专利名称：一种检测埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重pcr试剂盒及其引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及病原分子生物学检测技术领域，具体涉及ー种同时检测四种烈性传染病病毒，包括埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR检测试剂盒及其引物。
背景技术：
埃博拉出血热(Ebolahemorrhagic fever,EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus,EBV)引起的ー种急性出血性传染病。主要通过接触病人或感染动物的体液、排泄物、分泌物等感染，临床表现主要为发热、出血和多脏器损害。埃博拉出血热的病死率高，可达 50% -90%。埃博拉病毒源于非洲的刚果，在生物安全等级上和天花病毒同为最危险的第四级，1976年首度在非洲扎伊尔北部和苏丹南部出现。世界卫生组织已将埃博拉病毒列为对人类危害最严重的病毒之一。埃博拉病毒属丝状病毒科丝状病毒属，可分为四种不同亚型扎伊尔埃博拉(EBO-Z)，苏丹埃博拉(EBO-S)，科特迪瓦埃博拉(EBO-C)和莱斯顿埃博拉(EBO-R)。前3种亚型可使人和灵长类动物发病，其中扎伊尔埃博拉的致死率为88. 8% ;苏丹埃博拉则为53. 2%。而瑞斯顿埃博拉只会使灵长类动物发病，但人类也可能感染这种病毒亚型从而成为无症状的病毒携帯者，在西太平洋就有这种病例出现。埃博拉出血热有4个传播途径直接接触病人的血液、分泌物等体液传播；通过直接接触病人尸体传播；处理发病或病死的猩猩、猕猴等动物引起传播；医务人员在护理病人时不采取有效的个人防护也会引起传播。此病目前没有有效药物可以治疗。马尔堡出血热(Marburghemorrhagic fever, MHF)是由马尔堡病毒(MarburgVirus)引起的以急性发热伴有严重出血为主要临床表现的传染性疾病，经密切接触传播，传染性强，病死率高。由于马尔堡病毒来自于非洲绿猴并主要在非洲流行，因此马尔堡出血热又被称为青猴病和非洲出血热。历史上最大的马尔堡出血热暴发是于2004年10月始于安哥拉国威热省。截止2005年7月最后一例实验室确诊病例，安哥拉卫生部报告全国累计病例总数为374例，其中有329例死亡(病死率为88% )。拉沙热是ー种名为拉沙病毒所引致的急性病毒感染，流行于西非洲的国家几内亚、利比里亚、塞拉利昂和尼日利亚。病毒的宿主是西非洲的野鼠。拉沙热是经由气雾或直接接触染病的啮齿类动物排泄物而受感染，也可以直接经由病人在发热期传播。人类感染病毒后可以没有病徴，但亦可能病况严重，导至死亡。裂谷热(RiftValley fever,RVF)是由裂谷热病毒(Rift Valley fever Virus,RVFV)引起的、是ー种病毒性人畜共患病，主要影响的是动物，但也能传染人。传染可导致人畜患染严重疾病，发病率和死亡率极高。该疾病因裂谷热感染的牲畜死亡和流产，也会造成重大经济损失。裂谷热病毒是ー种属于布尼亚病毒科白蛉病毒属、基因组为单股负链RNA的病毒，有包膜，直径约为90 lOOnm。绝大多数人感染裂谷热病毒是与受感染动物的血液或器官直接或间接接触所造成的，受感染蚊子叮咬也会导致人间感染，通常是伊蚊叮咬，嗜血(食血)苍蝇也有可能传播裂谷热病毒。境外一些来自疫区的感染者或媒介昆虫通过国境ロ岸的带入，均可引起裂谷热病毒在我国的扩散。随着与世界各国交通往来的日益频繁，境外ー些来自疫区的人员可通过国境ロ岸进入我国，存在着将上述四种疾病输入我国的危险。现有技术或行业标准没有涉及到对上述四种病毒进行分子生物学快速检测鉴定。因此，有必要在国境ロ岸建立ー套上述四种病毒的分子生物学快速检验鉴定方法
发明内容
为了克服上述技术缺陷，本发明提供了ー种同时检测四种国外烈性传染病埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR检测试剂盒及其引物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案本发明提供的埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR检测试剂盒，包括主反应液(QuantiFast Multiplex Master Mix)、RT反应液(QuantiFastRT Mix)等试剂外，还包括四种病毒的引物和探针，如SEQ ID NO : 1_13所示的引物，以及序列如SEQID NO 14-18所示的探针。引物的具体序列如下EfCGGACACACAAAAAGAAAGAAErlATCAGTGTCAATGAGAGGAAAATEr2 ATTAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGMf CATCTGATGGGATTCACACTGAGMr TGGGAGGTACACCTGTCCTGAALflCTCATGGGATTGATGTCACAGALrlCGAGGGAGTGCTTCTATAACTGCLf2-1 AAGGACCTATGCCACATGCACACLr2-1 AGGAGTTATCTCTTCTTTGCCACCLf2-2 CAAGGATTTGTGTCACATGCACACLr2-2 AGGGGTTATTTCCTCTTTGCCRf ATTCCTGAGACACATGGCATRr CACTTCCTTGCATCATCTGA探针的具体序列如下EP :FAM-aatcttcct+Cg+Tagttat+Tcg+Cacacaa_BHQl (TaqMan-LNA 探针)MP R0X-aaa+Gtt+Gct+Gat+Tc+Ccct-BHQ2 (TaqMan-LNA 探针)LPl :TET-acctggc+Tgtgc+Agcaaac_BHQl (TaqMan-LNA 探针)LP2 TET-ttcttct+Tc+Tcaa+Caa+Cg+Acacc-BHQl (TaqMan-LNA 探针)RP Cy5-cacaagtccacacaggccccttacatt-BHQ2 (TaqMan 探针)*EP、Mp、LPl和LP2为Taqman-LNA探针，碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰。运用上述试剂盒进行四种病毒的实时荧光RT-PCR检测，反应体系为20 μ L，分别为四重荧光RT-PCR，每种探针浓度为O. 2μΜ、每种引物浓度为O. 2μΜ，QuantiFastMultiplex MasterMix 2 μ M、QuantiFast RT Mix O. 2 μ Μ，阳性对照 5 μ Μ，用 DEPC Η20补齐；反应条件(在ABI 7500仪器上)50°C 20min (逆转录)；95°C 15min (热启动)；94 0C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果判断无Ct 值或Ct > 40，且无明显扩增曲线，判断为荧光RT-PCR检测阴性；Ct值彡40，并有明显扩增曲线，初步判断为病毒荧光RT-PCR检测阳性；40 < Ct值彡45的标本应重做。若重做结果仍然有明显扩增曲线，则初歩判断为病毒荧光RT-PCR检测阳性，否则为阴性；荧光RT-PCR结果阳性的标本应进ー步进行RT-PCR扩增，对扩增片断测序和序列比对后，确诊是否为病毒核酸阳性。上述引物探针是用Lasergene软件包中的SeqMan和MegAl ign程序分析从Genbank上获得的病毒核苷酸序列，分析病毒基因组的保守性，选择有核苷酸高度保守的区域，用PrimerEXpresS3. O软件设计实时荧光RT-PCR检测所需的特异性引物和荧光探针。本发明的试剂盒和引物探针能快速准确检测埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒，能有效控制该类传染病在国境ロ岸的传入和输出，准确有效、可操作性强，并应用于该传染病的监测，及时发现可疑病例，提高防止该病传入我国的能力。
图I是本发明的ー个优选实施例的试剂盒检测四种病毒的荧光PCR结果图；图2是埃博拉病毒合成阳性对照的实时荧光PCR检测，阳性对照为重组质粒，即将埃博拉病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为SmaI ；图3是马尔堡病毒合成阳性对照的实时荧光PCR检测，阳性对照为重组质粒，即将马尔堡病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为SmaI ；图4是裂谷热病毒合成阳性对照的实时荧光PCR检测，阳性对照为重组质粒，即将裂谷热病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为SmaI ；图5是拉沙热病毒合成阳性对照的实时荧光PCR检测，阳性对照为重组质粒，即将拉沙热病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为Smal。
具体实施例方式下列实施例举例了发明人的优选实施例，用于示例本发明的模式，而不应将本发明理解为限定于这些实施例的范围。这些实施例，根据本文公开和本领域技术人员的普遍水平，技术人员将理解下列仅用于示例，可以在不超过本发明的范围内进行各种变动、修饰和改造。其中所涉及的技术，除非特别说明，均是本领域技术人员熟知的分子生物学、细胞生物学、生物化学等各个领域的常规技木。为使本发明更加容易理解，下面将进ー步阐述本发明的具体实施例。 实施例I :本发明的一个优选实施例的试剂盒组成本发明的一个优选实施例的试剂盒包括RT-PCR缓冲液、RT-PCR酶混合液等常规试剂外，还包括四种病毒的引物和探针，引物序列如SEQ ID NO 1-13所示，探针序列如SEQID NO 14-18 所示。引物的具体序列如下Ef CGGACACACAAAAAGAAAGAAErlATCAGTGTCAATGAGAGGAAAAT
Er2 ATTAGTTTGAGTTTGAGGAAAATGMf CATCTGATGGGATTCACACTGAGMr TGGGAGGTACACCTGTCCTGAALfl CTCATGGGATTGATGTCACAGALrlCGAGGGAGTGCTTCTATAACTGC
Lf2-1 AAGGACCTATGCCACATGCACACLr2-1 AGGAGTTATCTCTTCTTTGCCACCLf2-2 CAAGGATTTGTGTCACATGCACACLr2-2 AGGGGTTATTTCCTCTTTGCCRf ATTCCTGAGACACATGGCATRr CACTTCCTTGCATCATCTGA探针的具体序列如下EP :FAM-aatcttcct+Cg+Tagttat+Tcg+Cacacaa_BHQl (TaqMan-LNA 探针)MP R0X-aaa+Gtt+Gct+Gat+Tc+Ccct-BHQ2 (TaqMan-LNA 探针)LPl :TET-acctggc+Tgtgc+Agcaaac_BHQl (TaqMan-LNA 探针)LP2 TET-ttcttct+Tc+Tcaa+Caa+Cg+Acacc-BHQl (TaqMan-LNA 探针)RP Cy5-cacaagtccacacaggccccttacatt-BHQ2 (TaqMan 探针)*EP、Mp、LPl和LP2为Taqman-LNA探针，碱基前含“ + ”表示该碱基为LNA修饰。实施例2 :用本发明的试剂盒的ー个优选实施例对样本进行检测用美国Qiagen公司QIAamp Viral RNA Kit提取病毒核酸。使用本发明的ー个优选实施例的试剂盒，四重荧光RT-PCR每种探针浓度为
O.2 μ Μ、每种引物浓度为O. 2 μ Μ，进行四种烈性病毒实时荧光RT-PCR检测，反应体系设为2OyL;反应条件(在ABI 75OO仪器上)50°C 2Omin (逆转录)；％°C I5Inin (热启动)；94 0C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果见图1，由图I可见，在该反应体系中检测到四种病毒均为阳性。实施例3 :用本发明的试剂盒的ー个优选实施例对样本进行检测本实施例使用埃博拉病毒合成阳性对照样本，阳性对照为重组质粒，即将埃博拉病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为Smal。四重荧光RT-PCR每种探针浓度为O. 2 μ Μ、每种引物浓度为O. 2 μ Μ，进行实时荧光RT-PCR检测，反应体系设为20 μ L ;反应条件(在ABI 7500仪器上)50°C 20min (逆转录)；95°C 15min (热启动)；94°C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果见图2，由图2可见，在该反应体系中检测到埃博拉病毒为阳性。实施例4 :用本发明的试剂盒的ー个优选实施例对样本进行检测本实施例使用马尔堡病毒合成阳性对照样本，阳性对照为重组质粒，即将马尔堡病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为Smal。四重荧光RT-PCR每种探针浓度为O. 2 μ Μ、每种引物浓度为O. 2 μ Μ，进行实时荧光RT-PCR检测，反应体系设为20yL;反应条件(在ABI 7500仪器上)50°C 20min (逆转录)；95°C15min (热启动)；94°C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果见图3，由图3可见，在该反应体系中检测到马尔堡病毒为阳性。
实施例5 :用本发明的试剂盒的ー个优选实施例对样本进行检测本实施例使用裂谷热病毒合成阳性对照样本，阳性对照为重组质粒，即将裂谷热病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为SmaI ;四重荧光RT-PCR每种探针浓度为O. 2 μ Μ、每种引物浓度为O. 2 μ Μ，进行实时荧光RT-PCR检测，反应体系设为20 μ L ;反应条件(在ABI 7500仪器上)50°C 20min (逆转录)；95°C 15min (热启动)；94°C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果见图4，由图4可见，在该反应体系中检测到裂谷热病毒为阳性。实施例6 :用本发明的试剂盒的ー个优选实施例对样本进行检测本实施例使用拉沙热病毒合成阳性对照样本，阳性对照为重组质粒，即将拉沙热病毒上下游引物间的DNA序列连接到pUC57载体上构成，插入位点为Smal。四重荧光RT-PCR每种探针浓度为O. 2 μ Μ、每种引物浓度为O. 2 μ Μ，进行实时荧光RT-PCR检测，反应体系设为20 μ L ;反应条件(在ABI 7500仪器上)50°C 20min (逆转录)；95°C 15min (热 启动)；94°C 45s (变性)，60°C 75s (退火/延伸，采集荧光信号)，45循环。结果见图5，由图5可见，在该反应体系中检测到拉沙热病毒为阳性。最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管參照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。序列表〈120〉ー种埃博拉、马尔堡、拉沙热和裂谷热的多重荧光PCR检测试剂盒及其引物<160>18<170>PatentIn version 3. 2〈210〉I<211>21<212>DNA<213>Ef〈400〉Icggacacaca aaaagaaaga a 2丄<210>1<211>23<212>DNA<213>Erl<400>2atcagtgtca atgagaggaa aat 23<210>1<211>24<212>DNA<213>Er2<400>3
attagtttga gtttgaggaa aatg 24<210>1<211>23<212>DNA<213>Mf<400>4catctgatgg gattcacact gag 23
<210>1<211>22<212>DNA<213>Mr<400>5tgggaggtac acctgtcctg aa 22<210>1
<211>22<212>DNA<213>Lfl<400>6ctcatgggat tgatgtcaca ga 22<210>1<211>23<212>DNA<213>Lrl<400>7cgagggagtg cttctataac tgc 23<210>1<211>23<212>DNA<213>Lf2-l<400>8aaggacctat gccacatgca cac 23<210>1<211>24<212>DNA<213>Lr2-l<400>9aggagttatc tcttctttgc cacc 24<210>1<211>24
<212>DNA<213>Lf2-2<400>10
caaggatttg tgtcacatgc acac 24<210>1<211>21<212>DNA<213>Lr2-2〈400〉11aggggttatt tcctctttgc c 21<210>1<211>20<212>DNA<213>Rf<400>12attcctgaga cacatggcat 20<210>1<211>20<212>DNA<213>Rr<400>13cacttccttg catcatctga 20<210>1<211>28<212>DNA<213>EP<400>14aatcttcctc gtagttattc gcacacaa 28<210>1<211>18<212>DNA<213>MP<400>15aaagttgctg attcccct 18<210>1<211>19<212>DNA<213>LP1<400>1权利要求
1.一种检测埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括聚合酶和反应液，其特征在于，还包括序列如SEQ ID NO :1-13所示的引物。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，还包括序列如SEQID NO :14-18所示的探针。
3.ー种用于检测埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR引物，其特征在于，所述引物序列如SEQ ID NO :1-13所示。
全文摘要
本发明提供了一种同时检测埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙热病毒和裂谷热病毒的多重荧光PCR检测试剂盒及其引物。本发明提供的试剂盒包括RT-PCR缓冲液、RT-PCR酶混合液等常规试剂外，还包括四种病毒的引物和探针，如SEQ ID NO1-13所示的引物，以及序列如SEQ ID NO14-18所示的探针。利用本发明的试剂盒和引物探针能快速准确检测埃博拉、马尔堡、拉沙热和裂谷热的病原体，能有效控制该类传染病在国境口岸的传入和输出，准确有效、可操作性强，并应用于该类传染病的监测，及时发现可疑病例，提高防止该病传入我国的能力。
文档编号C12N15/11GK102719557SQ201110416348
公开日2012年10月10日 申请日期2011年12月13日 优先权日2011年12月13日
发明者师永霞, 幸芦琴, 李小波, 洪烨, 相大鹏, 苏锦坤, 郑夔, 郭波旋, 钟玉清, 黄吉城 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心