专利名称：低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.及分离培养方法
技术领域：
本发明属于污水处理领域，涉及ー株低温条件下去除污水中氨氮的菌Pand0raea sp.及分离培养方法。
背景技术：
低温对生物处理能力产生重大影响的原因是由于温度的降低影响了微生物的生长及代谢并使污水处理系统中微生物群系发生了改变。在温度下降过程中，中温菌的代谢活性逐渐下降，到一定温度时便失去活性，而适于低温环境的低温微生物的数量由于自身的生理特性及各种生态因子的抑制作用，在数量上无法达到优势菌群的地位，从而导致污水处理厂冬季出水水质下降。因此亟需一种能在低温好氧条件下去除污水中氨氮的菌株。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供ー种低温条件下去除污水中氨氮的菌 Pandoraea sp.本发明的第二个目的是提供ー种低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法。本发明的第三个目的是提供ー种低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的用途。低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.亚黄-2CGMCC No. 5观4，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.亚黄-2CGMCC No. 5284在低温好氧条件下去除污水中氨氮的用途。所述低温优选为8-12°C。低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法，其特征是包括如下步骤(1)将第一种亚硝酸細菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸細菌培养液中，在8 12°C，连续培养4-6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸細菌培养液，在8 12°C，连续培养4-6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸細菌培养液，在8 12°C，连续培养4-6天，富集、驯化低温細菌；(2)取IOmL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20 30粒灭菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡10 30min，使細菌細胞充分释放到上清液中；静置20 40min，取ImL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10_2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10_8为止；(3)选取梯度为10_5 10_8的菌悬液，分別取ImL接种于亚硝酸細菌固体培养基， 每个稀释度做3个平行样，编号；10°C在有氧的条件下保湿培养2 3周；
(4)从步骤(3)中的亚硝酸細菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸細菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，単一，大小相似即为单菌落，命名为亚黄-2，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.。所述第一种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成NH4Cl 0.0764g、乙酸钠2g、 MgS047H200. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 0. Olg,加蒸馏水至 1000mL。所述第二种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成NH4Cl 0. 191g、乙酸钠2g、 MgS047H200. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 0. Olg,加蒸馏水至 1000mL。所述第三种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成NH4Cl 0.382g、乙酸钠2g、 MgS047H200. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 0. Olg,加蒸馏水至 1000mL。所述亚硝酸細菌固体培养基由下述组分組成NH4Cl 0.0764g、乙酸钠2g、 MgS047H200. 05g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. 01g、FeS04 0. Olg、琼脂 20g，加蒸溜水至 1000mL。实验结果表明尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明ー种低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.亚黄-2CGMCC No. 5284在10°C低温下，对氨氮去除有明显的強化作用，氨氮去除率提高了 10%，出水氨氮浓度最高为5. lmg/L，优于ー级A的出水标准(水温彡12°C吋，ー级A标准的控制指标为8mg/L)。
图1为ー种低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的驯化分离培养流程图。图2为亚黄-2氨氮去除实验。图3为Pandoraea sp.(亚黄_2)細菌鉴定方法流程。
具体实施例方式下面通过具体实施例对本发明作进ー步的说明。实施例1低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法，包括如下步骤(1)将第一种亚硝酸細菌培养液放入小试SBR反应器中，将天津纪庄子污水处理厂曝气池的污泥接种所述第一种亚硝酸細菌培养液中，在10°c，连续培养5天，取出上清液，加入第二种亚硝酸細菌培养液，在10°C，连续培养5天，取出上清液，加入第三种亚硝酸細菌培养液，在10°C，连续培养5天，富集、驯化低温細菌；(2)取IOmL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡20min，使細菌細胞充分释放到上清液中；静置30min，取ImL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10_2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10_8为止；(3)选取梯度为10_5 10_8的菌悬液，分別取ImL接种于亚硝酸細菌固体培养基， 每个稀释度做3个平行样，编号；10°C在有氧的条件下保湿培养3周；(4)从步骤(3)中的亚硝酸細菌固体培养基平板中挑选菌落大，滴入格里斯试剂变红的形态不同的单菌落，在亚硝酸細菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，単一，大小相似即为单菌落，命名为亚黄-2，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.。实施例2第一种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成=NH4Cl 0. 0764g、乙酸钠2g、 MgS047H200. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 0. Olg,加蒸馏水至 1000mL。实施例3第二种亚硝酸細菌培养液由下述组分组成=NH4Cl 0. 191g、乙酸钠2g、MgS047H20 0. 05g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 O.Olg，加蒸溜水至 IOOOmL0实施例4第三种亚硝酸細菌培养液由下述组分组成=NH4Cl 0. 382g、乙酸钠2g、MgS047H20 0. 05g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O O.Olg、FeSO4 O.Olg，加蒸溜水至 IOOOmL0实施例5亚硝酸細菌固体培养基由下述组分组成=NH4Cl 0. 0764g、乙酸钠2g、MgS047H20 0. 05g、K2HPO4 0.2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、FeSO4 0. Olg、琼脂 20g，加蒸馏水至 1000mL。实施例6格里斯试剂的配制1、对氨基苯磺酸试剂(A液)0. 5克对氨基苯磺酸溶于150毫升20%的稀醋酸溶液中，储于棕色瓶，冷藏备用。2、α-萘胺试剂(B液)0. 5克α -萘胺加到20毫升蒸馏水和150毫升20%的稀醋酸溶液中，储于棕色瓶，冷藏备用。3、格里斯试剂的使用液取等比例的A液与B液混合即可使用。实施例7本发明的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.具有以下微生物学特性1.形态学特性在显微镜下观察，为杆状，长1. 4 μ m，宽0.观μ m ；在亚硝酸細菌固体培养基上形成乳白色菌落。2.培养学特性在10°C下，在亚硝酸細菌固体培养基中培养时，本发明的Pandoraea sp.菌株具有以下特性。表面光滑湿润，边缘整齐规则，个体微小呈圆形，菌体呈乳白色。3.生理特性
好氧条件下去除污水中氨氮的革兰氏阴性細菌，接触酶阳性、甲基红试验阴性、不水解淀粉、不液化明胶、不产生吲哚、生长PH值为6 8，生长温度5 30°C。
革兰氏接触酶甲基红淀粉水解明胶试验吲哚试验ρ H温度G_+6 85 30本发明細菌的16s序列鉴定16SrDNA是细菌类原核生物在漫长的进化过程中十分保守的序列，在现代微生物的分类学中扮演着重要的角色，作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子，用16S rDNA进行微生物群落结构分析更为快捷方便。用16s序列进行细菌鉴定按图3进行。图3中的牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，加蒸馏水至 IOOOmL,pH 7. 0 7. 2LB培养基胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，加蒸馏水至1000ml。本发明测得的16s序列如下所示ACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAATGTACCTTGTAGTGGGGGATAGCTCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGCTCTGAGGAGGAAAGCGGGGGACCTTCGGGCCTCGCGCTACAAGAGCAGCCGATGTCAGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAAGCTCACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTCTGGGTTAATACCTCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTTGTAAGACGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTCGTGACTGCAAGGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGAAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGTACGGAATCCTGCTGAGAGGTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGTAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAGGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGTACAGAGGGCTGCCAAACCGCGAGGTGGAGCTAACCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTGCCAGAAGTAGGTAGCCTAACCGTAAGGAGGGCGCTTACCACGGCAGGATTCATGACTGGG根据上述微生物学特性，命名为亚黄-2，分类命名为菌(Pandoraea sp.)已于2011年9月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCCNo. 5284，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所， 并已存活。实施例8亚黄-2对污水中氨氮的降解效果在IL的烧杯中，加入500m L第四种亚硝酸細菌培养液(初始氨氮浓度为30mg/ L)，加入适量的亚黄-2，保持pH为7. 5，測定72小时其对氨氮的降解情况，结果如图2所示。由图2可以看出，经72小时的降解，溶液中氨氮浓度为l.aiig/L，氨氮基本去除，去除率为96%，证明本发明中的亚黄-2对氨氮有良好的去除能力。第四种亚硝酸細菌培养液组成第一种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成 NH4ClO. 1146g、乙酸钠 2g、MgSOJH2O 0. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. Olg、 FeSO4O. Olg，加蒸馏水至 1000mL。实施例9低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法，包括如下步骤(1)将第一种亚硝酸細菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸細菌培养液中，在8°C，连续培养6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸细菌培养液，在8°C，连续培养6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸細菌培养液，在8°C，连续培养6天，富集、驯化低温細菌；(2)取IOmL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20粒灭菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡10 30min，使細菌細胞充分释放到上清液中；静置20 40min， 取ImL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10_2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10_8为止；(3)选取梯度为10_5 10_8的菌悬液，分別取ImL接种于亚硝酸細菌固体培养基， 每个稀释度做3个平行样，编号；10°C在有氧的条件下保湿培养3周；(4)从步骤(3)中的亚硝酸細菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸細菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，単一，大小相似即为单菌落，经鉴定为低温条件下去除污水中氨 MW M Pandoraea sp.。实施例10低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法，包括如下步骤(1)将第一种亚硝酸細菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸細菌培养液中，在12°C，连续培养4天，取出上清液，加入第二种亚硝酸細菌培养液，在12°C，连续培养4天，取出上清液，加入第三种亚硝酸細菌培养液，在12°C， 连续培养4天，富集、驯化低温細菌；(2)取IOmL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和30粒灭菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡10 30min，使細菌細胞充分释放到上清液中；静置20 40min， 取ImL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10_2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10_8为止；(3)选取梯度为10_5 10_8的菌悬液，分别取ImL接种于亚硝酸细菌固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10°C在有氧的条件下保湿培养2周；(4)从步骤(3)中的亚硝酸细菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸细菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，单一，大小相似即为单菌落，经鉴定为低温条件下去除污水中氨MWlii Pandoraea sp.。实验证明，实施例9和实施例10经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.的分离培养方法分离培养的菌Pandoraea sp.也有很好的去除氨氮的效果，去除率分别为95. 8%和95. 4%。
权利要求
1.低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.亚黄-2CGMCC No. 5观4，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。
2.权利要求1的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.亚黄-2CGMCC No. 5284在低温好氧条件下去除污水中氨氮的用途。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征是所述低温为8-12°C。
4.低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.的分离培养方法，其特征是包括如下步骤(1)将第一种亚硝酸細菌培养液放入小试SBR反应器中，将污水处理厂污泥接种所述第一种亚硝酸細菌培养液中，在8 12°C，连续培养4-6天，取出上清液，加入第二种亚硝酸細菌培养液，在8 12°C，连续培养4-6天，取出上清液，加入第三种亚硝酸細菌培养液，在 8 12°C，连续培养4-6天，富集、驯化低温細菌；(2)取IOmL步骤(1)获得的污泥，加入已装有90mL灭菌蒸馏水和20 30粒灭菌玻璃珠的250ml锥形瓶中，振荡10 30min，使細菌細胞充分释放到上清液中；静置20 40min， 取ImL上清液加入装有9mL无菌蒸馏水的试管中，得到10_2的菌悬液，按上述方法依次做系列稀释，一直做到10_8为止；(3)选取梯度为10_5 10_8的菌悬液，分別取ImL接种于亚硝酸細菌固体培养基，每个稀释度做3个平行样，编号；10°C在有氧的条件下保湿培养2 3周；(4)从步骤(3)中的亚硝酸細菌固体培养基平板中挑选菌落大，形态不同的单菌落，在亚硝酸細菌固体培养基平板中再次划线分离，重复平板划线分离3-4次，使平板上的菌落在显微镜中的形态相同，単一，大小相似即为单菌落，命名为亚黄-2，经鉴定为低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.。
5.根据权利要求4所述的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.的分离培养方法，其特征是所述第一种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成=NH4Cl 0.0764g、乙酸钠 2g、MgS047H20 0.05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O O.Olg、FeSO4 O.Olg，加蒸馏水至 lOOOmL。
6.根据权利要求4所述的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.的分离培养方法，其特征是所述第二种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成=NH4Cl 0. 191g、乙酸钠 2g、MgS047H20 0.05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O O.Olg、FeSO4 O.Olg，加蒸馏水至 lOOOmL。
7.根据权利要求4所述的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.的分离培养方法，其特征是所述第三种亚硝酸細菌培养液由下述组分組成=NH4Cl 0. 382g、乙酸钠 2g、MgS047H20 0.05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O O.Olg、FeSO4 O.Olg，加蒸馏水至 lOOOmL。
8.根据权利要求4所述的低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraeasp.的分离培养方法，其特征是所述亚硝酸細菌固体培养基由下述组分組成=NH4Cl 0. 0764g、乙酸钠2g、 MgS047H20 0. 05g、K2HPO4 0. 2g、NaCl 0. 12g、MnSO4H2O 0. 01g、FeSO4 0. 01g、琼脂 20g，加蒸馏水至lOOOmL。
全文摘要
本发明公开了低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.及分离培养方法，低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.亚黄-2CGMCC No.5284，其具有在低温好氧条件下去除污水中氨氮的能力。实验结果表明尽管受到低温环境的明显抑制，投加本发明一种低温条件下去除污水中氨氮的菌Pandoraea sp.亚黄-2CGMCC No.5284在10℃低温下，对氨氮去除有明显的强化作用，氨氮去除率提高了10％，出水氨氮浓度最高为5.1mg/L，优于一级A的出水标准(水温≤12℃时，一级A标准的控制指标为8mg/L)。
文档编号C12N1/20GK102559542SQ201110416289
公开日2012年7月11日 申请日期2011年12月14日 优先权日2011年12月14日
发明者刘智晓, 张伟, 杨蛟云, 沈旺, 熊欢欢, 胡春萍 申请人:首创爱华(天津)市政环境工程有限公司