)有助于病毒融合，病毒出芽过程的感染性和全部效力(WhittM.A.，(1998)TheJournalofMicrobiology361-8)。弹状病毒G蛋白的片段，G主干多肽，参与膜融合。如本文所用，短语“G主干多肽”是指弹状病毒G蛋白的片段，其包含一个42个氨基酸的近膜胞外域，一个跨膜锚结构域和一个成熟G蛋白的胞质尾结构域。由于G糖蛋白参与膜融合，因此其在弹状病毒感染中促进细胞-细胞的播散。本发明示出G的近膜胞外域是膜融合所必需的(实施例6-7)。编码G的近膜胞外域的区域的取代、缺失或插入突变不导致G表达降低(实施例5)。同时近膜区域中的突变无一影响全长G蛋白的稳定性，寡聚化或转运至细胞表面，该区域中的缺失导致极度抑制的融合，如同在膜锚结构域的边界和G蛋白之间插入9或10个氨基酸一样。然而，在G的近膜胞外域取代特异性残基不降低融合。只有在F440和N449之间的区域包括保守的FFGDTG基序的缺失才完全消除融合活性，示出这个亚结构域对G的融合活性非常重要。融合伴随着病毒生长，缺失突变体需要功能性G补足以促进病毒生长(实施例8)。近膜胞外域氨基酸残基的缺失，例如N449-K462，也导致感染性降低。在本发明的一个实施方案中，提供了一种重组弹状病毒，其包含弹状病毒基因组的核酸，其中弹状病毒基因组包含在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变。在一个实施方案中，编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域区域中的突变编码用丙氨酸残基取代色氨酸残基(SEQIDNO8、10、11、12、13或14)。在另一个实施方案中，突变编码丙氨酸残基取代谷氨酸(SEQIDNO6)，甘氨酸(SEQIDNO7)和/或苯丙氨酸残基(SEQIDNO9)。在另一个实施方案中，突变编码天冬氨酸和丙氨酸残基取代谷氨酸，甘氨酸和/或苯丙氨酸残基。在另一个实施方案中，突变是编码在此列出的氨基酸置换的突变的任何组合。在另一个实施方案中，编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域中的突变编码该胞外域核苷酸的缺失。在一个实施方案中，突变是编码弹状病毒G糖蛋白的第449-461位氨基酸残基(SEQIDNO20)或其片段的核苷酸的缺失。在另一个实施方案中，突变是编码第440-449位氨基酸残基(SEQIDNO16)或其片段的核苷酸的缺失。在另一个实施方案中，编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域中的突变编码在该胞外域中的插入核苷酸。在一个实施方案中，突变是插入编码衰变促进因子(decayaccelerationfactor，DAF)的第311-319位氨基酸残基的核苷酸，所述衰变促进因子插入在弹状病毒糖蛋白近膜胞外域的丝氨酸残基之间(SEQIDNO22)。在另一个实施方案中，弹状病毒糖蛋白的近膜胞外域的编码区中的突变导致具有相应于SEQIDNO15、19、20或22的氨基酸序列的突变体。在另一个实施方案中，弹状病毒基因组可进一步包含在基质蛋白(M)中的突变或缺失。应理解在弹状病毒G蛋白的近膜胞外域中的突变，如在弹状病毒M蛋白中的一样，可导致G近膜胞外域/M蛋白编码区的部分缺失或完全缺失，这被认为是本发明的一部分。相似地，G近膜胞外域/M蛋白编码区内的插入突变也是本发明的一部分。本发明也涵盖了导致丧失弹状病毒G近膜胞外域/M蛋白的功能或改变其表达的突变，并包含本发明的额外的实施方案。在一个实施方案中，尽管本发明提供了水泡性病毒和狂犬病毒属的任何病毒的应用，但本发明利用的重组弹状病毒衍生自疱疹性口腔炎病毒(VSV)。水泡性病毒属病毒包括疱疹性口腔炎病毒(VSV)NewJersey血清型(VSVNJ)，Indiana血清型(VSVInd)，VSV-Alagoas毒株，Cocal病毒，Jurona病毒，Carajas病毒，Maraba病毒，Piry病毒，Calchaquivirus，YugBogdanovac病毒，Isfahan病毒，Chandipura病毒，Perinet病毒和Porton-Svirus(RoseandWhitt.INB.N.FIELDS′VIROLOGY4thED.VOL.1(2001))。狂犬病毒属病毒包括狂犬病毒(RV)，Lagosbat病毒，Mokola病毒，Duvenhagevirus，Obodhiang病毒和Kotonkan病毒(ID.)。在另一个实施方案中，本发明提供了如上述重组弹状病毒科病毒，其进一步包含编码异源融合促进多肽(fusion-facilitatingpolypeptide)的核酸序列。在本发明的另一个实施方案中，编码融合促进多肽的核酸序列可以从独立的转录单位中表达。如本文所用，术语“融合促进多肽”是指在液胞膜的表面上表达后促进液胞膜与包围靶小泡或细胞的脂双层融合的任何蛋白质(或其融合促进多肽片段)。在本发明的另一个实施方案中，融合促进多肽是(1)衍生自特征在于具有脂质包膜的病毒；及(2)当在遗传工程化的病毒中表达作异源蛋白质时，促进病毒包膜与细胞膜的融合，导致在参与膜之间的完整双层融合。因此期望本发明的融合促进多肽可以非特异性方式促进除了天然病毒附着蛋白质之外的病毒包膜上的附着蛋白质的缔合。如本发明所预期的，融合促进多肽的一个实例是在文献中已知是副粘病毒SV5毒株的“F蛋白”的病毒包膜融合蛋白，在本文其被特异性称作“F蛋白”而不是更普通的“融合蛋白”。除了猿猴病毒5(SV5)-衍生的F蛋白之外，融合促进多肽可选自HIV包膜蛋白，以及VSVGNJ(NewJersy血清型)或VSVGIND(Indiana血清型)蛋白。融合促进多肽还包括与上述融合多肽呈现至少70％氨基酸序列同源性的多肽，以及在刺激靶细胞与重组弹状病毒科病毒融合及表达本发明的核酸序列方面呈现显著功能同源性的多肽。应理解刺激膜融合的任何蛋白质或其片段以及这些蛋白质及其片段的同源物的用途均被认为在本发明范围内，而且这些蛋白质可以是原核或真核来源的。通过本领域技术人员熟知的蛋白质进化技术衍生的蛋白质和多肽在本发明的范围内。在一个实施方案中，重组弹状病毒科病毒可进一步表达至少一个异源(即另一种非弹状病毒)蛋白质。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒可进一步包含一个调节元件。在一个实施方案中，基于其中表达基因产物的细胞类型，或者在另一个实施方案中，基于所需要的基因产物表达水平，在用本发明的重组弹状病毒科病毒肝的细胞中选择调节基因产物表达的核苷酸序列(其在本文中称作“调节元件”，例如启动子和增强子序列)。根据本发明的这个方面，基因产物相应于如本文所述的异源蛋白质。在一个实施方案中因此可实现对这种异源蛋白质的表达加以调节。例如，可以使用已知授予与该启动子连接的基因的细胞类型特异性表达的启动子。特异于成肌细胞基因表达的启动子可以与授予基因产物肌特异性表达的感兴趣基因连接。本领域已知的肌特异性调节元件包括来自如下基因的上游区域肌营养不良蛋白基因(Klamutetal.，(1989)Mol.CellBiol.92396)，肌酸激酶基因(BuskinandHauschka，(1989)Mol.CellBiol.92627)和肌钙蛋白基因(MarandOrdahl，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.856404)。本领域已知特异于其它细胞类型的调节元件(例如针对肝特异性表达的白蛋白增强子；针对胰岛细胞特异性表达的胰岛素调节元件；多种神经细胞特异性调节元件，包括神经肌营养不良蛋白，神经烯醇化酶和A4淀粉状蛋白启动子)。在另一个实施方案中，可以使用可指导基因在多种不同细胞类型中组成型表达的调节元件，如病毒调节元件。通常用于驱动基因表达的病毒启动子的例子包括衍生自多形瘤病毒，腺病毒2，巨细胞病毒和猿猴病毒40及逆转录病毒LTRs的那些。在另一个实施方案中，可以使用提供了与其连接的基因可诱导表达的调节元件。可诱导的调节元件(例如可诱导启动子)的应用使得可以调节细胞中基因产物的产生。用于真核细胞中的潜在的有效可诱导调节系统的例子包括激素调节的元件(例如见Mader，S.andWhite，J.H.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA905603-5607)，合成的配体调节的元件(见例如，Spencer，D.M.etal1993)Science2621019-1024)和电离辐射调节的元件(例如见Manome，Y.Etal.(1993)Biochemistry3210607-10613；Datta，R.etal.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA891014-10153)。可以揭示另外的组织特异性或可诱导的调节系统以根据本发明加以应用。在一个实施方案中，异源蛋白质可用作治疗性蛋白质。术语“治疗性”是指异源蛋白质当在需要其的个体中表达时，其表达提供了一种有益作用。在一些情况中，蛋白质是治疗性的，其中其发挥代替这种蛋白质在个体中缺乏表达或缺乏合适的表达的功能。一些实例包括其中该蛋白质的表达不存在的情况，如在通过外源蛋白质的表达补偿内源无效突变体的情况中。在其它实施方案中，内源蛋白质被突变，并产生一种非功能性蛋白质，通过异源功能性蛋白的表达而补偿。在其它实施方案中，将异源蛋白质的表达加上低内源水平，导致给定的蛋白质的表达累加增强。在一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括细胞因子，如干扰素或白细胞介素，或其受体。细胞因子的表达缺乏与疾病的易感性相关，增强的表达可导致对许多感染的抗性。细胞因子的表达模式可以被改变以产生有益作用，如针对Th1类型表达模式，或者在感染或自身免疫疾病中Th2模式的免疫应答偏差，其中改变的表达模式可为宿主提供益处。将缺失糖蛋白(G)的重组VSV工程化以表达和分泌单链IL-12F，其产生大量的细胞因子(实施例9)。共同给予VSVΔG-IL-12F与利斯特菌属抗原产生强力的利斯特菌属特异性T细胞介导的免疫应答，授予与在用LMAg+rIL-12免疫的小鼠中观测的结果相似的长期活性、保护性利斯特菌属免疫性(实施例10和11)。在一个实施方案中，提供了一种缺失G糖蛋白的重组弹状病毒，并工程化表达细胞因子。细胞因子可以是白细胞介素或干扰素或化学引诱物。在一个实施方案中，细胞因子是白细胞介素2，白细胞介素4，白细胞介素12或干扰素-γ。在另一个实施方案中，工程化表达细胞因子的重组弹状病毒被突变或缺失基质蛋白。在另一个实施方案中，工程化表达细胞因子的重组弹状病毒被突变或缺失糖蛋白(G)的近膜胞外域。应理解本发明的任何重组弹状病毒可进一步工程化表达细胞因子，这些被认为是本发明的一部分。在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括酶，如参与糖原贮存或分解的酶。在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括转运蛋白，如离子转运蛋白例如CFTR，或者葡萄糖转运蛋白，或者其缺陷或不适当的表达导致多种疾病的其它转运蛋白。在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括一种受体，如参与细胞内信号转导的受体。一些实例包括如上述细胞因子受体leptin受体，转移受体等，或者在细胞中其表达缺乏或表达改变导致不适当的或不充分的信号转导的任何受体。在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可包括一种肿瘤抑制基因或者原编程性细胞死亡(proapoptotic)基因，其表达改变胞内癌症相关事件的进展。例如，p53可在细胞中表达，表明早期肿瘤转化事件，从而抑制癌症进展。在另一个实施方案中，表达的治疗性蛋白质可选自天然或非天然的胰岛素，淀粉酶，蛋白酶，脂肪酶，激酶，磷酸酶，糖基转移酶，胰蛋白酶原，糜蛋白酶原，羧肽酶，激素，核糖核酸酶，脱氧核糖核酸酶，三酰甘油脂肪酶，磷脂酶A2，弹性蛋白酶，淀粉酶，凝血因子，UDP葡糖醛酸转移酶，鸟氨酸转氨甲酰酶，细胞色素p450酶，腺苷脱氨酶，血清胸腺因子，胸腺体液因子，胸腺生成素，生长素，生长调节素，共同刺激因子，抗体，集落刺激因子，红细胞生成素，上皮生长因子，肝红细胞生成因子(hepatopoietin)，肝细胞生长因子，白细胞介素，干扰素，反生长因子(negativegrowthfactors)，成纤维细胞生长因子，α家族的转化生长因子，β家族的转化生长因子，胃泌素，胰泌素，缩胆囊素，促生长素抑制素，5-羟色胺，P物质和转录因子。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒进一步包含插入编码标记多肽的一个异源核酸序列。标记多肽可包含例如绿色荧光蛋白(GFP)，DS-Red(红色荧光蛋白)，分泌型碱性磷酸酶(SEAP)，β-半乳糖苷酶，萤光素酶，或者本领域技术人员已知的任何其它报道蛋白。将治疗性蛋白质特异靶向于特定的细胞是希望的。在另一个实施方案中，除了治疗性蛋白质的表达之外，一种靶蛋白质被表达，由此本发明的重组弹状病毒科病毒被定向于其中发生治疗性蛋白质表达的特异性位点。在一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒靶向于肿瘤细胞，其表达例如表面标记erbB。这种erbB+细胞反过来被称作“靶细胞”，因为这些细胞是重组弹状病毒科病毒最后与之融合的细胞群。靶细胞通常表达一个表面标记(本文称作“靶抗原”)，其可被用于将重组弹状病毒科病毒定向于所述细胞，与相邻细胞相反，其不是肿瘤细胞源的并因此不表达erbB。靶抗原可以是受体，因此“反受体(antireceptor)”也是指“附着蛋白质”，意味着如上述在重组弹状病毒包膜或者细胞表面上展示的蛋白质，负责病毒颗粒/修饰的细胞附着于其在靶细胞膜上的相应“受体”。例如，副粘病毒SV5的天然反受体是病毒HN蛋白，其结合宿主细胞膜上的唾液酸。因此实现的融合是通过病毒包膜上的附着蛋白质(或反受体)与细胞膜上相关受体的结合而介导的。如本文所用，术语“附着”是指在感染期间反受体(在病毒颗粒脂质包膜或工程化细胞表面表达)识别并结合靶细胞表面“受体”的作用。本领域技术人员意识到附着在附着膜与靶细胞质膜融合之前发生。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒表达反受体，其通过反受体与在感染的细胞表面表达的病毒蛋白质结合而将重组物定向于病毒感染的细胞。在这种情况中，促进重组弹状病毒科病毒与病毒感染的细胞融合的反受体将识别并结合病毒表达的表面蛋白。例如，HIV-1感染的细胞可表达HIV-相关蛋白质，如gp120，并因此重组弹状病毒科病毒表达CD4通过CD4-gp120相互作用而促进靶向于HIV感染的细胞。反受体蛋白质或其多肽片段可以设计成增强与如下病毒家族的成员感染的细胞融合沙粒病毒科病毒，布尼亚病毒科病毒(Bunyaviridae)，冠形病毒科病毒，线状病毒科病毒，黄病毒科病毒，疱疹病毒科病毒，嗜肝DNA病毒科病毒，正粘病毒科病毒，副粘病毒科病毒，痘病毒科病毒，逆转录病毒科病毒和弹状病毒科病毒。另外的病毒靶向试剂可衍生自如下非洲猪热病病毒，Borna病病毒，X肝炎病毒，HIV-1，I型人T淋巴细胞病毒(HTLV-1)，HTLV-2，15慢病毒，Epstein-Barr病毒，乳头瘤病毒，单纯疱疹病毒，乙型肝炎和丙型肝炎病毒。在另一个实施方案中，靶向病毒感染的细胞可以通过重组弹状病毒科病毒/重组病毒包膜上病毒共同受体的额外表达以增强与感染的细胞的融合促进而实现。在一个实施方案中，将重组弹状病毒科病毒/重组病毒工程化以进一步表达HIV共同受体，如CXCR4或CCR5。在胞内感染期间表达的细菌蛋白质预期也是通过本发明的重组弹状病毒科病毒/重组病毒而进行治疗性干涉的潜在靶位。所述胞内细菌可包括志贺氏菌(Shigella)，沙门氏菌(Salmonella)，军团菌(Legionella)，链球菌(Streptococci)，分枝杆菌(Mycobacteria)，弗朗西丝氏菌(Francisella)和衣原体(Chlamydiae)(见G.L.Mandell，″IntroductiontoBacterialDisease″INCECILTEXTBOOKOFMEDICINE，(W.B.SaundersCo.，1996)1556-7)。这些细菌期望在重组弹状病毒科病毒/重组病毒附着的感染细胞的表面上表达细菌相关的蛋白质。在另一个实施方案中，所述靶向部分可包括整联蛋白或MHC的II型分子，其可以在感染的细胞如专门的抗原呈递细胞上被上调。存在于细胞内的寄生物的蛋白质也预期是所述重组弹状病毒科病毒/重组病毒感染的靶位。预期的胞内寄生物包括例如原生动物。感染细胞的原生动物包括疟原虫(Plasmodium)属的寄生物(例如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)，间日疟原虫(P.Vivax)，卵型疟原虫(P.ovale)和三日疟原虫(P.malariae))，锥虫(Trypanosoma)，弓形虫(Toxoplasma)，利什曼原虫(Leishmania)和隐孢子虫(Cryptosporidium)。发生病变的和/或异常的细胞可通过上述方法使用本发明的重组弹状病毒科病毒靶向。预期的发生病变的或异常的细胞包括感染的细胞，赘生性细胞，前赘生性细胞，炎症病灶，良性肿瘤或息肉，褐斑(cafeaulaitspots)，粘膜白斑病或其它皮肤痣。本发明的重组弹状病毒科病毒可以使用反受体靶向，其将识别并结合其在病变的或异常细胞上表达的相关受体或配体。在另一个实施方案中，作为结果，病变的和/或异常细胞可以独特地易受重组弹状病毒侵入和细胞裂解的影响。在一个实施方案中，非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒只单独对病变的和/或异常细胞是致细胞病变的。在一个实施方案中，将非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒进一步工程化以表达一种异源蛋白质。在一个实施方案中，异源蛋白质可包含上述所有的实施方案。在另一个实施方案中，非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒可包含本文所示所有实施方案，包括进一步弱化，如在弹状病毒糖蛋白表达中掺入并发缺失或其片段，如G的近膜胞外域。相似地，可以通过本领域熟知的方法将细胞工程化以表达弹状病毒基因组组分。在一个实施方案中，包含缺失的或突变的弹状病毒M蛋白的核酸载体进一步包含在G的近膜胞外域中的缺失，或者在另一个实施方案中进一步缺失G。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒可以工程化为表达一种抗体或其多肽片段，一种双重功能抗体，Fab，Fc，Fv，或单链Fv(scFv)作为其附着蛋白质。可以构建这种抗体片段以鉴别和结合一种特异性受体。这些抗体可以是人源化的，人或嵌合抗体(讨论和附加参考见S.L.Morrison″AntibodyMolecules，GeneticEngineeringof，″inMOLECULARBIOLOGYANDBIOTECHNOLOGYACOMPREHENSIVEDESKREFERENCE1995；S.D.Gilliesetal，(1990)Hum.Antibod.Hybridomas1(1)47-54；E.HARLOWANDD.LANE，ANTIBODIESALABORATORYMANUAL(1988)ColdSpringHarborPress，NY)。已经报导了使用痘苗病毒在病毒表面上表达功能性单链抗体(M.C.Galmicheetal，(1997)J.Gen.Virol.783019-3027)。利用相似的方法产生表达融合促进蛋白和抗体或抗体片段的重组弹状病毒。编码定向例如在细胞表面表达的肿瘤相关抗原(TAA)(例如前列腺特异性抗原(PSA))的单克隆抗体的基因，可以分离并用于生产希望的重组弹状病毒，或者亚克隆入一个合适的表达载体中并在细胞表面表达，通过本领域技术人员熟知的方法进行。抗体的实例包括与恶性前列腺上皮反应但与良性前列腺组织不反应的那些抗体(例如ATCCNo.HB-9119；ATCCHB-9120和ATCCNo.HB-11430)，或者与恶性乳腺癌细胞反应但与正常乳腺组织不反应的那些抗体(例如ATCCNo.HB-8691；ATCCNo.HB-10807和21HB-108011)。本领域技术人员熟知与病变组织反应而与正常组织不反应的其它抗体或其片段。在另一个实施方案中，本发明预期的重组弹状病毒科病毒可以表达至少一种免疫原性的蛋白质。如本文所用，术语“免疫原性”是指激发免疫应答的能力。本发明的重组弹状病毒科病毒可以激发细胞介导的免疫应答，或者激发传统上被称为“体液免疫应答”的抗体介导的免疫应答，或者这两者。在一个实施方案中，进一步编码免疫原性蛋白质或肽的本发明的重组弹状病毒可用于生产疫苗，作为预防感染的一个手段。重组弹状病毒科病毒，VSV仅是一个实例，是作为疫苗载体的最有希望的候选物。VSV具有仅含有5个基因的一个简单的基因组。随着反向遗传学(reversegenetics)的出现，有可能产生编码异源抗原性蛋白质以及免疫调节性蛋白质的重组弹状病毒科病毒。VSV基因组可以适应相对大的插入而不影响病毒复制或装配的能力。由于VSV的棒状形态，因此核糖核壳核心和病毒颗粒自身是可伸展的。例如，在基因组中加入额外的基因，则颗粒可简便地加长(18)。第三，插入VSV中的外源基因中突变的累积十分低，以允许在无数的病毒传代后外源基因仍长期表达(19)。第四，由于VSV具有一个非片段化的负链RNA基因组，而且病毒的复制只在细胞质中发生并只涉及RNA中间物，因此病毒基因组不可能整合入宿主细胞DNA中。因此，消除了其它基于DNA的载体的插入诱变。另外，VSV可以有效地感染多种不同的细胞类型并具有在其正常复制周期期间有效停止宿主细胞蛋白质合成的能力，同时表达大量的病毒编码的蛋白质(18-20)。在动物中，VSV感染示出激发特异于由重组病毒编码的蛋白质的强免疫应答(21)。另外，在世界的大部分地区罕见VSV感染人(22)，因此现有的免疫性罕见干涉基于VSV的疫苗。非致细胞病变的弹状病毒科病毒和细胞至细胞播散能力降低的弹状病毒科病毒是用作疫苗输送载体的非常有吸引力的候选物。例如后者的弹状病毒科病毒产生从感染的细胞中释放的子代病毒体，其不能再感染邻近的细胞。包含弹状病毒M蛋白和G蛋白或其片段和/或G的近膜胞外域中突变或缺失的本发明的重组弹状病毒科病毒是弱化的病毒。因此掺入这样突变或缺失的弹状病毒科病毒例如提供了安全性因素增强的一种病毒载体，在一个实施方案中，其用于无免疫应答的个体，用于利用所述载体作为基因输送运载体或疫苗的应用中。在另一个实施方案中，进一步编码一种免疫原性蛋白质或肽的本发明的重组弹状病毒可用作治疗剂，作为中断疾病进展或消除疾病严重性的手段。可以在本发明的构建体中掺入额外的弱化分子。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒可以在包含所述产物的细胞中表达一种自杀基因，导致细胞死亡。如本文所用，术语“自杀基因”是指编码一种产物的核酸，其中所述产物通过自身或者在存在其它化合物的情况中导致细胞死亡。自杀基因的一个代表性实例是编码单纯疱疹病毒的胸苷激酶的基因。额外的实例是水痘带状疱疹病毒的胸苷激酶和细菌基因胞嘧啶脱氨酶，其以将5-氟胞嘧啶转变为高胞毒性的化合物5-氟尿嘧啶。自杀基因可通过将前体药物转变为胞毒性的产物而产生胞毒性。如本文所用，术语“前体药物”是指可以转变为对细胞是毒性产物的任何化合物。这种前体药物的代表性实例是丙氧鸟苷(gancyclovir)，其在体内通过HSV胸苷激酶而被转变为毒性化合物。随后丙氧鸟苷衍生物对细胞是毒性的。前体药物的其它代表性实例包括无环鸟苷(acyclovir)，FIAU[1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶]，针对VZV-TK的6-甲氧基嘌呤阿拉伯糖苷和针对胞嘧啶脱氨酶的5-氟胞嘧啶。在一个实施方案中，通过在本发明的构建体内掺入一个自杀基因提供了一种额外的安全因素。在另一个实施方案中，在细胞内掺入自杀基因导致靶向的胞毒性，当需要靶细胞裂解时则其提供了一种治疗方案。在另一个实施方案中，这种掺入可用于抗癌应用，由此通过本发明的重组弹状病毒科病毒特异性靶向癌细胞，并且癌细胞特异性裂解可以通过掺入自杀基因而受影响。在另一个实施方案中，利用本发明的重组弹状病毒科病毒，其中当产生所谓的“Th1”型应答对个体有益时，重组物在已经产生所谓的“Th2”型应答的疾病中进一步表达激发“Th1”应答的免疫原性蛋白质或多肽。免疫原性蛋白质或多肽的导入导致Th1型应答的转变。如本文所用，术语“Th2型应答”是指通过T辅助细胞激发的一种细胞因子表达的模式，作为获得性免疫应答的一部分，支持强壮的抗体应答的产生。典型地，Th2型应答例如在个体中对蠕虫感染是有益的。典型地，Th2型应答是例如通过白细胞介素-4或白细胞介素10的产生而识别的。如本文所用，术语“Th1型应答”是指通过T辅助细胞激发的一种细胞因子表达模式，作为获得性免疫应答的一部分，支持强细胞介导免疫的产生。典型地，Th1型应答例如在个体中对胞内感染是有益的。典型地，Th1型应答例如是通过白细胞介素-2或干扰素-γ的产生而识别的。在另一个实施方案中，出现相反现象(reverseoccurs)，在已经产生Th1型应答时，当Th2型应答为个体提供了一种更有益的结果时，通过本发明的重组病毒/弹状病毒科病毒，核酸，载体或组合物导入免疫原性蛋白质或多肽使得转向更有益的细胞因子分布图。一个实例是在麻风病中，其中本发明的重组病毒/弹状病毒科病毒，核酸，载体或组合物表达来自麻风分枝杆菌(M.leprae)的一个抗原，其中该抗原刺激Th1细胞因子转变，导致结核样型麻风，与瘤型麻风相反，这是与Th2型应答相关的一种更严重的疾病形式。应理解表达免疫原性蛋白质的本发明的重组弹状病毒科病毒在免疫个体以预防疾病和/或减轻疾病和/或改变疾病进展方面的任何应用都被认为是本发明的一部分。刺激希望的保护性免疫应答的感染性病毒的实例包括逆转录病毒科(例如人免疫缺陷病毒，如HIV-1(也称作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV或HIV-III；及其它分离株，如HIV-LP；微小RNA病毒科(Picomaviridae)(例如脊髓灰质炎病毒，甲型肝炎病毒；肠道病毒，人柯萨奇病毒，鼻病毒，艾可病毒群)；Calciviridae(例如导致胃肠炎的毒株)；披盖病毒科(例如马脑炎病毒，风疹病毒)黄病毒科(例如登革病毒，脑炎病毒，黄热病毒)；冠形病毒科(例如冠形病毒)；弹状病毒科(例如疱疹性口腔炎病毒，狂犬病毒)；线状病毒科(例如埃博拉(ebola)病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；Bungaviridae(例如Hantaan病毒，bunga病毒，白蛉病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血热病毒)；呼肠病毒科(例如呼肠病毒，环状病毒和轮状病毒)；双RNA病毒科；嗜肝DNA病毒科(乙型肝炎病毒)；细小病毒科(细小病毒)；乳多空病毒科(乳头瘤病毒，多瘤病毒)；腺病毒科(主要为腺病毒)；疱疹病毒科(单纯疱疹病毒(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒，巨细胞病毒(CMV)，疱疹病毒)；痘病毒科(天花病毒，痘苗病毒，痘病毒)及虹彩病毒科(例如非洲猪热病毒)，及未分类的病毒(例如海绵性脑病的致病因素，丁型肝炎的致病因素(被认为是乙型肝炎病毒的缺陷卫星)，非甲、非乙型肝炎的致病因素(类别1＝内在传播的；类别2＝非肠道传播的(即丙型肝炎)；诺沃克及相关病毒，及星状病毒)。刺激希望的保护性免疫应答的感染性细菌的实例包括幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)，布氏疏螺旋体(Borelliaburgdorferi)，侵肺军团菌(Legionellapneumophilia)，分枝杆菌属(Mycobacteriasps)(例如结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈登分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)，单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcuspyogenes)(GroupAStreptococcus)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(GroupBStreptococcus)，链球菌(Streptococcus)(viridansgroup)，粪肠球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcusbovis)，链球菌(Streptococcus)(厌氧属(anaerobicsps.))，肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，致病性弯曲菌属(pathogenicCampylobactersp.)，肠球菌属(Enterococcussp.)，衣原体属(Chlamidiasp.)，流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillusantracis)，白喉棒杆菌(corynebacteriumdiphtheriae)，棒杆菌属(corynebacteriumsp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringers)，破伤风梭菌(Clostridiumtetani)，产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturellamultocida)，拟杆菌属(Bacteroidessp.)，具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，苍白密螺旋体(Treponemapallidum)，极细密螺旋体(Treponemapertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，衣氏放线菌(Actinomycesisraelli)和土拉热弗朗西丝氏菌(Francisellatularensis)。刺激希望的保护性免疫应答的感染性真菌的实例包括新型隐球酵母(Cryptococcusneoformans)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)，粗球孢菌(Coccidioidesimmitis)，皮炎芽生菌(Blastomycesdermatitidis)，砂眼披衣菌(Chlamydiatrachomatis)，白色假丝酵母(Candidaalbicans)。其它感染性生物体(即原生生物)包括疟原虫属(Plasmodiumsp.)，利什曼原虫属(Leishmaniasp.)，血吸虫属(Schistosomasp.)和弓形虫属(Toxoplasmasp.)。在另一个实施方案中，表达免疫原性蛋白质的本发明的重组弹状病毒科病毒进一步表达额外的免疫调节蛋白质。有用的免疫调节蛋白质的实例包括细胞因子，趋化因子，补体成分，免疫系统辅助和粘着分子及其人或非人动物特异性的受体。有用的实例包括GM-CSF，IL-2，IL-12，OX40，OX40L(gp34)，淋巴细胞趋化因子(lymphotactin)，CD40和CD40L。进一步的有用实例包括白细胞介素，例如白细胞介素1-15，干扰素-α、β或γ，肿瘤坏死因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，趋化因子如中性粒细胞激活蛋白(NAP)，巨噬细胞化学引诱物和激活因子(MCAF)，RANTES，巨噬细胞炎症肽MIP-1a和MIP-1b，补体成分及其受体，或者辅助分子如B7.1，B7.2，TRAP，ICAM-1、2或3及细胞因子受体。OX40和OX40-配体(gp34)是免疫调节蛋白的进一步的有用实例。在另一个实施方案中，免疫调节蛋白可以是人或非人动物特异性的，并可包含与天然发生的蛋白质有相似结合活性的胞外结构域和/或其它片段。在另一个实施方案中，免疫调节蛋白可包含上述实施方案的突变形式，或者包含具有多肽序列如免疫球蛋白重链恒定区的融合蛋白。在一个构建体内可掺入多个免疫调节蛋白，这也代表了本发明的一个额外的实施方案。应理解本发明的重组弹状病毒科病毒可表达多个免疫原性蛋白质。在一个实施方案中，免疫原性蛋白质或肽衍生自相同或相关的物种。掺入多个抗原的疫苗已经示出提供了增强的免疫原性。表达免疫原性蛋白质或肽片段的本发明的重组弹状病毒科病毒可以产生可由所述构建体刺激的多种类型的免疫应答，包括对抗异源表达的蛋白质或肽，目前通过“旁观(by-stander)”作用而是免疫原性的其它抗原，对抗宿主抗原及其它抗原的应答，这也代表了本发明的另外的实施方案。预期本发明的方法可用于预防或治疗个体的细菌性、病毒性、寄生物性或其它疾病状态，包括肿瘤。组合疫苗已经示出提供了增强的免疫原性和保护性，同样地，在另一个实施方案中，免疫原性蛋白质或肽衍生自不同的物种。在另一个实施方案中，本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸或其片段的重组病毒，其中所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变。重组病毒中的弹状病毒基因组或其片段，及缺失或突变的弹状病毒基质蛋白可包含本文所列出的所有实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸或其片段的重组病毒，其中所述弹状病毒基因组或其片段除了弹状病毒M蛋白内的突变之外，还包含在编码糖蛋白(G)的区域内的缺失或突变。在另一个实施方案中，本发明提供了包含弹状病毒基因组的核酸的重组病毒，其中所述弹状病毒基因组包含在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变。在另一个实施方案中，重组弹状病毒除了在弹状病毒M蛋白中的突变之外，还包含在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变。本文所述的重组病毒可包含关于本发明的重组弹状病毒科病毒所列出的所有实施方案，这代表了本发明的另外的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码非致细胞病变的弹状病毒的基因组的多核苷酸序列的一种分离的核酸分子，该多核苷酸序列包含在编码基质蛋白(M)的基因中的缺失或突变。应理解所述分离的核酸分子可包含本文所列出的所有实施方案，包括编码异源蛋白质表达、G主干多肽和融合促进多肽表达的序列，及G糖蛋白表达中缺失和糖蛋白的近膜胞外域中的缺失的序列，每个分子均代表本发明的另外的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了包含本发明所述分离的核酸分子的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码弹状病毒基因组的多核苷酸序列的一种分离的核酸分子，其中所述多核苷酸序列在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因中有缺失或突变。根据本发明这个方面的分离的核酸分子可包含本文所列出的实施方案，包括编码异源蛋白表达、融合促进多肽表达的序列，及基质蛋白表达中突变或缺失的序列，每个分子均代表本发明的另外的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了包含这种分离的核酸分子的载体。如本文所用，术语“核酸”分子包括但非限于原核序列，真核mRNA，来自真核mRNA的cDNA，来自真核(例如哺乳动物)DNA的基因组DNA序列，及甚至合成的DNA序列。该术语还指包括DNA和RNA的任何已知的碱基类似物的序列。本文所述的核酸序列可以在一个特定载体内亚克隆，根据在细胞内导入序列的方法进行。一旦核酸片段被亚克隆入特定的载体中，则该载体成为重组载体。为产生本发明的核酸构建体，编码感兴趣的序列的多核苷酸片段可以连接入适于转导/转化哺乳动物细胞及适于指导所转导的细胞内重组产物表达的可商购的表达载体中。应意识到这种可商购的载体系统可通过常用的重组技术修饰以置换，复制或突变现有的启动子或增强子序列和/或导入任何附加的多核苷酸序列，如编码附加的选择标记的序列或编码报道多肽的序列。本领域有许多技术将上述重组载体导入本发明的细胞中，例如但非限于直接的DNA吸收技术，及病毒、质粒、线性DNA或脂质体介导的转导，利用磷酸钙介导的和DEAE-葡聚糖介导的导入方法的磁穿孔方法，电穿孔，脂质体介导的转染，直接注射，及受体介导的吸收(详见例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPress，CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates，(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition，Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)，或者其它标准实验手册)。也可以用核酸包被的粒子轰击。特定的表达载体系统的效力及将核酸导入细胞的方法可以通过本领域中常用的标准方法评估。例如，导入细胞中的DNA可以通过滤膜杂交技术(例如Southern印迹)检测，由导入的DNA转录产生的RNA可以例如通过Northern印迹、RNase保护或逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测。基因产物可以通过合适的分析检测，例如通过例如用特异性抗体对产生的蛋白质进行免疫学检测，或者通过功能性分析以检测基因产物的功能活性，如酶学分析。如果细胞表达的感兴趣的基因产物不易分析，表达系统首先可使用与所用的调节元件和载体连接的报道基因最佳化。报道基因编码可易于检测的一种基因产物，因此可用于评价该系统的效力。本领域中使用的标准报道基因包括编码β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶和人生长激素或者本文列出的任何标记蛋白的基因。在另一个实施方案中，构建了一个包装系统，其包含在弹状病毒M蛋白中包含突变或缺失的cDNA，其可作为弱化的另一种方式。包装系统是一个载体，或多个载体，其共同提供产生病毒体所需要的可表达形式的所有遗传信息，其可以壳体化(encapsidate)核酸，将其从产生病毒体的细胞中转运，传输至靶细胞，并且在靶细胞中促进转基因表达。然而，包装系统必须基本上不能包装其自身，因此提供一种弱化方式，因此在导入靶细胞中后预防病毒体产生。在另一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述重组弹状病毒科病毒，病毒，载体或核酸的细胞。在一个实施方案中，所述细胞是原核细胞，或者在另一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。应理解本文针对重组弹状病毒科病毒，病毒，载体和/或核酸所列出的每个实施方案均可以在细胞内掺入，并且均代表了本发明的一部分。重组弹状病毒或病毒颗粒是本发明的相似的另外的实施方案，并可以包含本文所列出的任何改变。因此，可以制备、装配和分离重组弹状病毒科病毒和/或颗粒。在一个实施方案中，由此制备的重组弹状病毒科病毒和/或颗粒不是致细胞病变的。在另一个实施方案中，弹状病毒M蛋白中的突变或缺失产生一种仅在高度恶性的细胞中具有致细胞病变作用的病毒。这种弹状病毒株的应用可提供一种优选的特异性恶性细胞裂解的方式，而对相邻细胞无作用。在另一个实施方案中，在弹状病毒M蛋白中掺入突变或缺失是进一步弱化掺入弹状病毒基因组的任何构建体的一种方式，因为其胞毒性作用仅限于高度恶性的细胞。产生重组弹状病毒的方法可限定利用cDNA和小病毒(Minivirus)或辅助细胞系。在这种情况中，“小病毒”和“辅助细胞”(也称作辅助细胞系)提供了进行弹状病毒病毒体装配的弹状病毒蛋白质的来源，其不从编码弹状病毒蛋白质的基因的转染的DNA中产生。重组弹状病毒的产生可如下完成(1)单独的cDNA；(2)组合转染入辅助细胞中的cDNA；或者(3)转染入细胞中的cDNA，将其进一步用小病毒感染，提供产生感染性或非感染性重组弹状病毒需要的剩余成分或活性。使用任何这些方法(例如小病毒，辅助细胞系或仅用cDNA转染)，所需要的最基本的成分是含有顺式激活信号的RNA分子，以(1)通过弹状病毒N蛋白壳体化基因组(或反基因组)RNA，及(2)复制基因组或反基因组(复制中间物)RNA等价物。需要DNA以产生重组弹状病毒短语产生感染性弹状病毒“所必需的cDNA”是指产生表达突变的基质蛋白(M)的感染性重组弹状病毒颗粒所需要的核酸分子。术语“小病毒”是指包括不完整病毒颗粒，其含有编码N-P-M-L，N-P-L，N-P-G-L，M-G，仅仅G，仅仅M或者四或更少的弹状病毒基因的任意组合的一种多顺反子核酸分子。这种不完整的病毒颗粒不能进行病毒复制，复制是包含其基因组完整拷贝的弹状病毒生命周期的一个过程。称作“弹状病毒复制”的弹状病毒基因组的拷贝需要存在复制元件或复制子，其在此意味着在5’和3’末端最少含有弹状病毒的前导序列和非转录尾区序列的一个RNA链。在基因组意义中，前导序列在3’末端，非转录尾区在5’末端。位于这两个复制信号之间的任何RNA将依次被复制。前导序列和非转录尾区另外必须含有最小的顺式激活元件，以进行由N蛋白的壳体化和聚合酶结合，这是开始弹状病毒转录和复制所必需的。已经产生了一些不同的VSV衍生的复制子，并已经示出在培养的细胞中延长时间地复制并表达异源(非VSV)蛋白质。这种复制子是基因治疗载体的理想候选物，因为它们只在细胞质中复制，这样消除了由其它基因治疗载体引起的靶细胞染色体中插入诱变。另外，尽管在感染的细胞中尝试证明任何类型的重组，但没有迹象表明基于VSV的复制子可经历同源(或异源)重组。不能重组的能力消除了复制和感染性能力由其它负链RNA病毒对含有复制子的细胞感染而重建的问题。为产生本发明的重组弹状病毒，上述编码修饰的弹状病毒基因组的cDNA必须与细胞在促进所用载体表达的条件下接触，使得重组弹状病毒产生。应理解利用上述三种方法任一种允许重组弹状病毒装配的任何细胞都包括在本发明范围内。培养细胞产生病毒将转染的细胞通常在希望的温度(一般为37℃)保温至少24小时。为产生感染性病毒颗粒，收获含有重组病毒的上清并移至新鲜的细胞中。将表达G蛋白(通过瞬时或稳定转染)的新鲜细胞保温大约48小时，收集上清。重组弹状病毒的纯化术语“分离”弹状病毒是指培养并纯化病毒颗粒由此剩余非常少的细胞碎片的过程。一个实例是收集含有病毒体的上清并过滤(0.2μ孔径)(例如Millex-GS，Millipore)上清，由此除去痘苗病毒和细胞碎片。或者，病毒体可使用梯度如蔗糖梯度纯化。重组弹状病毒颗粒然后可被沉淀并重悬于希望的赋形剂或载体中。病毒效价可通过用于感染细胞的上清系列稀释液测定，因此在病毒蛋白质表达之后，感染的细胞通过使用例如抗M(23H12)或抗N(10G4)蛋白特异性抗体(L.Lefrancoisetal.，(1982)Virology121157-67)进行间接免疫荧光测定而量化。因此应理解重组弹状病毒颗粒是本发明的一部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产非致细胞病变的重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码弹状病毒蛋白的经遗传修饰的核酸，所述弹状病毒蛋白包括基质蛋白(M)内的突变或缺失，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入一个编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括基质蛋白(M)内的突变或缺失，插入一个编码标记多肽的多核苷酸序列及一个含有弹状病毒复制的顺式激活信号的至少3’和5’弹状病毒前导序列和非转录尾区的多顺反子cDNA；(B)在选择所述细胞的非致细胞病变表型的条件下培养细胞；(C)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养所述细胞；及(D)分离所述非致细胞病变的重组弹状病毒。在一个实施方案中，所述方法包括从本发明的分离的重组弹状病毒科病毒中分离基因组RNA的步骤。在另一个实施方案中，分离基因组RNA的步骤是通过RT-PCR进行的。在另一个实施方案中，用于进行生产方法的细胞选自啮齿类动物，灵长类动物和人体细胞。在另一个实施方案中，通过本发明所述方法产生了具有G糖蛋白中突变或缺失的非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒。根据本发明的这个方面，如述将编码弹状病毒蛋白的一个多核苷酸序列插入细胞中，所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)内的突变或缺失。在一个实施方案中，糖蛋白中的突变或缺失是在糖蛋白的近膜胞外域中。在另一个实施方案中，通过本发明的方法产生了进一步表达编码第二种多肽的一个异源核酸序列的非致细胞病变的重组弹状病毒科病毒。根据本发明的这个方面，如述将编码至少一个异源多肽的一个多核苷酸序列插入细胞中。在一个实施方案中，所述第二种多肽是治疗性多肽。在另一个实施方案中，所述第二种肽是免疫原性的。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码在糖蛋白(G)的近膜胞外域内包含缺失或突变的弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞内插入一个编码弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，所述弹状病毒蛋白包括糖蛋白(G)的近膜胞外域内的缺失或突变，插入一个编码标记多肽的多核苷酸序列及一个包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的至少3’和5’弹状病毒前导和非转录尾区的多顺反子cDNA；(B)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养细胞；及(C)分离所述重组弹状病毒。为感染细胞(如组织培养细胞或来自组织样品如活检组织的细胞)，使用本领域已知的技术将分离的重组弹状病毒与细胞保温。对重组弹状病毒的感染的检测可通过确定报道基因如绿色荧光蛋白(GFP)的存在而进行，或者通过评估病毒蛋白表达，如通过上述间接免疫荧光测定方法进行。为制备感染性病毒颗粒，首先将一种合适的细胞系(例如BHK细胞)用痘苗病毒vTF7-3感染(T.R.Fuerstetal.，(1986)Proc.NatlAcad.Sci.USA3.8122-26)，或者用编码T7RNA聚合酶或其它合适的噬菌体聚合酶如T3或SP6聚合酶的等价物感染(见Usdinetal.，(1993)BioTechniques14222-224或Rodriguezetal.(1990)J.Virol.644851-4857)。或者可以利用无痘苗病毒系统，其提供了一种RNA聚合酶。然后将细胞用含有编码N，P，G和L弹状病毒蛋白的基因的各个cDNA转染。这些cDNA提供了建立重组弹状病毒颗粒的蛋白质。细胞可以通过本领域已知的任何方法转染(例如脂质体转染，电穿孔等)。本发明进一步涉及包含一或多个容器的诊断和药物包装和试剂盒，所述容器中充填了一或多种本发明的上述载体、病毒或组合物的成分。在另一个实施方案中，本发明提供了包含本文所述的重组病毒，弹状病毒科病毒，核酸或载体的组合物，以给予细胞或多细胞生物体。在另一个实施方案中，本发明的载体可以与未灭菌或灭菌的一或多个载体组合应用，以给予细胞，组织或生物体，如与适于给药的药物载体组合给予个体。这种组合物包含例如一种介质添加剂或一种治疗有效量的本发明的重组病毒及一种药物可接受的载体或赋形剂。这种载体可包括但非限于盐水，缓冲盐水，葡萄糖，水，甘油，及其组合物。制剂应适于给药模式。本发明的重组病毒，载体或组合物可单独应用，或者与其它化合物如额外的治疗性化合物联合应用。所述药物组合物可以任何有效的常规的方式给予，包括例如通过静脉内给药(i.v.)、肌内给药(i.m.)、鼻内给药(i.n.)、皮下给药(s.c.)、口服给药、直肠给药、阴道内输送，或者通过其中重组病毒/组合物可输送至组织的任何方式给予(例如通过针或导管给药)。或者，针对插入上皮细胞可选用局部给药。另一种给药方法是通过吸入或气雾剂给药。为给予哺乳动物特别是人，期望医生来确定实际剂量和治疗持续时间，这样将最适于个体并可以随着年龄，体重及特殊个体的应答而变化。应用的重组弹状病毒的给予途径促进病毒循环，附着和感染，从而使得病毒表达编码的蛋白质，这可以通过在重组弹状病毒内掺入报道蛋白而分析。期望在给予弹状病毒后，病毒蛋白表达应在24小时内发生并确定在36小时内发生(例如通过报道蛋白检测而确定)。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫个体抗一种疾病的方法，包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触，从而对疾病产生免疫，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变，及编码能在靶细胞内表达的一种免疫原性蛋白质或肽片段的异源基因。如本文所用，术语“接触靶细胞”是指直接和间接将靶细胞暴露于本发明的病毒，核酸，载体或组合物。在一个实施方案中，接触细胞可包括通过本领域熟知的任何方式直接注射细胞，如显微注射。在另一个实施方案中，间接提供给细胞，如通过在细胞周围的培养基中提供。将本发明的病毒，核酸或载体导入靶细胞的方案可包括例如直接DNA吸收技术，病毒、质粒、线性DNA或脂质体介导的转导，或转染，应用磷酸钙介导的和DEAE-葡聚糖介导的导入方法的磁穿孔方法，电穿孔，直接注射，及受体介导的吸收(进一步详见例如″MethodsinEnzymology″Vol.1-317，AcademicPress，CurrentProtocolsinMolecularBiology，AusubelF.M.etal.(eds.)GreenePublishingAssociates，(1989)andinMolecularCloningALaboratoryManual，2ndEdition，Sambrooketal.ColdSpringHarborLaboratoryPress，(1989)，或者其它标准实验手册)。应理解本发明涵盖了本发明的病毒，核酸或载体浸入细胞内的任何直接或间接方式，并均代表了本发明的一个实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有疾病的个体的方法，所述方法包括将个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，从而治疗疾病，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变及编码能在靶细胞内表达的免疫原性蛋白质或肽片段的一个异源基因。根据本发明的这个方面，在另外的实施方案中，靶细胞是上皮细胞、肺细胞、肾细胞、肝细胞、星形胶质细胞、神经胶质细胞、前列腺细胞、专门的抗原呈递细胞、淋巴细胞或M细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗患有与缺陷基因相关的疾病的个体的方法，所述方法包括将个体的靶细胞与治疗有效量的本发明的重组非致细胞病变的弹状病毒，或包含弹状病毒基因组的重组病毒，载体或细胞或编码弹状病毒基因组的核酸序列接触的步骤，从而治疗疾病，其中弹状病毒的基因组包括在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变及能在靶细胞内表达的一个异源基因。根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中，重组非致细胞病变的弹状病毒可进一步包含在弹状病毒糖蛋白的近膜胞外域中的突变或缺失。应理解由此所用的重组弹状病毒科病毒，病毒，载体或细胞可包含本文所列出的任何实施方案或其组合。根据本发明的这个方面，因此可治疗的疾病可包括但非限于肌营养不良，癌症，心血管疾病，高血压，感染，肾病，神经退行性疾病如阿尔茨海默氏病，帕金森病，亨廷顿舞蹈症，克雅氏病，自身免疫疾病如狼疮，类风湿性关节炎，心内膜炎，葛雷夫斯氏病或ALD，呼吸系统疾病如哮喘或囊性纤维化，骨病如骨质疏松症，关节疾病，肝病，皮肤病如银屑病或湿疹，眼病，耳鼻喉科疾病，其它神经系统疾病如Turret综合征，精神分裂症，抑郁症，孤独症或中风，或者代谢疾病如糖元累积症(glycogenstoragedisease)或糖尿病。应理解其中寻求通过应用本发明的重组弹状病毒科病毒，病毒，载体或细胞或组合物可实现特定蛋白质表达的任何疾病均被认为是本发明的一部分。在一个实施方案中，根据本发明的这个方面，靶细胞是上皮细胞，肺细胞，肾细胞，肝细胞，星形胶质细胞、神经胶质细胞或前列腺细胞。根据本发明这个方面的方法可提供上述任何的治疗应用，每种方法均代表本发明的另一个实施方案。应理解本发明的重组病毒，细胞，载体，核酸或组合物的任何治疗性应用均被认为是本发明的一部分并且是本发明的实施方案。在另一个实施方案中，本发明提供了一种免疫个体抗一种疾病的方法，包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，从而对疾病产生免疫，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括在编码基质蛋白(M)的区域中的缺失或突变和/或在糖蛋白(G)的近膜胞外域中的突变或缺失及一个编码能在细胞内表达的免疫原性蛋白质或肽片段的异源基因。在另一个实施方案中，本发明的重组弹状病毒科病毒，及病毒，载体，细胞和组合物可作为有效的抗癌治疗剂。用不同量rVSV感染的癌细胞如C6神经胶质瘤细胞导致在72小时内大约90％的细胞死亡(实施例12)。然而，由于VSV感染的结果，在培养物中对健康细胞的损害显而易见。在这方面，缺失G的重组VSV则对邻近的健康细胞无作用，该病毒裂解作用特异性于神经胶质瘤细胞。根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中，提供了一种癌细胞裂解的方法，包括将癌细胞与本发明的重组弹状病毒接触的步骤，其中弹状病毒包含(a)包含弹状病毒基因组的核酸，其中弹状病毒基因组包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)一个非弹状病毒核酸。在用VSV感染后，经干扰素-β预处理导致特异性神经胶质瘤细胞裂解(图36)，对其自身切片中的正常神经元细胞的感染非常少。因此，在其它实施方案中，非弹状病毒核酸编码一种细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中，在用本发明的重组弹状病毒科病毒感染之前、期间或之后将一种另外的治疗化合物与细胞接触。在一个实施方案中，治疗化合物是核苷类似物。在另一个实施方案中，治疗化合物是细胞骨架抑制剂，如微管抑制剂。在一个实施方案中，癌细胞包含弥漫的癌细胞，或者在另一个实施方案中，癌细胞是实体瘤组织细胞类型。在另一个实施方案中，癌细胞可以是在肿瘤发生的任何阶段及任何来源的。另外，缺失G表达(ΔG)的VSV毒株表明在经该病毒感染后显著缩小在体内的肿瘤负载(load)，而且如果在其自身的切片培养物中发生对正常细胞感染也是非常少的(实施例13，图39D)。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗癌症的方法，包括将癌细胞与重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，所述弹状病毒基因组或其片段包含在编码基质蛋白(M)的区域内的缺失或突变和/或在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的缺失或突变；及(b)一个非弹状病毒核酸。在其它的实施方案中，非弹状病毒核酸编码一种细胞因子或自杀基因。在另一个实施方案中，本发明提供了一种研究神经组织中肿瘤发生的模型，包括如下步骤获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动切片，将所述切片在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养，用标记的癌细胞接种所述切片培养物并确定标记的癌细胞的死亡情况。在一个实施方案中，所述模型进一步包括用重组弹状病毒接种切片培养物的步骤。在另一个实施方案中，重组弹状病毒针对弹状病毒M蛋白被突变或缺失。在另一个实施方案中，编码弹状病毒M蛋白的核苷酸序列突变或缺失的重组弹状病毒针对编码弹状病毒G蛋白的核苷酸序列进一步被突变或缺失。在另一个实施方案中，重组弹状病毒针对弹状病毒G蛋白的近膜胞外域被突变。在另一个实施方案中，所述模型利用经荧光、发光、生色或电子致密材料标记的癌细胞。在另一个实施方案中，所述模型利用标记的重组弹状病毒。在另一个实施方案中，将被认为增强或抑制肿瘤发生的试剂供给培养物，并确定对标记的癌细胞的作用。在一个实施方案中，所述试剂是细胞因子，趋化因子，促炎分子，血管生成因子，血管生成抑制因子，离子载体，微管抑制剂或细胞周期抑制剂。在另一个实施方案中，在本发明提供的模型中评估改变肿瘤发生或疑似改变肿瘤发生的试剂。根据本发明的这个方面，在加入癌细胞之后或同时将该试剂供给切片培养物。在一个实施方案中，确定对癌细胞存活性的作用。在另一个实施方案中，确定对癌细胞增殖的作用。在另一个实施方案中，确定对癌细胞表面标记表达或细胞周期阶段的作用。这种作用易于通过本领域技术人员熟知的方法测定，包括但非限于测定染料的吸收作为存活力的测定，例如锥虫蓝排除，细胞增殖的测定可通过例如测定3H-胸苷的吸收而确定，细胞表面标记表达和细胞周期阶段可通过FACS确定，及其它本领域技术人员熟知的方法。根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中，将切片在包含Gey′s/右旋糖溶液，血浆，凝血酶，Eagle′s基础培养基，Hanks′平衡盐溶液，L-谷氨酰胺，或其任何组合的培养基中在保持存活力的条件下在盖玻片上培养。根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中，将切片在包含胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷，尿苷，5-氟-2′-脱氧尿苷，Gey′s/右旋糖溶液，血浆，凝血酶，Eagle′s基础培养基，Hanks′平衡盐溶液，L-谷氨酰胺或其任意组合的培养基中在抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养。在一个实施方案中，所述模型使得可以分析对正常组织的毒性及潜在的肿瘤治疗效力，这可以同进行研究，在另一个实施方案中，可以进行实时研究。在一个实施方案中，器官型切片培养使得在利用该模型的任何给定研究期间可以保持在体内正常存在的解剖学连接方面适当的神经元结构，并因此实际上接近在体内脑的细胞，结构和生理学状况(23-32)。在其它实施方案中，所述模型可用于进行所需的脑组织的药理学，生理学和结构学研究，并可在另一个实施方案中，在体内进行相似的研究中用作对比的来源，。在另一个实施方案中，所述模型的培养系统可用于短期研究，或者在另一个实施方案中，所述模型系统可用于长期研究，而不丧失细胞完整性或电生理学应答。在另一个实施方案中，本发明提供了一种鉴别具有肿瘤消解活性的试剂的方法，包括如下步骤获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动切片，在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养所述切片，用标记的癌细胞接种所述切片培养物，将所述接种的培养物与候选试剂培养，并确定癌细胞存活力，其中癌细胞存活力降低表明该候选试剂具有肿瘤消解活性，从而鉴别具有肿瘤消解活性的试剂。在一个实施方案中，癌细胞是神经元来源的，例如神经胶质瘤细胞。根据本发明的这个方面，在另一个实施方案中，癌细胞可用荧光、发光、生色或电子致密标记进行标记。在另一个实施方案中，所述方法进一步包括用标记的重组弹状病毒接种切片培养物的步骤。在另一个实施方案中，根据本发明的这个方法进一步包括将接种切片培养物与一种细胞因子一起培养的步骤。在一个实施方案中，所述细胞因子是干扰素，白细胞介素，化学引诱物，如肿瘤坏死因子，或移动抑制因子或巨噬细胞炎症蛋白。应理解本文所列出的关于重组弹状病毒科病毒、切片模型的任何实施方案均代表了鉴别具有肿瘤消解活性的试剂的方法的另外的实施方案。在另一个实施方案中，表达一种异源蛋白的本发明的重组病毒，核酸或载体可用作蛋白质表达系统。将该构建体稳定导入细胞内可提供一种高产量生产表达的蛋白质的手段。以下实施例是为了更充分地例证本发明的一些实施方案。然而这些实施例无限制本发明范围之意。实施例实施例1VSV的M蛋白中的突变产生感染性、非致细胞病变的病毒材料和方法进行表达GFP基因的VSV的定点诱变。然后将BHK-21细胞用突变的VSV感染。通过超速离心从细胞培养上清中浓缩病毒颗粒并分离病毒RNA。使用反转录-PCR获得NCP-12变体的全长cDNA。将M基因和cDNA进行自动序列分析。在指定时间通过荧光显微术确定培养的感染的BHK-21(MOI为10)细胞和细胞感染性及形态学。将圆形的细胞从培养物中吸出并将培养物用轻轻抽吸洗涤若干次，然后保温并周期性检测。7天后，检测到培养物中存在GFP阳性细胞，表明感染，收获培养上清，等份用于感染新鲜细胞。用培养上清感染24小时后，检测细胞的GFP表达情况。将细胞还用3％低聚甲醛固定，用1％TritonX-100透化，随后用与Alexa568染料(MolecularProbes)缀合的N蛋白特异性单克隆抗体(10G4，LefrancoisandLyles，(1982)wereVirology121157-167)探查感染迹象。将BHK-21细胞也在盖玻片上生长并用2μg的pCAGGS-Mwt，pCAGGS-NCP-12.1或pCAGGS-MCS质粒，使用于Optimem(GibcoBRL)中的10μllipofectamine(GibcoBRL)进行瞬时转染。在转染后24小时，将细胞用3％低聚甲醛固定，用1％TritonX-100透化并用经罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体标记的M特异性单克隆抗体(23H12)探查M蛋白的表达。将MNCP12.1cDNA针对含有4个鉴别的突变的M基因进行克隆，将突变的基因用野生型M基因置换以通过标准方法确定重组病毒回收，经显微镜检测回收的病毒的表型。结果先前的迹象提示两种N末端截短的M蛋白(称为M2和M3)引起在VSV感染的细胞中见到的致细胞病变作用(CPE)。根据图1所示进行VSVM蛋白突变体的分离。通过消除两个翻译起始密码子，不再产生M2和M3蛋白，并且用突变的病毒感染的细胞示出细胞变圆延迟，这是VSVCPE的一个特点(图2)。分离的重组病毒进一步编码绿色荧光蛋白(GFP)，这表明了用复制病毒感染的细胞。在24小时后，大约30％的细胞未示出明显的VSVCPE迹象。然而，将其余的大约70％的圆形细胞进一步培养，达到铺满为GFP阳性的，表明细胞含有复制病毒，其仍未被感染杀死并持续生长。为确定细胞是否产生感染性病毒，收获培养上清并将等份用于感染新鲜细胞。24小时后，新感染的细胞表明无CPE迹象，但均表达GFP，表明感染性病毒产生并可以移至初次用于实验的细胞。另外，这些细胞也产生感染性病毒并保持非致细胞病变(NCP)表型。为鉴别哪些结构域参与M蛋白诱导的致细胞病变作用，产生一些不同的M蛋白突变体。在获得的6个单独的分离株中，所有均具有相同突变。突变导致在第33位甲硫氨酸残基取代丙氨酸残基(SEQIDNO1)，在第51位甲硫氨酸取代丙氨酸残基(SEQIDNO2)。进一步的取代包括在第133位用苏氨酸残基置换丙氨酸残基(SEQIDNO3)，及在第226位用丝氨酸残基置换甘氨酸残基(SEQIDNO4)(图3)。为确定NCP表型只是由于M蛋白中的突变导致的(不是NCP病毒基因组中其它突变所致)，将cDNA针对含有4个鉴别的突变(SEQIDNO5)的M基因通过用突变基因代替野生型M基因而克隆，这称为MNCP12.1。使用标准方法回收重组病毒并检测回收的病毒的表型(图4)。重组病毒是感染性的，但在感染的BHK-21细胞中不介导细胞致细胞病变作用(图5，B和D)。尽管用复制突变病毒感染，但细胞仍保持典型的形态学(图5C)。相反，用wt-VSV感染的细胞表明与致死的VSV感染相关的典型的细胞变圆(图5A)。将BHK-21细胞也用具有野生型M蛋白的VSV，或者wt，NCP-12.1突变体的VSV瞬时转染。与野生型M相比(图6E)，突变的M蛋白表达明显增强(图6F和G)，这是由于M蛋白干扰RNA聚合酶II依赖性表达对野生型M蛋白合成抑制所致。通过野生型M蛋白介导的细胞致细胞病变作用在变圆后的细胞中很明显(图6A)，而表达NCP突变体的细胞看起来保持扁平和正常(图6B和C)。实施例2VSV的M蛋白中的突变不影响细胞向性材料和方法将如下细胞类型在感染复数为10用rVSV/MNCP12.1感染BHK，CV-1，Vero或HeLa细胞。将细胞在37℃保温12或24小时，在3％低聚甲醛中固定并用含有50mM甘氨酸磷酸盐缓冲盐水(PBS)中洗涤两次。然后通过荧光显微镜(ZeissAxiophot，WestGermany)检测细胞的GFP表达情况，并通过相差显微镜评估形态学。结果为确定非致细胞病变的rVSV/MNCP12.1是否改变细胞向性，在感染复数为10感染BHK，CV-1，Vero和HeLa细胞(图7)，感染作为GFP表达的一个函数加以确定。不管细胞类型如何，rVSV/MNCP12.1均能在细胞内感染和复制，而无任何致细胞病变作用的迹象。实施例3高级载体的研发以进行基因治疗应用材料和方法如上述产生重组VSVM突变体。生长突变的病毒并在BHK-21细胞感染期间通过与表达N，P和L蛋白的质粒共表达而回收。将突变的病毒在表达MNCP12.1的细胞中增殖。来自用rVSV-ΔM(VSV复制子)感染的细胞的上清应用于24小时前预先用5μg的pc-MNCP12.1质粒转染的细胞。将细胞在感染后24小时固定并用经罗丹明缀合的山羊抗小鼠二级抗体(JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.)标记的N特异性单克隆抗体探查。结果先前尝试回收突变或缺失M蛋白的VSV(ΔM-VSV)失败了，大概是由于M蛋白毒性作用杀死细胞从而限制了表达的M蛋白的量。为确定上述方法和毒株是否提供了一种易于可回收的载体，利用与用于回收重组VSV的标准方法相似的一种回收方案，例外的是在开始病毒回收期间将MNCP12.1与N，P和L支持质粒共表达，随后从表达MNCP12.1的细胞(或细胞系)中增殖病毒。ΔM-VSV在这些条件下是易于可回收的(图9)，并因此是一种良好的基因输送/基因治疗载体候选物。ΔM-VSV只在细胞质中复制，消除了潜在的插入诱变和转基因沉默，这通常是应用其它典型的基因输送载体如逆转录病毒基因治疗载体的副产物。实施例4缺失M和G蛋白的重组VSV感染胰岛细胞但不是致细胞病变的材料和方法征得了在UniversityofTennessee的胰岛实验室的参与患者的同意。制备胰岛细胞制品，用有复制能力的缺失M蛋白的VSV(NCP12)或用复制受限的缺失M和G蛋白的VSV(ΔG-NCP12)感染。将细胞保持在于12孔平板中的750μl体积的培养基中。在感染后，不除去病毒接种物并在感染后第3天和第8天收获胰岛进行成像以及流式细胞计量分析。将小体积的胰岛细胞从平板中除去并在1500rpm旋转5分钟。将沉淀重悬于100μlPBS中并作为悬浮液加入玻璃平板上，用玻璃盖玻片覆盖，并在40×物镜下观测。剩余物用AnnexinV染色以确定编程性细胞死亡的胰岛细胞的百分比。结果对两个样品加以研究，样品号为176和163。在这两个样品中，用缺失M蛋白的重组VSV在MOI为5进行感染，导致在感染的细胞中高水平的表达(分别为图10和11)，同时致细胞病变作用最小。G糖蛋白的缺失对感染的水平无明显作用，然而，在一般样品176中更有效地感染。用MOI为25时感染，在感染后3天，在感染速度或致细胞病变作用方面不产生可辨别的提高(分别为图12和13)。不管MOI如何，在培养物中持续8天的感染，表达无可辨别的降低(图14-17)。不管MOI如何，在感染后3天和8天检测到高水平的表达(图18-19)。因此，胰岛细胞被VSV构建体有效感染，感染导致无可辨别的致细胞病变作用，进一步强调了这种构建体作为基因输送运载体的用途。实施例5VSVG胞外域的近膜区域中的突变不影响G蛋白表达或稳定性材料和方法质粒和寡核苷酸定向诱变如先前所述，将编码VSV，血清型Indiana、毒株SanJuan的G蛋白的基因克隆入真核表达载体pXM中以产生质粒pXM-G(14)。通过寡核苷酸定向诱变构建突变体E452A(SEQIDNO6)，G456D(SEQIDNO7)，W457A(SEQIDNO8)，F458A(SEQIDNO9)和W461A(SEQIDNO10)(14)，并将突变的区域克隆入pXMG(AXB)(32)中。使用QuickChange定点诱变试剂盒根据厂商指导(Stratagene，Canada)产生双重和三重突变体，G456DW457A(DA)(SEQIDNO11)，W457AW461A(WW-AA)(SEQIDNO12)，W457AF458AW461A(AAA)(SEQIDNO13)和G456DW457DW461A(DAA)(SEQIDNO14)。pXM-G(AXB)质粒用作模板。含有希望突变的两个互补合成的寡核苷酸引物(来自McMasterUniversityCentralFacilities)使用turboPfuDNA聚合酶用于进行诱变。如先前所述构建缺失和插入突变体(32)。构建体GD9和DF440-N449通过缺失VSVG胞外域的第453-461位氨基酸(SEQIDNO15)和第440-449位氨基酸(SEQIDNO16)而产生。构建体G10DAF和GD9-10DAF通过分别在VSVG(AXB)(SEQIDNO17)和GD9(SEQIDNO18)的第464和465位氨基酸之间之间插入来自衰变促进因子(DAF)(7)的近膜区域的9个氨基酸(残基311-319)而产生。我们称这些构建体为“10-DAF”的原因是因为载体G(AXB)在TM结合处由于插入一个限制位点而含有额外的丝氨酸。嵌合的G(+9)gBG通过在VSVG的胞外域的第464位氨基酸与VSVG的细胞质尾部的第483位氨基酸之间插入单纯疱疹病毒类型1(HSV1)糖蛋白gB的721-726和773-795氨基酸而构建，由此VSVG的膜锚定(TM)结构域(残基465-482)由HSV1gB蛋白的第三个TM结构域置换(38)。这个嵌合体在ecto-TM结构域结合处含有一个额外的丝氨酸残基，以保持VSVG蛋白的读框。构建体W457-A(W1A)，W461-A(W2A)，W457W461-AA(WW-AA)，GΔ13，GSrev11，GSrev11-AA使用重叠PCR方法产生，使用质粒pVSV9.1(+)(34)作为模板。所用引物的序列在请求时可获得。然后将重叠PCR产物在6％聚丙烯酰胺凝胶上纯化，电洗脱，用独特的限制酶KpnI和NheI消化，并用于亚克隆入预先用同样的酶消化的pVSV-FL(+)2(34)中。然后将序列通过双脱氧核苷酸测序证实。另外将具有希望的突变的G基因作为MluI和NheI的片段亚克隆入修饰形式的真核表达载体pCAGGS-MCS中。构建体pVSV-DAA，-AAA，-G10DAF，-G(+9)gBG，-GΔ9，-GΔ9-10DAF和-DF440-N449通过扩增KpnI位点和3’末端之间的G基因的区域而产生，使用含有突变的G基因的相应pXM质粒作为模板，并将该区域亚克隆入pVSV-FL(+)2中。如述(33-35)仅作少量修饰进行回收病毒。简而言之，将于35mm平板中的铺满单层BHK-21细胞用编码T7RNA聚合酶的重组痘苗病毒(vTF7-3)(36)在感染复数为5，在31℃感染1小时。然后将细胞用DNA脂质体悬浮液转染，所述悬浮液由5mg的pVSV(+)-G*(*表示具有突变的G基因)，3mg、5mg、1mg和8mg的分别含有来自VSVIND的N、P、L和G基因的质粒，及90ml的TransfectACE组成(36，37)。3小时后，将转染混合物用DMEM+10％FBS置换，并将细胞在37℃保温。保温48小时后收集上清，通过0.2μm滤膜(Millipore，Millex-GS)过滤以除去痘苗病毒。将滤物用于先前已经用2mg的pCAGGS-GIND转染24小时的BHK-21细胞。通过检测细胞在VSV感染24-36小时后典型的致细胞病变作用评估病毒的回收。然后将回收的病毒经噬斑纯化，传代并分离其RNA。G基因中的突变通过RT-PCR测序证实。结果为确定VSVG的近膜区域中哪个残基对膜融合活性是重要的，进行来自不同水泡性病毒的近膜结构域的序列对比(图20)。序列对比示出这个区域在密切相关的水泡性病毒中是非常保守的，并且限定了基于这些亚结构域中保守的残基数标记为A和B的两个独特结构域。最大的保守(＞90％)在残基E437和W461之间区域中(结构域B)。残基F421和D436之间的氨基酸序列(结构域A)在VSVIndiana血清型的两个毒株(SanJuan和Orsay)中是相同的，同时与Cocal病毒有＞80％的保守，这是分类为Indiana-2血清型及另外两种Indiana血清型病毒的更不密切相关的病毒。然而，结构域A在检测的其它病毒中不是非常保守的。位于第457和461位的色氨酸(W)残基在所有检测的水泡性病毒中均是保守的。除了色氨酸残基之外，一些其它的氨基酸(H423，P424，T444，G445，N449和P450)在检测的水泡性病毒序列中也是保守的。在结构域B的起始处附近并从残基440扩展至残基445的FFGDTG(SEQIDNO19)基序在大多数密切相关的成员中是保守的，TG残基在所有检测的水泡性病毒中是不变的。为确定这些保守区域在G蛋白的膜融合活性中的作用，我们在这个区域中产生了取代，缺失和插入(图21)。在第457和461位的两个不变的色氨酸(W)残基用丙氨酸置换。相似地，保守的谷氨酸(E452)，甘氨酸(G456)和苯丙氨酸(F458)独立地用丙氨酸或天冬氨酸和丙氨酸置换。通过分别用丙氨酸置换W457和W461以及用天冬氨酸和丙氨酸置换G456和W457而构建两个双重突变体。另外，通过分别用丙氨酸置换W457，F458和W461以及通过用天冬氨酸和丙氨酸取代G455，W457和W461而产生两个三重突变体。突变体E452A，G456D，W457A，F458A，W461A，W457W-461-AA；G456D-W457A；G456D-W457A-W461A和W457A-F456A-W461A也分别称作E-A，G-D，W1A，F-A，W2A，WW-AA，DA，DAA和AAA。除了上述点突变之外，制备缺失突变体(GΔ9，其缺失氨基酸453-461(SEQIDNO15)；GΔ13，其缺失残基449-461(SEQIDNO20)；及ΔF440-N449，其缺失氨基酸440-449)(SEQIDNO16)及一些插入突变体。构建体G(AXB)在K462和S463之间导入两个额外的丝氨酸{如先前在(38)中所述}，而G10DAF和GΔ9-10DAF含有分别插入在G(AXB)和GΔ9的S464和S465之间的来自衰变促进因子(DAF)的9个氨基酸(残基311-319)。突变体G(+9)gBG在G(AXB)的胞外域和GgB3G的跨膜域之间有一个9个残基的插入(39)(SEQIDNO21)。剩余的经检测的突变体在邻近跨膜结构域具有反向的11个氨基酸的序列(Gsrev11)(SEQIDNO22)。突变体GSrev11-AA具有相同的反向的11个氨基酸并还具有两个W残基变为丙氨酸(SEQIDNO23)。使用pXM载体(11)在COS-1细胞中表达突变基因，将蛋白质用[35S]-甲硫氨酸标记，然后通过用多克隆抗G抗体免疫沉淀随后进行SDS-PAGE加以分析(图23)。所有取代突变体均与野生型G蛋白共同迁移，及相应于野生型和突变体的条带的密度相似，提示G蛋白中保守残基的取代及额外残基的缺失或插入不影响蛋白质的表达或稳定性。编码突变的G蛋白的重组病毒的回收是在开始回收及随后的扩增步骤期间通过WTG蛋白的共表达而实现的。这保证了所有病毒均可被回收，不管G蛋白突变体是否是膜融合缺陷的。实施例6突变的G蛋白的转运及细胞表面表达材料和方法使用间接免疫荧光测定检测多种G蛋白的表面表达。将细胞转染，用3％低聚甲醛固定并用G特异性单克隆抗体(mAbI1)(40)探查，随后用罗丹明缀合的山羊抗小鼠(或抗兔)二级抗体(JacksonImmunoresearchLaboratories，Inc.)探查。为量化G蛋白的表面表达，对病毒感染的细胞进行流式细胞计量分析或者对转染的COS-1细胞进行乳过氧化物酶催化的碘化(15)。为进行流式细胞计量术，将于35mm平板中的BHK-21细胞(5×105)用野生型VSV或者合适的G补足的突变体病毒感染，感染复数为10。感染后6小时，将细胞使用含有50mMEDTA的PBS从平板中移出，并通过在1250×g离心5分钟沉淀。然后在室温使用3％低聚甲醛将细胞在悬浮液中固定20分钟。将细胞用PBS-甘氨酸洗涤两次以除去固定剂。然后将细胞在室温在PBS-甘氨酸+0.5％牛血清白蛋白(BSA)(Sigma-Aldrich)中保温30分钟。在用BSA封闭后，用初级抗体I1mAb及罗丹明缀合的山羊抗小鼠抗体探查细胞。然后通过流式细胞计量术分析细胞以量化多种突变体G蛋白的表面表达水平。结果细胞-细胞融合及病毒出芽均需要病毒蛋白定位于质膜。为确定病毒蛋白是否被转运至细胞表面，进行流式细胞计量术和乳过氧化物酶催化的细胞表面碘化。突变的G蛋白在细胞表面的表达水平在野生型G蛋白表达水平的80％至＞100％之间(表1)。表1突变的G蛋白的表面表达及膜融合活件aCOS细胞用编码指定的G蛋白的pXM载体转染，将细胞进行表面碘化并如先前所述计算表面表达的相对量(15)。bBHK-21细胞用G补足的病毒感染，并在感染后6小时固定。然后将细胞用G特异性单克隆抗体I1和罗丹明标记的二级抗体染色，随后通过流式细胞计量术分析。使用下式计算相对表面表达(％突变群体中阳性细胞×突变体的平均荧光密度)/(％WT阳性细胞×WT的平均荧光密度)。c转染的COS细胞在缓冲为pH5.6的融合培养基中水浴，并如材料和方法章节中所述确定细胞-细胞的融合。dBHK-21细胞用各个病毒突变体感染并如述在缓冲为pH5.9的融合培养基中保温。数值是以与WT融合活性(设为100％)的百分比表示。N.D.＝未进行。为确定近膜区域中的突变是否影响G蛋白的胞内转运或者细胞表面定位，将野生型和突变的G蛋白均在COS-1和BHK-21两种细胞中表达。通过检测endoH抗性的获得来评估从内质网(ER)至高尔基复合体的转运。在15分钟脉冲后，所有突变体均对endoH敏感，表明它们被用N末端连接的寡糖糖基化。在追加1小时后，突变体对endoH消化抗性，表明所有突变的G蛋白均以相似的动力学从ER转运至高尔基复合体。在BHK-21细胞中表达的一些突变体的代表性实例示于图24。实施例7G蛋白缺失突变体促进膜融合的能力降低材料和方法利用病毒感染的BHK-21细胞和质粒转染的COS-1细胞分析合胞体的形成。感染6小时后除去病毒感染的细胞中的培养基，然后将细胞用经HCl滴定为指定pH(5.9，5.5或5.2)的融合培养基[10mMNa2HPO4，10mMN-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)，10mM2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)]漂洗一次，并在室温在新鲜的融合培养基中水浴1分钟。1分钟后，将融合培养基用新鲜的含有5％胎牛血清(FBS)的Dulbecco′smodifiedEagle′s培养基(DMEM)置换，并将细胞在37℃保温30分钟。然后将细胞用3％低聚甲醛固定并如上述进行免疫荧光测定。转染的COS-1细胞如前述进行处理(11)。结果为检测突变对膜融合活性的作用，进行细胞-细胞融合分析，其中将表达WT或各个G突变体的细胞用缓冲为pH5.9-4.8的融合培养基处理。当在瞬时转染的COS-1细胞中分析时，所有取代突变体均示出膜融合活性均降低至野生型活性的70％-5％范围(表1)。然而，当在病毒感染的BHK细胞中分析时，许多这些突变体(W1A，W2A，WW-AA，DAA和AAA)产生与在野生型VSV感染的细胞中见到的大小和程度相似的广泛合胞体。这种差异的基本原理还未充分了解，但其可能简单地是在病毒感染的细胞对瞬时转染的细胞中G蛋白表达水平的一个函数。与取代突变体相反，缺失和插入突变体在COS和病毒感染的BHK细胞中均只具有非常低直至不可检测的膜融合活性。突变体GΔ9，GΔ13和GΔ9-10DAF产生非常少的合胞体，当细胞暴露于pH5.9时，其仅具有3-4个核(图25A，箭头所示)。当表达这些蛋白质的细胞在缓冲为pH5.5，5.2或4.8的培养基中水浴时，合胞体的大小和数目均不增加(数据未示出)，表明合胞体形成中的缺陷不是由于pH阈值的改变所致。另外，在暴露于低pH触发点之后延长时间保温不增加可见的合胞体的数目或大小(数据未示出)。当将9或10个氨基酸插入在膜锚定结构域和胞外域的边界之间时{突变体G(+9)gB和G10DAF}，及当缺失残基F440-N449时，完全丧失膜融合活性(图25B)。这些数据提示近膜区域的序列对融合活性是关键的。在所有这些情况中，增加暴露于酸性pH的时间或者减少融合培养基的pH不增强膜融合活性。保守的近膜芳族残基(色氨酸和苯丙氨酸)及甘氨酸残基因此在病毒感染的细胞中对VSVG诱导的膜融合不是关键的，但当在COS-1细胞中瞬时表达时，可见活性有一些降低。倒置11个近膜残基序列对融合活性无显著影响。同时9个近膜氨基酸的线性顺序似乎不影响膜融合活性，这些残基是关键的，因为其缺失降低融合活性＞99％。另外，缺失13个氨基酸对由G蛋白介导的细胞-细胞融合具有相似的作用。然而，缺失F440和N449之间的区域，包括保守的FFGDTG(SEQIDNO)基序，完全消除了融合活性，示出这个亚结构域对G的融合活性是重要的。插入突变体G10DAF和G(+9)gBG的结果示出尽管这些插入不影响表面表达，但它们完全消除融合活性，表明近膜结构域与跨膜结构域的间距对膜融合活性非常重要。根据这个观点，G10DAF中近膜区域的长度通过缺失9个近膜残基而减少时(GD9-10DAF)，膜融合活性被部分恢复。综合这些结果，表明与膜锚定结构域紧邻的区域对VSVG蛋白的膜融合活性是必需的，而不同的是例如在HIV-1gp41(41)中，VSVG中保守的近膜W残基对G蛋白掺入病毒中或者对膜融合活性不是关键的。实施例8突变的G蛋白的稳定性材料和方法表达的G蛋白的寡聚状态通过如述(15，17)的蔗糖密度梯度离心而确定。如述作少量修改，对转染的细胞裂解物(15)及病毒感染的细胞裂解物(10)进行内切糖苷酶H分析。生长于35mm平板中的BHK-21细胞用合适的G补足的突变体病毒感染，感染复数为10。感染后6小时，将细胞用无甲硫氨酸的DMEM(无Met的DMEM)漂洗一次，然后在2ml无Met的DMEM中保温20分钟。在指定时间将培养基用含有55mCi的[35S]-甲硫氨酸(Translabelproteinlabelingmix，NewEnglandNuclear)的2ml无Met的DMEM更换。在脉冲时期后，将细胞立即用1ml去污剂裂解缓冲液[10mMTris(pH7.4)，66mMEDTA，1％TX-100，0.4％脱氧胆酸，0.02％叠氮化钠]裂解，或者追加含有2mM过量的非放射性甲硫氨酸的DMEM+10％FBS培养基。核和细胞碎片通过在台式微离心机(IECCentra)上以14,000rpm离心1分钟而除去。基本如前所述(42)用抗G尾部兔多克隆抗体(肽Ab#3226)进行免疫沉淀，除了核后(post-nuclear)上清是用0.3％十二烷基硫酸钠(SDS)产生的，及抗原-抗体复合物是在37℃进行1小时形成的之外。将一半的免疫沉淀物用EndoH(NewEnglandBiolabs)根据厂商指导进行消化。如述确定野生型和突变的蛋白质的胰蛋白酶敏感性(38，43)。简而言之，将转染的细胞用[35S]甲硫氨酸标记并用于2XMNT[40mM2-(N-吗啉)乙磺酸，60mMTris，200mMNaCl，2.5mMEDTA]缓冲液中的1％TritonX-100在指定pH进行裂解。裂解物在14,000g离心5分钟，并将等体积的上清在37℃在有或无10mgTPCK-胰蛋白酶的情况中保温30分钟。通过加入抑酶肽(100单位)终止消化，将混合物在14,000rpm再次离心2-5分钟以除去任何不溶物。将上清用抗G(Indiana)抗体免疫沉淀并通过SDS-PAGE分析。回收的病毒的效价通过噬斑分析确定。将于6孔平板中的BHK-21细胞(5×105)用病毒的10倍系列稀释液感染。感染后1小时，除去接种物并将细胞用含有0.9％琼脂和5％FBS的DMEM覆盖，在37℃保温36小时。在保温期间之后，计数噬斑数目并取至少两个稀释液之间的平均值。病毒效价以噬斑形成单位(PFU)/ml表示。噬斑利用Nikon数码相机使用75-200Nikorr镜头照相。然后将数码图像放大并在4×8英寸Kodak相纸上印刷。确定每个病毒至少15个噬斑的大小并加以平均。结果尽管所有突变的蛋白质均在细胞表面表达，表明它们在ER中能充分折叠并寡聚化以被转运至质膜，但我们先前已经示出一些突变在蔗糖密度梯度中可影响三聚体稳定性而不影响转运(43，44)。为确定降低膜融合活性的近膜区域中的突变是否影响三聚体稳定性，我们在酸性和中性pH进行蔗糖密度梯度离心。就检测的突变体而言，所有均示出与野生型G相似的沉降模式，除外的是G(+9)gBG，其在缓冲为pH5.6的梯度中对离心的稳定性略差(表2)。表2G蛋白突变体的寡聚化和胰蛋白酶敏感性将铺满单层的BHK-21细胞用WT或突变体病毒感染，感染复数为10。感染后6小时，将细胞放射性标记并如材料和方法章节所述追加。为进行三聚体分析，将细胞在缓冲为pH5.6的2×MNT中裂解。然后将裂解物通过缓冲为相同pH的5-20％蔗糖密度梯度离心。从底部收集级分并将G蛋白用多克隆抗VSV抗血清免疫沉淀。为进行胰蛋白酶敏感性分析，将细胞在缓冲为指定pH的1×MNT中裂解。裂解物通过离心澄清以除去细胞碎片和核。然后将上清用或不用TPCK-胰蛋白酶处理，并将G蛋白用多克隆抗VSV抗体免疫沉淀。免疫沉淀的蛋白通过SDS-PAGE解离，通过荧光照相观测并通过扫描密度计量术定量。(+++)＝95％-100％抗性；(++)＝50％-95％抗性；(+)＝10％-50％抗性；(-)＝＜10％抗性。由于G蛋白在低pH对胰蛋白酶消化变得抗性，大概是由于通过酸性pH诱导的构象变化所致(42)，因此这对确定近膜突变体的融合活性的变化是否由低pH诱导的构象变化所致很重要。我们检测了突变的和野生型G蛋白对胰蛋白酶消化的pH依赖性抗性(表2)。大多数突变体示出与野生型G蛋白观测的结果相似的胰蛋白酶抗性图谱。例如，在pH6.5，大约75-80％的突变体和野生型G蛋白对胰蛋白酶消化抗性。有两个突变体，GD9和G10DAF在pH6.5对胰蛋白酶消化抗性略低(分别为48％和40％)，而突变体G(+9)gBG示出抗性模式中明显改变，其在pH6.5对消化完全敏感而在pH5.6仅部分抗性。基于细胞-细胞融合分析的结果，我们预期编码呈现野生型G融合活性的突变体的重组病毒与野生型VSV相似生长，而具有不可检测的膜融合活性的那些病毒不用野生型G补足则不能生长。如所期望，所有点突变体，插入突变体G(AXB)，及序列反向突变体GSrev11和GSrev11-AA当在BHK-21细胞上生长时产生与野生型VSV相似的效价。然而，令人惊奇地是示出细胞-细胞融合活性＞99％降低的一些病毒(例如GΔ9，GΔ13和GΔ9-10DAF)能在BHK-21细胞上生长和传播，而不需要G蛋白的表达补足，但效价降低(图26)。缺失突变体GΔ9提供的效价始终低于野生型病毒10倍，而缺失突变体GΔ13的效价低大约100倍。GΔ9-10DAF的效价低于野生型VSV效价的大约10,000倍。根据降低的病毒效价，由这些突变体形成噬斑需要48-60小时，而野生型VSV及其它突变体在感染后24-30小时产生噬斑(表3)。表3.突变体G病毒的生长特性为确定在GΔ9，GΔ13或GΔ9-10DAF的G基因中发生的任何补足突变在回收或随后的扩增期间是否可解释在显然无可检测的膜融合活性情况中的生长能力，对这些病毒的完整G基因进行RT-PCR测序。除了那些特异性导入的突变之外，未检测到其它突变，这表明病毒的表型是由于设计的突变所致。剩余的突变体，包括G10DAF，G(+9)gBG和ΔF440-N449，是无感染性的及若不与野生型G蛋白共表达则不能在BHK-21细胞中生长，这与其缺少细胞-细胞融合活性一致。感染性的缺乏不是由于掺入病毒体中G蛋白量的差异所致，因为所有突变的G蛋白均在与WT蛋白相似的水平掺入(图27)。实施例8与细胞结合的病毒材料和方法基本如述进行出芽分析(46)。将于35mm平板中铺满的BHK-21细胞用各个突变体病毒感染，感染复数为10。在吸附后，用无血清的DMEM(SF-DMEM)漂洗平板两次并在SF-DMEM中摇动洗涤两次除去剩余接种物，每次洗涤均在37℃进行5分钟。然后将细胞在37℃于2ml的SF-DMEM中保温。保温16小时后，收获上清并通过在1,250×g离心10分钟而澄清。使用等份上清通过噬斑分析确定病毒效价。通过20％蔗糖垫在45,000rpm离心35分钟从剩余的1.5ml上清中沉淀病毒体。将病毒沉淀重悬于50ml还原样品缓冲液中。将每个样品的1/5(10ml)通过在10％聚丙烯酰胺凝胶上电泳而解离。将凝胶用考马斯(GELCODE-blue，PIERCECo.)根据厂商指导染色。将凝胶脱色并使用Nikon数码相机用35-80mmNikkor镜头照相。使用ImageQuant分析软件(MolecularDynamics)进行病毒蛋白质量化。病毒产量通过测定N蛋白条带的密度测定。结果一些突变体中膜融合活性的降低或缺乏以及病毒感染性的丧失的一个解释是突变对G蛋白与细胞结合的能力有影响。为确定突变是否影响病毒结合，将放射标记的病毒体与BHK-21细胞在缓冲为pH7.0或pH5.9的结合培养基中保温。在冰上进行结合以防止病毒体的胞吞以及在暴露于低pH后防止病毒包膜与细胞膜的融合。VSV结合在酸性pH下增强(8，47)。检测的所有突变体，除了GΔ13和ΔF440-N449之外，在pH7.0和pH5.9均与野生型VSV相似地与细胞结合(图28)。与WT相比，GΔ13和ΔF440-N449在pH7.0一致地提供提高2倍的结合；然而，在pH5.9，GΔ13结合比野生型VSV低大约10％，而ΔF440-N449结合与野生型病毒相比降低50％(图28)。这些数据表明在F440和V454之间的区域中的残基引起病毒结合，结合量降低也许部分是由于这些突变体的膜融合活性缺陷所致。插入来自DAF(G10DAF，GΔ9-10DAF)的10个氨基酸或者来自HSVgB的9个氨基酸不影响结合，表明TM和胞外域之间的残基间隔对结合不重要。基于这些结果，看来G10DAF，G(+9)gBG和GΔ9-10DAF的融合活性和病毒感染性的缺陷很可能在结合后步骤。除了影响膜融合活性之外，突变还减少从细胞中释放的病毒量。为确定GΔ9，GΔ13或GΔ9-10DAF所观测的病毒效价降低是否由于病毒出芽减少所致，我们确定了每个病毒的特异性感染性，这以病毒效价和与WT病毒相比释放的病毒相对量的比率计算。病毒效价降低的所有这三种突变体从WT感染的细胞中均产生60-90％的病毒量。因此，这些突变体在培养物中传播的能力缺陷主要是由于膜融合活性而不是病毒出芽的缺陷所致。实施例9表达IL-12F的重组VSV-ΔG材料和方法使用如下质粒通过反向遗传学产生重组VSV-ΔGpBS-N，pBS-P，pBS-L和pBS-G(编码指定的VSV蛋白的基于pBluescipt的质粒(48))。质粒pVSVΔG-PL是基于Bluescript的表达VSV-ΔG的反基因组RNA的质粒，其中G蛋白的编码区已经用一个多接头置换(49)。质粒pCAGGS-GIND是编码VSVG蛋白的Indiana血清型(GIND)的基于pCAGGS的质粒。IL-12F构建体得自Dr.RichardMulligan(HarvardUniversity)，作为pSFG-mIL12.p40.L.Δ.p35的一个成分(50)。将IL-12F构建体从亲代质粒中除去并以SmaI/SmaI片段克隆入BluescriptSK(Strategene，LaJolla，CA)中，随后以XhoI/EagI片段克隆入pVSVΔG-PL中以产生pVSVΔG-IL12F。使用前述反向遗传学策略回收表达IL-12F蛋白的重组VSV-ΔG[Takada，1997#1055；Robison，2000#1057]。这个回收系统基于在合适的宿主细胞中重组反基因组RNA的合成与VSV的结构蛋白表达的联合。编码每个需要的VSV的结构蛋白(N，P，L和G)和重组反基因组序列的基因在T7启动子的控制下在单独的基于Bluescript的质粒上编码；重组反基因组质粒称为pVSVΔG-IL12F。简而言之，将BHK-21细胞(预先用表达T7聚合酶的重组痘苗病毒感染，vTF7-3)分别与编码VSV的N，P，L和G蛋白的基于Bluescript的质粒以及编码反基因组的质粒(pVSVΔG-IL12F)共转染，比率为3∶5∶1∶8∶5。转染的细胞在无血清的DMEM(DMEM-0)中保温5小时，然后在补加10％FCS的DMEM(DMEM-10)中保温48小时。收集培养上清，过滤(0.2μm)以除去痘苗病毒体，然后覆盖在已经用pCAGGS-GIND转染的新鲜BHK-21细胞上。由于重组病毒不产生G蛋白，因此必须补给以便新出芽的病毒体是感染性的。然后将重组病毒进行噬斑纯化，扩增及在G补足的BHK-21细胞上滴定。BHK-21细胞用G补足的VSVΔG-IL12F感染(MOI＝5)并在37℃在DMEM-0中培养17小时。收集含有IL-12F蛋白的培养上清并在100,000×g在20％以上的蔗糖离心以除去ΔG病毒体。澄清的上清用三种改变的无菌PBS透析，过滤灭菌并在-85℃贮存。VSVΔG-IL-12F感染的BHK细胞培养上清的蛋白质成分以及纯化的病毒制品通过SDS-PAGE(10％)分离，使用如前述但加以修改的程序进行(51)。分离的蛋白质通过用考马斯亮蓝(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)染色进行观测。使用如前所述(52)并加以修改的方法进行Western分析。简而言之，将通过10％SDS-PAGE分离的蛋白质经电泳移至硝酸纤维膜，然后用IL-12-特异性mAb(C17.8.20.15)探查。在用TBST洗涤几次后，将膜用抗大鼠Ig过氧化物酶(SigmaChemicalCo)探查。未结合的二级Ab通过用TBST洗涤而除去，与膜结合的二级抗体使用RenaissanceWesternBlotChemiluminescence试剂系统(NENLifeScienceProducts，Inc.Boston，MA)检测。结果使用反向遗传学方法，我们构建了一种复制受限的疱疹性口腔炎病毒(VSV-ΔG)，其在复制周期期间表达大量的vIL-12F。编码IL-12F的cDNA最初由Dr.RichardMulligan及其同事构建(50)，如图28A所示。重组VSVΔG-IL12F的生产通过重组痘苗病毒(表达T7)感染的BHK细胞与编码VSVN，P，G和L蛋白的质粒(均在T7启动子控制下)以及编码重组VSV反基因组的质粒共转染而实现。图28B示出重组VSVΔG-IL12F的组构(organization)，其中反基因组质粒的G编码区已经用IL-12F编码区置换。将回收自共转染的BHK细胞的重组VSVΔG-IL12F进行噬斑纯化，扩增并在表达G蛋白的BHK细胞上滴定。所得G补足的病毒可感染细胞并复制，但当未提供G蛋白时则产生无感染性的“裸(bald)”病毒体。为产生vIL-12F，将BHK细胞用VSVΔG-IL12F感染(MOI-5)并在无蛋白质的培养基中培养17小时，然后收集培养上清并通过离心澄清(病毒体通过20％蔗糖垫沉淀)。为评价感染的BHK细胞中vIL-12F的分泌，将澄清前和澄清后的上清及病毒沉淀样品通过SDS-PAGE分析，随后用考马斯蓝染色(图29A)及用IL-12p40-特异性mAb进行Western印迹分析(图29B)。来自用VSVΔG-IL-12F感染的细胞的澄清前的上清(图29A，泳道1)表明存在除了G蛋白之外的所有VSV蛋白，以及相应于期望大小的vIL-12F(大约70kDa)的一个额外条带(一对)。Western分析证实这个显著的70kDa条带确实是vIL-12F(图29B，泳道1)。一旦上清中清除了病毒(图29A，泳道2和3；图29B，泳道2)，则澄清的上清中剩余的唯一的可检测的蛋白质是IL-12F。对病毒沉淀进行分析表明由重组VSVΔG-IL12F基因组编码的病毒蛋白(L，N和P，及M)是易于可检测的(图2A，泳道4)，但无可检测数量的vIL-12F(图29A，泳道4；图29B，泳道3)。还应指出的是如所期望的，不可检测到相应于VSVG蛋白(病毒感染性所需的表面糖蛋白)的条带。这些结果清楚地表明从VSVΔG-IL12F感染的BHK细胞中产生并分泌出了大量的vIL-12F，并且澄清的培养上清的蛋白质含量中＞95％的是vIL-12F。实施例10表达IL-12F的重组VSV-ΔG增强对利斯特菌感染的抗原特异性应答材料和方法雌性C3HeB/FeJ小鼠得自Jackson实验室(BarHarbour，ME)。为进行每个实验，使小鼠的年龄匹配，使用8-16周龄的小鼠。将小鼠圈养在小隔离(micro-isolator)笼子中，随意供给实验室食品和水。抗体的特异性和来源如下PE-缀合的抗-CD5抗体(克隆53.7.3，参见(53))和抗-CD3抗体(克隆145-2C11，参见(54))；FITC-缀合的抗CD45R/B220抗体(克隆RA3-6B2，参见(55))，抗TCRβ链抗体(克隆H57-597，参见(56))，抗γ6TCR抗体(克隆GL3，参见(57，58))，抗CD4抗体(克隆RM4-5，参见59)及抗CD8抗体(克隆53-6.7，参见60)，所有同种型对照抗体均是商购的(Pharmingen，SanDiego，CA)；抗-IFN-γ杂交瘤R4-6A2抗体(AmericanTypeCultureCollection或ATCC，Rockville，MD，ATCC#HB170)Rockville，MD(61)和XMG1.2(62)由DNAX公司(PaloAlto，CA)提供；抗小鼠IL-12杂交瘤C17.8.20.15由Dr.G.Trinchieri提供(WistarInstitute，Philadelphia，PA)。将从实验室中细胞系产生的mAb通过蛋白A或蛋白G亲和层析从培养上清中纯化(63)。纯化的抗体直接与生物素缀合以用于ELISA分析中，使用标准技术进行(63)。各个抗原/细胞因子混合物的组分及应用的免疫方案如结果章节所述。所有注射剂量均用无内毒素的PBS制备成总体积1ml，经腹膜内给予。这些研究中使用的鼠rIL-12由GeneticsInstitute(Andover，MA)友好提供。实验性单核细胞增生利斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)感染通过经i.p.注射亚致死剂量(靶剂量6×103)的活单核细胞增生利斯特氏菌菌株43251(ATCC)。将小鼠通过i.p.注射大剂量的活单核细胞增生利斯特氏菌进行攻击(针对C3HeB/FeJ小鼠靶剂量4-6×105，大约10×LD50)。将用于注射的利斯特氏菌在脑心浸液(BHI)肉汤(DifcoLaboratories，Detroit，MI)中在37℃通风生长过夜。将细菌在PBS中洗涤3次，通过光密度确定浓度，经在BHI琼脂平板上集落计数证实。热灭活的单核细胞增生利斯特氏菌(HKLM)通过将细菌在80℃保温1小时而制备。测试热灭活的细菌制品在BHI琼脂平板上的存活力。在灭活之前，将细菌洗涤三次并重悬于无LPS的PBS中。可溶的利斯特氏菌蛋白(SLP)如前所述制备(64)。简而言之，将单核细胞增生利斯特氏菌在BHI肉汤中在37℃生长过夜。细菌通过离心沉淀，在PBS中洗涤，并重悬于小体积的PBS中。然后将该悬浮液进行超声处理，通过离心沉淀颗粒并丢弃，将上清用PBS透析。然后将上清利用等密度梯度离心在氯化铯上成条带状，鉴别含有蛋白质的级分，收集并用PBS透析。腹膜溢泌物细胞(PEC)通过用补加0.06％BSA，10mMHepes缓冲液(IrvineScientific，SantaAnna，CA)，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素和10U/ml肝素的HBSS进行腹膜灌洗得自小鼠。集合免疫组所有小鼠的细胞。巨噬细胞通过在37℃保温于100mm组织培养物处理的平板(CorningInc.，Corning，NY)中的PEC(4×106/ml/孔)而分离。去除未吸附的细胞并集合，产生称作塑料未吸附的腹膜溢泌物细胞(PNA)的细胞群。在腹膜灌洗后，通过无菌解剖取出脾。将PNA悬浮于(1.5×106/ml)培养基中(补加了10％FCS，5×10-5M2-ME，0.5mM丙酮酸钠，10mMHepes缓冲液，50U/ml青霉素，50μg/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺的RPMI1640)并在24孔平板(CorningInc.，Corning，NY)中加入预先测定的最佳剂量(如图所示)的多种体外刺激物。用作体外刺激物的试剂如下ConA(2μg/ml)，购自SigmaChemicalCo.(St.Louis，MO)；HKLM(107/ml)及SLP(8μg/ml)。细胞培养物在37℃保温24小时，然后将上清冷冻(-20℃)并保存以用于IL-2和INF-γ量化分析。使用前述的生物分析(65，66)，在PNA培养上清中定量IL-2。简而言之，将PNA培养物的上清连同于总体积为200μl的培养基中的1×104HT-2细胞(IL-2依赖性T细胞系)一起移至96孔组织培养平板中，并在37℃保温。培养24小时后加入[3H]胸苷(1μCi/孔)，6-18小时后收获细胞至玻璃纤维滤膜上，使用FiltermateCellHarvester(PackardInstrumentCo.，Inc.，DownersGrove，IL)收获，并使用Matrix9600DirectBeta计数仪(PackardInstrumentCo.)计数。上清中IL-2浓度与得自含有不同浓度IL-2的孔的标准曲线相关。IL-2标准的来源是来自P815-IL-2(67)培养上清；这个上清的IL-2浓度使用所述分析与人rIL-2(得自ImmunexCorp.；Seattle，WA)的已知浓度相对比而测定。典型地，这个分析线性为大约500U/ml，低检测限度为大约5U/ml。所有分析均一式三份进行，结果以一式三份样品的平均值(±SD)表示。如Cherwinski等所述(62)，使用夹心(sandwich)ELISA分析于PNA培养物中测定IFN-γ。R4-6A2作为捕捉抗体，生物素酰化的XMG1.2作为检测抗体。使用链亲和素-过氧化物酶(SigmaChemicalCo.)扩增生物素信号，显影缓冲液(于50mM柠檬酸盐缓冲液中600μgABTS和0.02％过氧化氢)用于进行分析。在405nm的吸光度使用SpectraMax340自动平板读数器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)读数。上清中IFN-γ的浓度与得自其中不同浓度的小鼠rIFN-γ(GenzymeCorp.，Cambridge，MA)被捕捉的孔的标准曲线相关。典型地，该分析线性为大约120U/ml，低检测限度为8U/ml。所有分析均一式三份进行，结果以一式三份样品的平均值(±SD)表示。如前述进行流式细胞计量术(68，69)。简而言之，将PNA(1-5×105)与25μl预先确定的最佳浓度的荧光染料缀合的mAb一起在冰上保温30分钟，用含有3％FCS和0.1％叠氮化钠的PBS洗涤两次，并用于PBS中的1％低聚甲醛固定。将样品在FACScan(BectonDickinson&Co.，MountainView，CA)上分析，使用前向散射/侧向散射门控以选择进行分析的淋巴细胞群。同种型匹配的对照Ig用于确定每个测试抗体的背景免疫荧光水平。结果已经完好地建立了利斯特菌病(listeriosis)的鼠模型，是研究细胞介导的免疫应答的最流行的系统。已经充分证明了用亚致死剂量的活利斯特菌感染的小鼠迅速清除感染并留有长期的保护性利斯特菌免疫性(70-72)。相反，用高剂量的活利斯特菌接种小鼠导致全身性感染，特征在于细菌在脾和肝脏内2-4天的未受控制的复制，最后在感染后4-10天之间死亡(71，73)。因为脾和肝脏内细菌的数目与小鼠的免疫状况负相关，因此在感染后2-4天这些器官中利斯特氏菌的计数是确定小鼠对利斯特氏菌感染的易感性的一种公认的方法(74)。对利斯特氏菌的特异性获得性免疫的特征在于脾和肝脏中的细菌负载与在易感小鼠中观测的细菌负载相比呈2-4log10降低。还要注意到尽管已知HKLM(及其它利斯特氏菌亚基制品)当单独给予时免疫原性较差(75，76)，但这种抗原与一种有效的佐剂共同给予可导致保护性免疫应答产生(68，69，77)。因此，除了作为研究细胞介导的免疫性的模型之外，利斯特菌病的鼠模型也是评价疫苗配制品和免疫治疗策略的效力的一种极佳模型。为评估vIL-12F的佐剂性，我们用PBS，109HKLM/10μgSLP(LMAg)+PBS，LMAg+0.5μgrIL-12，LMAg+0.5μgvIL-12F或LMAg+5.0μgvIL-12F在第0，5和15天对C3HeB/FeJ小鼠(5只/组)进行免疫。在第20天处死小鼠并收集组织进行分析。PEC通过灌洗收集并集合，制备PNA群，并将PNA在体外用一系列刺激物(培养基未进一步刺激；ConA一种多克隆T细胞刺激物；及HKLM或SLP利斯特菌抗原制品)在预先确定的最佳剂量在37℃再刺激24小时。为测定免疫应答性，分析来自这些培养物的无细胞上清以确定应答指定的体外刺激物而由T细胞产生的IL-2(图30A)和IFN-γ(图30B)的量。如在先前的研究中所观测的结果所示(68，69，77)，用LMAg+rIL-12(阳性对照)免疫的小鼠产生与用次致死“免疫”剂量的活利斯特菌感染的小鼠产生的相似的利斯特菌抗原特异性T细胞。也如所期望的，用单独的PBS或用LMAg+PBS(阴性对照)免疫的小鼠不能产生任何可检测的利斯特菌特异性T细胞应答。来自接受LMAg+0.5μgvIL-12F或5.0μgvIL-12F疫苗制剂的小鼠T细胞反应性的模式与LMAg+rIL-12(阳性对照)组的T细胞产生的模式非常相似。另外，由这两个测试组产生的应答呈现略微有些vIL-12F剂量依赖性；来自接受LMAg组合较高剂量vIL-12F的小鼠的T细胞在体外用利斯特菌抗原刺激后产生较大数量的IL-2和IFN-γ。与免疫刺激的一般状况相关的这些发现是由来自每个免疫组的小鼠的脾的相对大小提示的。与两个阴性对照处理组(PBS，LMAg+PBS)相比，在每个阳性对照组(LMAg+rIL-12)小鼠以及每个用LMAg和vIL-12F免疫的小鼠中观测到脾的大小明显增加(数据未示出)。另外，vIL-12F依赖性剂量应答是明显的，因为在接受LMAg+5.0μgvIL-12F的小鼠中观测到的脾大比在接受较低剂量vIL-12F(LMAg+0.5μgIL-12F)的小鼠中观测到的结果更明显。这些结果表明vIL-12F在促进对非免疫原性抗原混合物的免疫应答的能力方面与天然的rIL-12相似。另一种测定用LMAg和vIL-12F免疫的小鼠的免疫状况的方法是进行流式细胞计量术，以鉴定每个免疫动物的腹膜腔中存在的细胞群(PNA)。对用抗CD5和抗CD45R/B220双重染色的PNA进行分析表明在用LMAg和rIL-12或vIL-12F免疫的小鼠中CD5+细胞(T细胞)的频度明显增加(3-4倍)伴随CD45R/B220+(B细胞)和CD5lo/B220lo(B1B细胞)降低(与在阴性对照免疫组的小鼠中观测的频度相比；图31A和31C)。为进一步鉴定这些动物的CD3+腹膜细胞群，将PNA用抗CD3和抗αβTCR，抗γδTCR，抗CD4或者抗CD8双重染色并进行流式细胞计量术分析(图31B)。如针对CD5染色模式所观测到的结果，CD3染色模式表明腹膜淋巴细胞群内CD3+细胞的频度在接受LMAg和rIL-12或vIL-12F的动物中与接受阴性对照制剂的小鼠相比明显较高(3-4fold)(图31B和31D)。另外，接受LMAg和rIL-12或vIL-12F的小鼠表现为腹膜αβTCR+/CD4+细胞的频度的选择性增加(分别为图31E和31F)。所报道的结果表明由共同给予LMAg和vIL-12F激发的腹膜细胞频度中的改变与经LMAg+rIL-12处理激发的改变非常相似。另外，本文中报道的接受LMAg+rIL-12(阳性对照)的小鼠表现的腹膜细胞频度中的改变与先前的观测和报道一致(68，69，77)。实施例11给予LMAg+vIL-12F授予长期的保护性利斯特菌免疫性材料和方法在从免疫/攻击受体中无菌取出后，将每个脾/肝脏使用玻璃匀浆器(groundglasshomogenizer)匀浆。细胞通过用于总体积为10ml的PBS中的0.5％TritonX-100(SigmaChemicalCo.，St.Louis，MO)处理而破坏以释放细胞内细菌。产生每个样品的10倍系列稀释液并将100μl每种稀释液均匀涂布于BHI平板上，以确定这些器官中活利斯特菌的数量。结果为确定共同给予vIL-12F和典型的非免疫原性抗原是否授予一种保护性免疫应答，将C3HeB/FeJ小鼠(5/组)用单独的PBS，LMAg+PBS，5.0μgvIL-12F+PBS，LMAg+0.5μgvIL-12F或者LMAg+5.0μgvIL-12F在第0，5和15天免疫。另外一组小鼠在第0天接受一次次致死剂量的(6×103/小鼠或者0.12×LD50)活利斯特菌(利斯特菌感染的，阳性对照)；这组小鼠用作在从利斯特菌病回收后的典型获得性免疫的基准。在第45天，将小鼠用致死剂量(6.4×105或12.9×LD50)的活利斯特菌攻击(i.p.)。在第49天处死小鼠，确定每只小鼠的脾(图32A)和肝(图32B)中的细菌负载。在接受LMAg+5.0μgvIL-12F的小鼠器官中观测到的细菌负载与PBS对照组相比明显减少(在脾和肝脏中分别减少2.72和4.12log10)。事实上，这些结果与在接受免疫剂量的活利斯特菌的动物(阳性对照组)中观测的结果相似，其中动物表现为其脾和肝脏中的细菌负载分别减少3.98和2.93log10。这些结果表明用LMAg+5.0μgvIL-12F免疫的小鼠产生一种保护性利斯特菌特异性免疫应答。用LMAg+0.5μgvIL-12F免疫表现为促进部分保护性免疫应答，这通过每只动物的脾和肝脏中的细菌负载的适度减少(分别减少1.41和2.90log10)证实。如所期望的，在用LMAg+PBS(分别减少0.37和0.45log10)或vIL-12F+PBS(分别减少0.08和0.56log10)免疫的小鼠的脾和肝脏中观测到细菌负载减少很少或不减少。这个实验中观测到的保护性免疫性(和vIL-12F依赖性剂量应答)与在用LMAg+vIL-12F免疫的小鼠中利斯特菌特异性T细胞的存在(通过体外再刺激的腹膜淋巴细胞产生的IL-2和IFN-γ而表明)非常相关。为确定用LMAg+vIL-12F免疫授予的保护性免疫性是否是长期的，将C3Heb/FeJ小鼠(5只/组)用LMAg+5.0μgvIL-12F或者合适的对照制剂在第0，5和15天免疫。另一组小鼠在第0天接受单一免疫剂量(6×103/小鼠或0.12×LD50)的活单核细胞增生利斯特氏菌(利斯特菌感染的，阳性对照)。在给予最后的加强免疫之后3个月(第120天)，每只小鼠接受(i.p.)大攻击剂量(3.8×105或7.6×LD50)的活利斯特氏菌。4天后(第124天)，处死小鼠并定量每只小鼠的脾和肝脏中的细菌负载以测定对单核细胞增生利斯特氏菌的易感性。与在上述短期保护性免疫性试验中观测到的结果(图33)相似，在用LMAg+vIL-12F(分别减少1.84和2.23log10)或免疫剂量的活利斯特菌(分别减少2.55和1.61log10)免疫的小鼠的脾和肝脏中观测到的细菌负载明显减少(与PBS处理组相比)，但在单独用LMAg或vIL-12F免疫的那些小鼠中则否(图33)。这些结果表明用LMAg+vIL-12F免疫授予与用次致死剂量活利斯特菌感染激发相似的长期保护性免疫性。实施例12rVSV-DsRed呈现在体外抗C6神经胶质瘤的强胞毒性活性材料与方法将C6神经胶质瘤细胞系(AmercianTypeCultureCollection，Manassas，VA)在37℃，5％CO2条件下，于补加了15％热灭活的马血清，2.5％热灭活的胎牛血清，100i.u./ml青霉素和1D0μg/ml链霉素的Hams/F12中保持单层培养。将C6神经胶质瘤细胞系用表达绿色荧光蛋白(GFP)的pFB逆转录病毒(Stratagene，LaJolla，CA)稳定转导，以进行增强的视分析(visualanalysis)。将用GFP稳定转导的细胞经流式细胞计量术分选以产生均匀表达高水平GFP的细胞群。为制备种植于切片培养物上的细胞，将指数生长的细胞通过EDTA/胰蛋白酶在37℃处理5分钟而收获。胰蛋白酶消化通过用上述完全培养基终止并将细胞在1000RPM离心5分钟。将沉淀重悬于无菌磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，并使用锥虫蓝染色方法计数。然后将沉淀重悬于PBS中，浓度为3×104细胞/μl，并置于冰上直至种植于切片培养物上。为跟踪实时病毒感染，我们构建了表达红色荧光蛋白DsRed的cDNA的rVSV，DsRed是衍生自有色的海葵(seaanemone)-Discosomasp.的一种可商购的色蛋白(BDBiosciences-Clontech)。将DsRed蛋白的cDNA从亲代质粒中切下并亚克隆入pVSV-MCS2.6的多克隆位点中，pVSV-MCS2.6是前述pVSV-ΔG-GSHA/GFP的亲代载体(3)。回收所得重组病毒rVSV-DsRed并使用我们实验室中预先确定的及别处所述的标准方案鉴定(78)。为构建rVSV-ΔG-DsRed，我们将DsRed的cDNA亚克隆入位于L基因上游的pVSV-ΔG-PL31的多克隆位点中。然后使用前述方法回收重组病毒rVSV-ΔG-DsRed(3)。由于ΔG-DsRed不编码病毒糖蛋白，因此将病毒在瞬时表达VSVG蛋白的细胞中增殖。因此，细胞的感染利用VSVG蛋白补足的病毒。将于补加了100U/ml青霉素和100μg链霉素，15％马血清和2.5％胎牛血清的总体积为100μl的Hams/F12培养基中C6神经胶质瘤细胞以30％，60％和90％铺满率一式三份铺板于96孔平底平板中。将细胞在37℃保温过夜以进行吸附。将培养物用不同量(101-105pfu)的rVSV-DsRed接种。加入病毒接种物后，在感染后4，8，24，36，48，72和96小时使用CeilTiter96R非放射性细胞增殖分析(G5421，Promega，Madison，WI)分析细胞死亡情况。在这个分析中，将化合物MTS[(4，5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基(sulfonphenyl))2H四氮唑(Tetrozolium)]与电子耦合试剂吩嗪硫酸甲酯以20∶1的比率混和，并加入96孔平板培养物中。MTS试剂通过活细胞被转变为在代谢活性的细胞中通过脱氢酶作用而水溶性的甲。因此活细胞的数目与产生的甲量直接成比例，在490nm读数。在每个时间点培养物中存在的活细胞的百分比通过在每种条件下得自MTS分析的490nm吸光度数值与未处理的对照细胞对比而计算，使用LabSystemsMultiskanBiochromaticElisa平板读数器(Vienna，Virginia)进行。所有描述的数值代表的是三个数据点的平均值。结果为证实C6-GFP神经胶质瘤细胞对编码DsRed的rVSV-wt感染易感，我们用101-105pfu量的病毒感染于6孔平皿中生长的细胞。图33示出在105pfu的情况中C6神经胶质瘤的感染时程。大多数细胞示出VSV感染的特征性致细胞病变作用，即细胞变圆及细胞在感染后24小时死亡。大于95％的细胞在48小时在平皿中浮起(liftoff)。用较低的病毒接种体感染产生相似的致细胞病变作用，但具有较低的动力学(数据未示出)。这些结果表明C6神经胶质瘤细胞对rVSV-DsRed感染敏感。为更好地量化VSV对C6神经胶质瘤的胞毒性程度及更特异性阐述时程，我们使用体外胞毒性分析。将C6-GFP神经胶质瘤细胞在30％，60％和90％铺满率铺板于96孔平底平板上，并用101-105pfu范围内不同量的rVSV-DsRed感染。在接种后4，8，24，36，48，72和96小时使用CellTiter非放射性细胞增殖测定分析细胞死亡情况。如图33所示，不管病毒效价如何，rVSV-DsRed导致在72小时内大约90％细胞死亡。这个结果与当细胞在30％和60％铺满率铺板时的结果相似(数据未示出)。概括而言，rVSV-DsRed示出对大鼠C6-GFP神经胶质瘤极佳的体外胞毒性活性，不管细胞密度和病毒接种体的量如何。实施例13研究基于VSV的抗神经胶质瘤治疗的效力和毒性的一种器官型切片-C6-GFP共培养物系统材料和方法器官型脑切片培养方法根据PlenzandKitai(79)介绍的方法加以改进。将1-2日龄Sprague-Dawley大鼠仔斩首，迅速取出脑，在4℃下保存在含有0.5％右旋糖的Gey′s平衡盐溶液(G9779，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)中。在Gey′s/右旋糖溶液中于振动切片机上制备冠状(coronal)切片，其中纹状体和黑质切片厚度为500微米，皮层为400微米。在解剖显微镜下切割具有感兴趣区域的切片。将皮层、纹状体以及黑质密部切成0.5-1mm大小，随后置于Millicellcultureinsert(PICM03050，MilliporeCorp.，Billerica，MA)上并浸入在盖玻片上的10微升鸡血浆(P3266，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)中。在将组织小心排列在insert上之后，加入于10微升Gey′s/右旋糖溶液中的0.5单位牛凝血酶(T6634，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)并与盖玻片上的鸡血浆混合。然后将具有组织的盖玻片放进培养试管(156758，NalgeNuncInternational，Rochester，NY)中，向每一试管中加入750微升保温培养基，其具有如下成分(全部来自InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA)50％基础培养基Eagle(BME)(21010-046)，25％Hanks′平衡盐溶液(HBSS)(24020-125)，25％马血清(26050-070)，1mML-谷氨酰胺(25030-081)和0.5％右旋糖(15023-021)。然后将试管在以0.5RPM速度旋转的传送带上于35℃保温。培养72小时后，向培养基中加入有丝分裂抑制剂混合物，其由各4.4μM的胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷、尿苷和5-氟-2′-脱氧尿苷组成。24小时后除去该混合物，并用750微升新鲜培养基更换。之后一周完全更换培养基两次。培养3周后将切片用于实验。为了产生切片-C6-GFP神经胶质瘤共培养物，将5微升体积中的150,000个GFP-阳性C6大鼠神经胶质瘤细胞在无菌条件下接种到切片上。将培养试管不加培养基水平放置在温箱中30分钟。然后更换培养基，将试管继续放置在水平位置2小时，之后重新在传送带上旋转。用Olympus荧光显微镜观察培养中的GFP阳性C6神经胶质瘤细胞的生长并用数码相机收集图像。用104噬斑形成单位(pfu)的rVSV-DsRed或106感染单位(IU)的感染性ΔG-DsRed病毒感染已经在培养物中生长至少3周的具有或不具有C6-GFP神经胶质瘤细胞的脑切片培养物。在传送带上于37℃使病毒吸附在切片上5小时。然后除去接种物，在培养基中洗切片，并将新鲜培养基加至切片。然后继续保温切片3天。对于接受IFN-β的切片，在病毒感染前18-20小时用1000U大鼠IFN-β预处理切片。然后在INF-β存在下如上所述吸附病毒。5小时后接种物用含有1000UIFN-β的新鲜培养基更换。切片在于磷酸缓冲液中的4％低聚甲醛中固定2小时并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗3次，之后将组织固定在玻片上。培养的组织在热平板上短暂地干燥，并储存于4℃备用。根据如下程序进行免疫组织化学。玻片短暂地在PBS中洗涤；用3％氢过氧化物酶和10％甲醇处理20分钟，随后用PBS洗3次；在于PBS中的2％脱脂牛奶和0.3％Triton-X中保温1小时；在含有3％驴血清和0.1％Triton-X的小鼠抗微管相关蛋白2(MAP-2，1∶500，M-4403，Sigma-AldrichCorp.，St.Louis，MO)或小鼠抗酪氨酸羟化酶(TH，1∶1,000，MAB318，ChemiconInternational，Temecula，CA)中于室温保温过夜；用PBS洗3次；在含有2％驴血清和0.1％Triton-X的CyTM2或CyTM3-缀合的AffiniPure驴抗小鼠IgG(1∶250，JacksonImmunoResearchLaboratories，Inc.，WestGrove，PA)中于室温黑暗下保温4小时；用PBS洗3次；通过分级乙醇脱水，用二甲苯脱色，并在DPX固定介质(44581，FlukaBiochemika)中固定于盖玻片上。用Bio-Rad共聚焦显微镜观察MAP-2和TH免疫反应性并用相关的共聚焦软件收集数字图像。切片中病毒感染程度用荧光显微镜通过跟踪DsRed表达而进行观察。结果建立3周的器官型脑切片-神经胶质瘤共培养物(图34)存活直至铺板后6-8周，其呈现作为切片中成熟黑质神经元指征的可证实的TH免疫染色(图34B)。图35C证实这一器官型切片培养模型中的基础MAP-2免疫反应性，并作为非特异性神经元标记，其是神经元完整性的灵敏的指示(80)。稳定表达GFP的神经胶质瘤细胞在切片组织之上自然生长并贯穿组织，这些细胞用荧光显微镜术实时跟踪(图34D和E)，其中在3-4天后，根据C6神经胶质瘤接种物大小和肿瘤细胞生长速率，可以研究切片-神经胶质瘤细胞生物学的多个方面，包括治疗剂对于肿瘤消退和切片完整性的作用。野生型VSV对于切片培养系统中的正常组织是有毒性的。rVSV-DsRed表达一种红色荧光蛋白，因此提供了一种区别于来自C6神经胶质瘤细胞的GFP(绿色)荧光的信号，这个信号在病毒感染切片培养物期间被实时跟踪。DsRed的基因被导入VSV基因组的G和L基因之间。在G和L基因之间插入一额外的外源基因对于病毒的细胞溶解性质或者复制效率没有影响(81)。在感染后，通过免疫组织化学染色检测切片培养物的MAP-2表达。rVSV-DsRed易于感染切片，并且到第3天，切片中的大多数细胞均被感染，这可以从组织中可见到红色荧光而示出(图35A)。不出所料，感染的切片的MAP-2免疫染色较弱，表示丧失了神经元组织完整性(图36A)。因此可复制的野生型VSV对于神经元组织的细胞致病性非常强，其用作肿瘤消解剂将需要应用抗病毒剂来保护正常组织对抗其毒性。已知VSV对于IFN-β的抗病毒作用非常敏感。多种谱系的恶性细胞在IFN信号传导途径中均有一或多项缺陷(82，83)，该信号传导途径最近用来开发VSV介导的细胞溶解活性的特异性肿瘤细胞靶向，同时正常组织不被影响(84，85)。因此，器官型切片共培养系统被用于确定IFN-β是否会保护正常神经组织免于VSV感染，且同时对于培养物中的神经胶质瘤细胞是毒性的。在VSV感染之前用2种不同浓度的IFN-β(100U或1000U)预处理切片培养物24小时。用1000UIFN-β预处理的培养物被保护而未被rVSV-DsRed感染(图36)。在感染前用IFN-β处理后也显著改善了MAP-2染色模式，表明VSV介导的对正常组织的细胞毒性显著降低(图37B)，并与IFN-β的抗细胞凋亡功能一致(86)。用100UIFN-β预处理是有利的，但是更高剂量会更具保护作用(数据未示出)。IFN-β单独对于切片不是毒性的，由此提供了一种有吸引力的预处理策略与可复制野生型VSV联合(图37D)。神经胶质瘤细胞生长在成熟切片培养物上，发育成可测量肿瘤块。用1000UIFN-β预处理24小时，随后用rVSV-DsRed感染，导致C6-GFP神经胶质瘤肿瘤负载降低，同时不发生rVSV-DsRed对正常组织的感染(图36)。因此，看起来rVSV-DsRed选择性摧毁C6-GFP肿瘤。令人感兴趣地，尽管在IFN-β预处理的共培养物中基本上未观察到VSV对切片的明显感染，但是切片仍然显著地被损伤，这一点由异常MAP-2染色模式而指示(图37C)。这表明尽管rVSV-DsRed能有效消除肿瘤细胞，仍然存在由不同于与病毒感染典型相关的机制介导的对切片组织的足够的损伤。复制受限型(Replication-restricted)VSV-ΔG在肿瘤细胞溶解活性方面与野生型VSV类似，但是在对器官型切片-神经胶质瘤共培养系统的毒性方面比野生型VSV优越。rVSV-ΔG是第二代复制受限型VSV。rVSV-ΔG缺少编码病毒包膜蛋白的糖蛋白(G)基因。VSV的糖蛋白(G蛋白)介导病毒附着于细胞并在病毒内吞作用后介导病毒包膜与内体膜融合，因此是VSV感染性所需的。因此，为繁殖rVSV-ΔG载体，病毒必须生长在瞬时表达野生型G蛋白的细胞中。所产生的子代病毒在病毒包膜中含有瞬时表达的G蛋白(感染性ΔG病毒)并可以正常感染细胞；但是由于这些病毒的基因组缺乏G蛋白编码区，从细胞释放的不表达G蛋白的子代病毒体是非感染性的并且不能再感染相邻细胞。因此，rVSV-ΔG载体仅经历一轮复制(例如复制受限型)。使用rVSV-ΔG的优点是避免了复制型病毒如rVSV-DsRed那样在一段时间产生的病毒颗粒的指数增加。为测试复制受限型VSV-ΔG在切片培养系统中的毒性，我们用编码DsRed的修饰的ΔG病毒(ΔG-DsRed)接种培养物并在3天后检查切片培养物。固定培养物并染色检测MAP-2以确定感染后神经元完整性。我们发现感染性ΔG-DsRed在第2天以与在rVSV-DsRed中所见相类似方式易于感染切片(图39A)。令人感兴趣地，尽管由ΔG-DsRed产生显著感染，但是MAP-2免疫反应性仍保持相对完整(图40A)。如所预测的，当切片用IFN-β预处理时极少或未观察到ΔG-DsRed所致感染(图39B)，并且MAP-2染色与未感染培养物中所见(图40B)类似。在成熟切片上生长4天的C6-GFP神经胶质瘤细胞产生可测量大小的肿瘤块，但是证实用IFN-β以1000U浓度预处理24小时随后接种106IU感染性ΔG-DsRed病毒在与ΔG-DsRed病毒保温3天后肿瘤负载显著降低(图39)。尽管由非常优异的抗肿瘤的细胞溶解活性，但是切片培养物本身的正常细胞几乎不发生感染(图39D)。因此，IFN-β预处理随后用感染性ΔG-DsRed感染选择性摧毁C6-GFP神经胶质瘤而不感染正常组织，这一点进一步由MAP-2免疫反应性结果证实(图39C)。因此，使用复制受限型ΔG-VSV联合IFN-β预处理是治疗神经胶质瘤的一种有吸引力的联合疗法。实施例14基于VSV的抗神经胶质瘤疗法的功效材料和方法用可植入导螺杆系统(implatableguide-screwsystem)(87)将细胞和病毒注射进合适的解剖学颅内区域。使用5-7周龄、体重为250-350克的成年雌性Sprague-Dawley大鼠。用氯胺酮/甲苯噻嗪溶液(200mg氯胺酮、20mg甲苯噻嗪于17ml盐水中)以0.15mg/10g体重的剂量腹膜内麻醉动物。将每只大鼠的颅区域剃除毛发并用povidine-iodine清洁。动物固定在立体定位框架中。产生一约5mm长的中线切口，移动颅外组织以定位矢状缝和前囟缝。用钻头距离中线3mm沿前囟缝产生一个毛边小洞。将一个小导管(PlasticsOne)插进该毛边小洞。用Hamilton注射器在5分钟时间内将10微升体积的磷酸盐缓冲盐水(PBS)单独或者重悬于PBS中的1×105个GFP阳性C6神经胶质瘤细胞注射进5mm深度。当到达位置后，插入导管塞子以塞住小洞。每日观察动物的感染迹象或者由肿瘤生长所致的神经功能障碍。在10天间隔后，大鼠用一剂无菌PBS或用rVSV-RFP处理。基于颅内肿瘤的预计大小选择给予rVSV-RFP的时间点。这一时间点应该是通过神经成像可以检测到肿瘤但还没有发生显著的神经功能障碍的时间点。在颅内给予病毒之前麻醉大鼠。先前的切口被重新切开，移动颅外组织以便放置导管。除去塞子，以10微升体积给予PBS或VSV。这使得病毒直接进入瘤床。还就固有毒性和减弱VSV毒性方面评价了体内IFN-β预处理。结果GFP阳性C6神经胶质瘤细胞通过预先植入的导管被输送到大鼠的额叶。在保温一段规定时间后，用导管将病毒输送至瘤床(tumorbed)。在处理后选定时间点处死动物进行分析。组织病理学研究确定细胞减灭程度和由病毒导致的CNS毒性。另外，使用如神经功能障碍和存活率等参数作为评判结果的标准。因此，证实了VSV在活CNS背景下摧毁癌细胞且不显著损伤正常组织的能力。因为使用了可复制病毒，这种病毒在肿瘤细胞被感染后会产生病毒负载的指数增加并释放子代病毒，所以一次剂量足以治疗肿瘤。这一周期可以持续进行直至大多数肿瘤被摧毁，此时免疫系统会清除剩余的病毒。但是，导管系统使得可以在一段时间内给予多次剂量，因此再次给予剂量是根除肿瘤的另一种可能做法。大鼠颅内神经胶质瘤模型可能会提供有变化的结果，因为报道了80％的成功率，在不同组之间在60-100％范围内变化。使用免疫缺陷动物(即裸大鼠)可以增加“肿瘤携带(rumortake)”成功率至接近100％并因此可以采用，但是应注意到免疫系统是这些研究的重要部分，因此它们单独不是用于研究的合适模型。使用免疫活性Sprague-Dawley大鼠的颅内神经胶质瘤模型的大量样本可以对结果有正确解读。动物根据表4被分配至各组。表4*剂量或时间点将被确定，＝是指从初次接种肿瘤细胞开始的历时时间，是指进行分析时的时间点，H肿瘤细胞、对照Rx和VSVRx将以10微升的体积经颅内给予，Φ评价使用IFNα/β预处理的VSV保护(即给予剂量和时间点)，剂量和时间点作为获得的结果的函数。X代表处理对照组的天数并取决于动物展现的疾病症状。将直接注射进脑中的VSV效果与仅用PBS的对照进行了比较。观察动物的脑炎迹象(嗜睡、进食差、体重减轻等)并在根据试验性研究结果确定的规定时间后处死动物。根据标准方案制备组织。在深度麻醉下用肝素化盐水、之后用4％低聚甲醛对大鼠进行穿心灌流。取脑，于4℃在4％低聚甲醛中固定2小时。在低温恒温器中将脑切成20微米的切片。使用不同的技术检查脑切片以寻找毒性迹象，检查包括直接荧光显微镜术检查VSV感染(监测RFP荧光或用N蛋白特异性抗体进行免疫组织化学染色)、苏木精-伊红染色观察基础神经病理学、以及肿瘤和周围实质中细胞死亡的细胞凋亡研究。图41示出了从含有显著肿瘤负荷(burden)的对照大鼠获得的数据。在初次肿瘤接种(给予病毒后7天)17天后，处死每个研究组的动物并分析肿瘤和周围组织的组织病理学特征。对诸如肿瘤大小、是否存在中线移动(midlineshift)以及瘤床是否存在坏死等重要参数进行了分析。另外，仔细观察周围正常组织以寻找与病毒相关的毒性迹象。进行脑切片检查以发现肿瘤生长证据，包括针对GFP的直接荧光显微术、苏木精-伊红染色观察基础神经病理学、针对特异肿瘤抗原的免疫细胞化学以及肿瘤和周围实质中细胞死亡的细胞凋亡研究。C6神经胶质瘤细胞中的GFP标记使得可以非常灵敏地检测和分析肿瘤块和从初始接种位点离开的细胞微群体(图42)。这一研究的一个重要方面是VSV能到达并靶向从肿瘤的原发部位逃离的细胞微群体的能力(图42)。用于此研究的由C6神经胶质瘤细胞携带的GFP标记使得能够通过组织切片用激光扫描共聚焦显微术检测甚至非常小的细胞群体，从而在大鼠神经胶质瘤模型中提供了给予rVSV的效果的全面图画。给予rVSV后的大鼠存活率也进行了测定。大鼠根据表5用PBS或VSV进行处理。表5*剂量或时间点根据试验性实验结果确定，＝是指从初次接种肿瘤细胞开始的历时时间，是指进行分析时的时间点，H肿瘤细胞、对照Rx和VSVRx将以10微升的体积经颅内给予，Φ为基于试验结果开发使用IFNα/β预处理的VSV保护的方案动物无限期培养直至肿瘤战胜了动物或者很明显动物会存活。这时处死动物并如上分析是否存在任何肿瘤残留。用VSV处理的动物的整体存活率与对照相比显著增加。权利要求1.一种重组非致细胞病变的弹状病毒，其包含弹状病毒基因组的核酸，其中所述弹状病毒基因组在编码一种基质蛋白(M)的区域内包含一个缺失或突变。2.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其在编码糖蛋白(G)的一个区域内进一步包含一个缺失或突变。3.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含一个调节元件。4.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述缺失或突变是在编码所述基质蛋白的N末端部分的区域内。5.权利要求4的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述缺失或突变是在编码所述基质蛋白的N末端部分的区域内，该区域编码核定位序列(NLS)。6.权利要求5的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述突变编码如下取代(a)在第33或51位用丙氨酸残基取代甲硫氨酸残基；或(b)在第226位用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。7.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含插入的编码第二种多肽的一种异源核酸。8.权利要求7的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述第二种多肽是治疗性多肽。9.权利要求7的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述第二种多肽是免疫原性的。10.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含插入的编码标记多肽的一种异源核酸。11.权利要求10的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述标记多肽是绿色荧光蛋白(GFP)，分泌型碱性磷酸酶，DS-红色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶或萤光素酶。12.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含插入的编码自杀基因的一种异源核酸。13.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含插入的编码细胞因子基因的一种异源核酸。14.权利要求13的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述细胞因子是白细胞介素2，白细胞介素4，白细胞介素12或γ-干扰素。15.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其进一步包含一种弹状病毒G主干多肽。16.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述重组非致细胞病变的弹状病毒被用作基因输送载体或疫苗。17.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述弹状病毒优选对赘生性细胞具有致细胞病变性。18.权利要求1的重组非致细胞病变的弹状病毒，其中所述弹状病毒基因组是疱疹性口腔炎病毒(VSV)基因组。19.一种生产非致细胞病变的重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含编码在基质蛋白(M)内包括一个缺失或突变的弹状病毒蛋白的遗传修饰的核酸，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞中插入一个编码在基质蛋白内包括一个缺失或突变的弹状病毒蛋白的多核苷酸序列，一个编码标记多肽的多核苷酸序列及一个至少包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的3’和5’弹状病毒前导和尾随区域的多顺反子cDNA；(B)在选择所述细胞的非致细胞病变表型的条件下培养细胞；(C)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养所述细胞；及(D)分离所述非致细胞病变的重组弹状病毒。20.权利要求19的方法，其中所述非致细胞病变的重组弹状病毒进一步包含编码第二种多肽的一种异源核酸序列。21.权利要求20的方法，其中所述第二种多肽是治疗性多肽。22.权利要求21的方法，其中所述第二种多肽是免疫原性的。23.权利要求19的方法，其进一步包括从所述分离的非致细胞病变的重组弹状病毒中分离基因组RNA的步骤。24.权利要求23的方法，其中所述分离基因组RNA的步骤是使用RT-PCR进行的。25.权利要求19的方法，其中所述合适的细胞选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。26.权利要求19的方法，其中所述缺失或突变位于所述基质蛋白的N末端区域内。27.权利要求26的方法，其中位于所述基质蛋白的所述N末端区域内的所述缺失或突变是核定位序列(NLS)的一部分。28.权利要求19的方法，其中所述突变是如下氨基酸取代(a)在第33或51位用丙氨酸残基取代甲硫氨酸残基；或者(b)在第226位用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。29.权利要求19的方法，其中非致细胞病变的重组弹状病毒是疱疹性口腔炎病毒(VSV)。30.一种分离的核酸分子，其包含编码非致细胞病变的弹状病毒的基因组的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在编码基质蛋白(M)的基因内具有一个缺失或突变。31.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述非致细胞病变的弹状病毒的基因组进一步包含一个遗传修饰的糖蛋白(G)。32.权利要求30的分离的核酸分子，其进一步包含一个调节元件。33.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述缺失或突变位于编码所述基质蛋白的N末端区域的区域内。34.权利要求33的分离的核酸分子，其中所述缺失或突变位于编码所述基质蛋白的N末端区域的区域内，该区域编码核定位序列(NLS)。35.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述突变编码(a)在第33或51位取代甲硫氨酸残基的丙氨酸残基；或者(b)在第226位取代丝氨酸残基的甘氨酸残基。36.权利要求30的分离的核酸分子，进一步包含插入编码第二种多肽的一个异源核酸序列。37.权利要求36的分离的核酸分子，其中所述第二种多肽是治疗性多肽。38.权利要求36的分离的核酸分子，其中所述第二种多肽是免疫原性的。39.权利要求30的分离的核酸分子，其进一步包含插入编码标记多肽的一个异源核酸序列。40.权利要求39的分离的核酸分子，其中所述标记多肽是绿色荧光蛋白，分泌型碱性磷酸酶，DS-红色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶或萤光素酶。41.权利要求30的分离的核酸分子，其进一步包含插入编码自杀基因的一个核酸序列。42.权利要求30的分离的核酸分子，其进一步包含弹状病毒G多肽。43.权利要求30的分离的核酸分子，其中所述基因组是疱疹性口腔炎病毒(VSV)基因组。44.一种包含权利要求30的分离的核酸分子的载体。45.一种重组弹状病毒，其包含弹状病毒基因组的核酸，其中所述弹状病毒基因组在编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外结构域的区域内包含一个缺失或突变。46.权利要求45的重组弹状病毒，其中所述突变编码如下取代(a)用丙氨酸残基取代色氨酸残基；(b)用丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸残基；或者(c)用天冬氨酸和丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸残基或其组合；或者(d)(a)-(c)中取代的任何组合。47.权利要求45的重组弹状病毒，其中所述突变编码如下缺失(a)编码第449-461位氨基酸残基的核苷酸或其片段；或(b)编码第440-449位氨基酸残基的核苷酸或其片段。48.权利要求45的重组弹状病毒，其中所述突变是插入编码衰变加速因子(DAF)的311-319位氨基酸残基的核苷酸，其在弹状病毒糖蛋白近膜胞外结构域的丝氨酸残基之间插入。49.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含插入的编码第二种多肽的一个异源核酸序列。50.权利要求49的重组弹状病毒，其中所述第二种多肽是治疗性多肽。51.权利要求49的重组弹状病毒，其中所述第二种多肽是免疫原性的。52.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含插入的编码标记多肽的一个异源核酸序列。53.权利要求52的重组弹状病毒，其中所述标记多肽是绿色荧光蛋白(GFP)，分泌型碱性磷酸酶，DS-红色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶或萤光素酶。54.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含插入的编码自杀基因的一个异源核酸序列。55.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含插入的编码细胞因子基因的一个异源核酸序列。56.权利要求55的重组弹状病毒，其中所述细胞因子是白细胞介素2，白细胞介素4，白细胞介素12或γ-干扰素。57.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变。58.权利要求57的重组弹状病毒，其中所述遗传修饰的基质蛋白在所述基质蛋白的N末端区域内包含一个突变。59.权利要求58的重组弹状病毒，其中所述基质蛋白的N末端区域内的缺失或突变是核定位序列(NLS)的一部分。60.权利要求45的重组弹状病毒，其进一步包含一个调节元件。61.权利要求45的重组弹状病毒，其中所述重组弹状病毒用作基因输送载体。62.权利要求45的重组弹状病毒，所述重组弹状病毒用作疫苗。63.权利要求56的重组弹状病毒，其中所述弹状病毒基因组是疱疹性口腔炎病毒(VSV)基因组。64.一种生产重组弹状病毒的方法，所述重组弹状病毒包含遗传修饰的编码在糖蛋白(G)的近膜胞外域内包括一个缺失或突变的弹状病毒蛋白的核酸，所述方法包括如下步骤(A)在合适的细胞内插入编码在糖蛋白(G)的近膜胞外域内包括一个缺失或突变的弹状病毒蛋白的一个多核苷酸序列，编码标记多肽的一个多核苷酸序列及至少包含含有弹状病毒复制的顺式作用信号的3’和5’弹状病毒前导和尾随区域的多顺反子cDNA；(B)在允许重组弹状病毒产生的条件下培养细胞；及(C)分离所述重组弹状病毒。65.权利要求64的方法，其进一步包括在所述细胞中插入编码第二种多肽的一个异源核酸序列。66.权利要求64的方法，其中所述第二种多肽是治疗性多肽。67.权利要求64的方法，其中所述第二种多肽是免疫原性的。68.权利要求64的方法，其进一步包括从分离的非致细胞病变的重组弹状病毒中分离基因组RNA的步骤。69.权利要求68的方法，其中所述分离基因组RNA的步骤通过使用RT-PCR进行。70.权利要求64的方法，其中所述合适的细胞选自啮齿类动物细胞、灵长类动物细胞和人细胞。71.权利要求64的方法，其中所述糖蛋白(G)的近膜胞外域的突变编码如下取代(a)用丙氨酸残基取代色氨酸残基；(b)用丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸残基；或(c)用天冬氨酸和丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸残基，或其组合；或(d)(a)-(c)中的取代的任何组合。72.权利要求64的方法，其中所述突变是如下的缺失(a)编码第449-461位氨基酸残基的核苷酸，或其片段；或(b)编码第440-449位氨基酸残基的核苷酸，或其片段。73.权利要求64的方法，其中所述突变是插入编码衰变促进因子(DAF)的第311-319位氨基酸残基的核苷酸，其在弹状病毒糖蛋白近膜胞外域的丝氨酸残基之间插入。74.权利要求64的方法，其中非致细胞病变的重组弹状病毒是疱疹性口腔炎病毒(VSV)。75.一种分离的核酸分子，其包含编码弹状病毒基因组的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列在编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的基因内有一个缺失或突变。76.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述糖蛋白(G)的近膜胞外域的突变包含如下取代(a)用丙氨酸残基取代色氨酸残基；(b)用丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸和/或苯丙氨酸残基；或者(c)用天冬氨酸和丙氨酸残基取代谷氨酸、甘氨酸或苯丙氨酸残基，或其组合；或者(d)(a)-(c)中的取代的任何组合。77.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述突变是如下的缺失(a)编码第449-461位氨基酸残基的核苷酸，或其片段；或(b)编码第440-449位氨基酸残基的核苷酸，或其片段。78.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述突变是插入编码衰变促进因子(DAF)的第311-319位氨基酸残基的核苷酸，其在弹状病毒糖蛋白近膜胞外域的丝氨酸残基之间插入。79.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述非致细胞病变的弹状病毒的基因组进一步包含一个遗传修饰的基质蛋白(M)。80.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述缺失或突变位于编码所述基质蛋白的N末端的区域内。81.权利要求80的分离的核酸分子，其中所述缺失或突变位于编码核定位序列(NLS)的区域内。82.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述突变编码如下取代(a)在第33或51位用丙氨酸残基取代甲硫氨酸残基；或者(b)在第226位用甘氨酸残基取代丝氨酸残基。83.权利要求75的分离的核酸分子，其进一步包含一个调节元件。84.权利要求75的分离的核酸分子，其进一步包含插入的编码第二种多肽的一个异源核酸序列。85.权利要求84的分离的核酸分子，其中所述第二种多肽是治疗性多肽或是免疫原性的。86.权利要求75的分离的核酸分子，其进一步包含插入的编码标记多肽的一个异源核酸序列。87.权利要求86的分离的核酸分子，其中所述标记多肽是绿色荧光蛋白，分泌型碱性磷酸酶，DS-红色荧光蛋白，β-半乳糖苷酶或萤光素酶。88.权利要求75的分离的核酸分子，其进一步包含插入的编码自杀基因的一个核酸序列。89.权利要求75的分离的核酸分子，其进一步包含一个融合促进多肽或反受体。90.权利要求75的分离的核酸分子，其中所述基因组是疱疹性口腔炎病毒(VSV)基因组。91.一种包含权利要求75的分离的核酸分子的载体。92.一种治疗患有与缺陷基因相关的疾病的个体的方法，包括给予所述个体的靶细胞一种治疗有效量的重组非致细胞病变的弹状病毒的步骤，其中所述弹状病毒的基因组包括位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变和/或能在靶细胞内部表达的一个异源基因，从而治疗疾病。93.权利要求92的方法，其中所述靶细胞是上皮细胞，肺细胞，肾细胞，肝细胞，星形胶质细胞，免疫细胞，神经胶质细胞，前列腺细胞，或者α、β、或δ胰岛细胞，或者腺泡细胞。94.一种免疫个体抗一种疾病的方法，包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变，和/或位于编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的一个缺失或突变，及编码能在靶细胞的内部表达的免疫原性蛋白或肽片段的一个异源基因，从而免疫个体抗一种疾病。95.权利要求94的方法，其中所述靶细胞是上皮细胞，肺细胞，肾细胞，肝细胞，星形胶质细胞，神经胶质细胞，前列腺细胞，专职抗原呈递细胞，淋巴细胞或M细胞。96.一种治疗患有一种疾病的个体的方法，包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变，和/或位于编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的一个缺失或突变，及编码能在靶细胞内部表达的免疫原性蛋白或肽片段的一个异源基因，从而治疗疾病。97.权利要求96的方法，其中所述靶细胞是上皮细胞，肺细胞，肾细胞，肝细胞，星形胶质细胞，神经胶质细胞，前列腺细胞，专职抗原呈递细胞，淋巴细胞或M细胞。98.一种治疗患有与缺陷基因相关的疾病的个体的方法，包括将所述个体的靶细胞与治疗有效量的重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含弹状病毒基因组或其片段，所述弹状病毒基因组或其片段包括位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变，和/或位于编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的一个缺失或突变，及能在靶细胞内部表达的一个异源基因，从而治疗疾病。99.权利要求98的方法，其中所述靶细胞是上皮细胞，肺细胞，肾细胞，肝细胞，星形胶质细胞，神经胶质细胞或前列腺细胞。100.一种癌细胞溶解的方法，包括将癌细胞与一种重组弹状病毒接触的步骤，其中所述弹状病毒包含(a)包含弹状病毒基因组或其片段的一个核酸，其中所述弹状病毒基因组或其片段包含位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变，和/或位于编码弹状病毒糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的一个缺失或突变；及(b)一种非弹状病毒核酸。101.权利要求100的方法，其中所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因。102.一种治疗癌症的方法，包括将癌细胞与重组病毒接触的步骤，其中所述病毒包含(a)一种包含弹状病毒基因组或其片段的核酸，所述弹状病毒基因组或其片段包含位于编码基质蛋白(M)的区域内的一个缺失或突变，和/或位于编码糖蛋白(G)的近膜胞外域的区域内的一个缺失或突变；及(b)一个非弹状病毒核酸。103.权利要求102的方法，其中所述非弹状病毒核酸编码细胞因子或自杀基因。104.一种鉴别具有肿瘤消解活性的药剂的方法，包括如下步骤获得冠(corona)、黑质和皮层组织的旋转振动切片，在保持存活力和抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养所述切片，用标记的癌细胞接种所述切片培养物，将所述接种的培养物与候选药剂培养，并确定癌细胞存活力，其中癌细胞存活力降低表明该候选药剂具有肿瘤消解活性，从而鉴别具有肿瘤消解活性的药剂。105.权利要求104的方法，其中所述癌细胞是神经元来源的。106.权利要求105的方法，其中所述神经元来源的癌细胞是神经胶质瘤细胞。107.权利要求104的方法，其中所述癌细胞是用荧光、发光、生色或电子致密标记而标记的。108.权利要求104的方法，进一步包括用标记的重组弹状病毒接种所述切片培养物的步骤。109.权利要求104的方法，进一步包括将所述接种的切片培养物与细胞因子一起培养的步骤。110.权利要求109的方法，其中所述细胞因子是干扰素。111.权利要求104的方法，其中在保持存活力的条件下在盖玻片上培养所述切片是在包含Gey′s/右旋糖溶液、血浆、凝血酶、Eagle′s基本培养基、Hanks′平衡盐溶液、L-谷氨酰胺或其任何组合的培养基中进行的。112.权利要求104的方法，其中在抑制有丝分裂的条件下在盖玻片上培养所述切片是在包含胞嘧啶-α-D-阿拉伯呋喃糖苷、尿苷、5-氟-2′-脱氧尿苷、Gey′s/右旋糖溶液、血浆、凝血酶、Eagle′s基本培养基、Hanks′平衡盐溶液、L-谷氨酰胺或其任何组合的培养基中进行的。全文摘要本发明涉及重组弹状病毒科病毒，包含其的分离的核酸，载体，细胞和组合物。重组弹状病毒科病毒，分离的核酸，载体，细胞和组合物除了表达至少一种外源核酸之外，还表达弹状病毒蛋白，该蛋白包括一种突变的基质蛋白(M)和/或一种突变的糖蛋白(G)。本发明还涉及其应用方法，包括在体内的应用，抗癌应用，如治疗神经胶质瘤。本发明的重组弹状病毒科病毒还用于基因治疗和疫苗应用中。文档编号G01N33/50GK1820078SQ03824944公开日2006年8月16日申请日期2003年9月8日优先权日2002年9月9日发明者迈克尔·A.·惠特,克林顿·S.·罗比森,希曼吉·R.·贾亚卡,马克·A.·米勒申请人:田纳西大学研究基金会