一种表达埃博拉gp蛋白的重组黄热病毒的制备方法及应用【
技术领域：
】[0001]本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种埃博拉重组病毒构建、制备方法及其在抗埃博拉血清制备中的应用。【
背景技术：
】[0002]埃博拉病毒（Ebolavirμs，EB0V)是丝状病毒科单股负链RNA病毒，包括苏丹型埃博拉（Sudanebola)、扎伊尔型埃博拉（Zaireebola)、科特迪瓦型埃博拉（Coted'Ivoireebola)、本迪布焦型埃博拉病毒（Byndibygyoebola)和雷斯顿型埃博拉(Restonebola)等5种亚型。埃博拉病毒一般通过感染者的血液、体液和分泌液等传播，能够引发脊椎动物特别是灵长类动物产生出血热症状，人感染病例的死亡率高达90%以上。但到目前还没有有效预防和治疗埃博拉病毒感染的药物和疫苗，被WHO列为对人类危害最严重的4级病毒和潜在的生物战剂。该病毒首次报道于1976年在非洲报道，此后几十年一直在非洲大地零星爆发。[0003]今年4月以来，埃博拉病毒在几内亚、利比里亚、塞拉利昂、尼日利亚等西非四国爆发和流行，根据世界卫生组织发布的疫情最新通报，截至8月20日，西非地区累计出现埃博拉病毒确诊、疑似和可能感染病例2615例，1427人死亡，已成为国际关注的突发公共卫生事件，并对他国家的公共健康构成威胁。尽管到目前为止，埃博拉疫情主要发生在非洲四国，但是随着中国和非洲经济文化联系的日益密切，大量人员频繁来往于中非之间，埃博拉疫情将对中国的公共卫生体系建设和埃博拉疫情的防控带来严峻的挑战和威胁。为此，国家有关部门对此次疫情给以了高度关注，发布了埃博拉防控的指导性文件，启动了相应的应急科技支撑项目。虽然埃博拉病毒没有在世界范围内造成大规模流行，但是，随着经济全球化进程的深入，非洲贸易、旅游、合作、及人员往来的增多，埃博拉病毒对各国人民的威胁与日俱增，尤其像中国这样一个人口众多，人流量大的国家，更需要对此类病毒的入侵做好储备性工作。其中埃博拉病毒感染的早期核酸和抗体检测技术的建立和完善是有效进行埃博拉病毒防控的重要措施。同时在目前世界范围内缺少埃博拉病毒预防性和治疗性疫苗的情况下，获得对埃博拉病毒特异性抗血清对埃博拉病人进行应急治疗具有十分紧迫和重要的现实意义。[0004]研制埃博拉病毒的疫苗一直被认为是有效控制埃博拉病毒感染的有效方法。但由于埃博拉病被认为是一种生物安全危害四级的病毒，开展埃博拉病毒培养、病毒操作和动物感染实验需要在四级生物安全实验室进行，而且世界各国对从事埃博拉病毒的研究和埃博拉病毒的保藏有及其严格的管理规定，所以有关康埃博拉病毒疫苗的研究大部分依赖于重组病毒进行。截止目前，埃博拉重组病毒主要有利用腺病毒，VSV(水泡性口炎病毒），VLP(类病毒）等来构建，研究结果显示这些重组病毒能有效诱导实验动物小鼠产生对埃博拉病毒结构蛋白产生特异性抗体，而且证明诱导产生的抗体与埃博拉病毒的结构蛋白能发生特异性结合反应，但抗体对埃博拉病毒的中和反应及其抗埃博拉病毒感染的动物实验还有待进一步进行，这是目前开展抗埃博拉病毒疫苗研究存在的无法克服的技术障碍。黄热病毒疫苗株作为灭活和减毒菌株已经安全地用于抗黄热病毒疫苗的制备，在中国和世界其他地方用于黄热病毒的预防性疫苗已经安全应用了几十年，在黄热病毒的防控中发挥了很好的作用，被认为是一种安全的疫苗菌株，但到目前为止尚无有人利用黄热病毒的疫苗株构建埃博拉重组病毒用于埃博阿拉病毒抗血清的制备。【
发明内容】[0005]本发明的目的在于提供了一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP，其序列为SEQIDN0.1所示。通过将埃博拉病毒的重编辑后的GP(editedGP，swissprot:Q05320)蛋白基因插入到黄热病毒疫苗株（yellowfeverl7D，YF17D)的E和NS1之间，构建具有传代能力的重组病毒。[0006]本发明的另一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒的构建方法，方法简单，易行，易于大规模生产。[0007]本发明的还有一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒在埃博拉病毒抗血清制备中的应用。本发明所述的埃博拉重组病毒，经鉴定，重组病毒能在BHK21中产生病毒，病毒滴度达l〇6PFU/ml。通过噬斑，WB，IFA(间接免疫荧光），RT-PCR等方法分别检测到埃博拉GP蛋白的表达，我们发现重组病毒的滴度小于YF17D的毒力滴度，说明了埃博拉重组病毒的安全性。[0008]本发明最后一个目的在于提供了一种埃博拉重组病毒YF17D-editedGP重组病毒在制备埃博拉病毒GP蛋白抗血清制备中的应用。该病毒能够在小鼠体内诱导出针对editedGP特异性的结合抗体，并特异性地介导⑶8+T淋巴细胞分泌IFN-分，IL-2等细胞分子，参与特异性抗病毒细胞免疫。该重组病毒可进一步大量制备对埃博拉结构蛋白具有特异性结合反应的抗血清和抗埃博拉病毒的疫苗研制提供原创性技术支撑，具有广泛的应用前景。[0009]为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：[0010]本发明的发明思路为：本发明采取的黄热病毒疫苗株（YellowFever17D，YF17D)(astablefulllengthyellowfeverviruscDNAcloneandtheroleofconservedRNAelementsinflavivirusreplication)作为重组病毒的骨架获得表达埃博拉病毒GP蛋白的重组黄热病毒。该重组病毒载体已有七十多年的使用历史，被用作多种病原体和病毒如HIV、DENV和WNV等的重组载体，均取得良好的免疫保护效果。为使重组病毒出毒和提高稳定性，在插入片段editedGP连入N端NS1(N9aa)和C端加WNV-E24融合区。通过融合PCR构建插入片段，酶切位点（Nsil和M1I)连接的方式构建重组病毒。[0011]-种埃博拉重组病毒的构建方法，其步骤如下：[0012]BHK-21细胞用DMEM+10%FBS+100U/ml青链霉素双抗在37°C培养箱中培养。细胞裂解液购自碧云天，PACNRA-YF17D全长感染性克隆由中国科学院武汉病毒所张波研究员惠赠。[0013]采用酶切连接的方法，在E和NS1上找到两个酶切位点mil和Nsil，用primer9F和primer9R,pACNRA_YF17D为模板，扩增E的左边部分区域，用primerlOF和primerlOR，editedGP为模板，扩增出融合中间区的editedGP，用primerllF-lprimerllF-2,primerllF-3,primerllF-4和primerllR，以pACNRA_YF17D为模板，按照依次顺序通过多轮PCR，得到NS1右边融合区。我们融合PCR将这3个PCR产物融合在一起，通过两个酶切位点mull和Nsil连在pACNRA-YF17D。（所用到的引物参见实施例1中表1)[0014]埃博拉重组病毒的出毒鉴定和生物学特性实验：[0015]经鉴定，重组病毒能在BHK21中产生病毒颗粒，病毒滴度达106PFM/ml。我们通过噬斑、WB、IFA(间接免疫荧光）和RT-PCR等方法分别检测到埃博拉GP蛋白的表达，我们发现重组病毒的滴度小于YF17D的毒力滴度，说明了重组病毒的安全性。此外，我们通过传代实验，测定重组病毒的稳定性在P5代左右。[0016]重组病毒的鉴定和生物学特性实验：[0017]我们将YF17D的RNA和重组病毒的全长感染性RNA通过DMRIE-CReagent转染到BHK21中（六孔板），分别取第3天和第4天的上清液，经过离心1000g，5min，保留上清，用Trizol法提取其总RNA，以其RNA为模板用M-MLV反转录酶逆转录出cDNA，用扩增GP和NS1的部分序列一对引物进行PCR，产物大小1.lkb。我们在YF17D-editedGP的3d和4d上清中，检测到了目的大小的片段，经测序比对，证实是GP和NS1的部分序列。同时，我们用碧云天细胞裂解液收获了转染后4天后的细胞，加上上清液，YF17D感染的细胞，用GPMcAb单抗进行了WesternBlot检测。此外，我们将获得病毒上清液用24孔板来做噬斑，4d后可见噬斑形态，6天后染色，根据噬斑数和稀释倍数计算病毒的滴度（PFM/ml，PFM:PlaqUeformationunit嗤斑形成单位）PFM=病毒稀释倍数XP/V(P:空时斑数目，V:接种量）在两次不同的时间内进行。此外，我们用感染复数Μ0Ι为0.1的重组病毒连续传代BHK21，分别在感染后第4天取10μ1上清液，感染新的BHK21，如此直至10代，收集每代的感染细胞和上清液，分别进行WB和RT-PCR检测外源基因的遗传稳定性。[0018]与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果：[0019]1.这是首次利用黄热病毒17D作为病毒骨架构建表达埃博拉GP蛋白的重组病毒，为表达埃博拉病毒蛋白的重组病毒的构建和抗血清的制备及疫苗研究提供了一个新的方向。[0020]2.这个疫苗载体是黄热病毒的疫苗株，具有很好的安全性，在临床上已有70多年的使用历史，重组病毒的毒力弱于母本病毒，具有更高的安全性。[0021]3.本发明首公开的黄热病毒包容外源片段大小为2kb(目前最大），大于文献报道的最大外源片段（拉萨热GP1.5kb)，拓展了黄热病毒疫苗株接受外源基因的容量。[0022]4.重组病毒能够连续传代至5代保持稳定，比较稳定。[0023]重组病毒是一种很有前景的疫苗之一，它能在体外大量制备，进入人体后接近于自然感染，能够诱导强烈的系统免疫应答和粘膜免疫反应，几乎可以提供完全的保护作用。本发明不仅对于埃博拉的疫苗的研发提供了重要的思路和基础，同时也为其他烈性病毒和当前第1页1 2 3