一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法
【专利摘要】本发明公开了一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，属于城市生活污水处理领域。它包括制备试剂、建立数学模型、预处理样品、测定蛋白质浓度等步骤，基于Lowry法和改良Lowry法，采用Minitab响应面法分析蛋白质含量，克服了真实污水中蛋白测定低准确性和低精度的问题，降低了二级出水中腐殖酸、碳水化合物和Ca2+、Mg2+等离子的干扰。本发明具有准确度高、简单易操作等优点，适用于城市生活污水厂二级出水低浓度蛋白质的测定，且能同时测定出二级出水腐殖酸的浓度，适用范围广。
【专利说明】-种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于城市生活污水处理领域，具体地说，涉及一种测定污水厂二级出水中 低浓度蛋白质的方法。
【背景技术】
[0002] 溶解性有机氮（DON)普遍存在于生化处理二级出水中，是溶解性有机物的一部分。 DON是出水总氮中的一个重要组成部分，若不加以控制会加剧河流富营养化。DON亦可导致 膜污染，在氯化过程中将产生强致癌性的亚硝胺化合物等，对水质安全构成重大威胁。污水 处理厂是DON降解、排放的重要场所，因此，对二级出水DON的监测、控制已成为污水再生利 用和饮用水领域关注的问题之一。研究表明，出水蛋白质是出水DON的主要组成部分（占 60 % 以上）（Westgate,P.J., Park, C·, Evaluation of proteins and organic nitrogen in wastewater treatment effluents, Environ. Sci· Technol·，2010, 44:5352-5357.)。了解 二级出水蛋白质的含量，不仅可提供出水DON的组成信息，亦可反映污水厂的处理效果。
[0003] 测定蛋白质的方法主要有凯氏定氮法、双缩脲法、紫外吸收法、BCA法、Lowry法 和考马斯亮蓝G-250法。凯氏定氮法的原理：在催化剂作用下，将蛋白质氮及其他有机氮 转化为氨态氮，通过总氮与非蛋白氮的差值计算出蛋白质量，该方法灵敏度低，误差大，耗 时长；双缩脲法的原理：双缩脲在碱性溶液中与Cu 2+产生紫红色络合物，颜色深浅与蛋白 质浓度成正比，该法可快速测定蛋白质含量，但灵敏度低，适用于精度要求不高的蛋白质含 量测定；紫外吸收法的原理：蛋白质分子中的酪氨酸、色氨酸等残基的苯环含有共轭双键， 使蛋白质具有吸收紫外光的能力，该法简便、快速，缺点是测定与标准蛋白质中酪氨酸和色 氨酸含量差异较大的蛋白质时存在误差;BCA法原理：在碱性溶液中，蛋白质将Cu 2+还原成 Cu+，与BCA作用形成紫红色复合物，在一定条件下，此复合物在562nm处的光吸收强度与 蛋白质浓度成正比，因此根据吸光值可以推算出蛋白浓度，该法操作简单，但易受样品中碳 水化合物的干扰；Lowry法原理：在碱性条件下蛋白质中的肽键与铜试剂生成蛋白质-铜 络合物，该络合物上的酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸残基将磷钥酸-磷钨酸试剂还原， 生成深蓝色的化合物，其颜色深浅与蛋白质含量呈正相关，由于腐殖酸的存在，该法蛋白 质测量值高于实际值，为了降低腐殖酸的影响，改良Lowry法被运用于污泥蛋白质的分析 (Frolund B, Griebe T, Nielsen P. Η. , Enzymatic activity in the activated-sludge floe matrix, Appl. Microbiol. Biotechnol.，1995,43(4) :755-61);考马斯亮蓝 G-250 法 原理：考马斯亮兰G-250染料在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰位置由 465nm变为5 95nm，溶液的颜色变为蓝色，结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成 正比，故可用于蛋白质的定量测定，该法灵敏度比Lowry法高，缺点是由于各种蛋白质中的 精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的误差。
[0004] 由于污水厂二级出水蛋白质组成复杂、种类繁多且存在较多碳水化合物，因此紫 外吸收法、考马斯亮蓝G-250法和BCA法不适合二级出水蛋白质含量的测定。污水厂二 级出水蛋白质的含量往往很低（在12mg/L),改良Lowry法用于测定出水蛋白质时误差较 大，Westgate等人发现用改良Lowry法测定二级出水中蛋白质含量时甚至会出现负值的情 况(Westgate，P.J.，Park, C·，2010. Evaluation of proteins and organic nitrogen in wastewater treatment effluents. Environ. Sci.Technol· 44, 5352-5357)。凯氏定氣法、 双缩脲法和Lowry法由于其误差较大，对于低浓度蛋白质的测定也存在局限性。中国专利 申请号201310598562.6公开了一种利用考马斯亮蓝法测定污泥中蛋白质的方法，考马斯 亮蓝G-250与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收， 其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定，该方法灵敏度比Lowry 法高，但是缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，用于不同蛋白 质测定时有较大的误差，适用范围受到限制。因此急需要开发一种操作简便、灵敏度高、适 用范围广的测定二级出水中低浓度蛋白质含量的方法。
【发明内容】
[0005] 1.要解决的问题
[0006] 针对现有技术中测定蛋白质含量时存在的灵敏度低、测定准确性和精度低、操作 不便以及适用范围小等问题，本发明提供一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方 法，采用响应面法分析蛋白质含量，克服了真实污水中蛋白测定准确性低和精度低的问题， 该检测方法简单易操作，适用于城市生活污水厂二级出水低浓度蛋白质的测定。
[0007] 2.技术方案
[0008] 为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
[0009] 一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其步骤为：
[0010] (a)制备试剂：将Na2C03和NaOH溶解于蒸馏水中得到试剂甲，将CuS0 4 ·5Η20和酒 石酸锑钾溶解于蒸馏水中得到试剂乙，试剂甲和试剂乙混合得到试剂丙，将福林酚与蒸馏 水按体积比为3:1配制得到福林酚使用液；
[0011] (b)建立数学模型：利用Minitab响应面法建立牛血清蛋白BSA和腐殖酸HS的浓 度与对应吸光度值之间的数学模型，具体步骤为：
[0012] (1)用蒸馏水分别配制BSA标准液和HS标准液，备用；
[0013] (2)利用Minitab设计至少12组含有不同浓度BSA和HS的样品，其中BSA的浓度 范围为0. 5-25mg/L，HS的浓度范围为2_25mg/L ;
[0014] (3)用步骤（1)中配制的BSA标准液和HS标准液按照步骤（2)中设计的浓度配制 样品；
[0015] (4)将步骤（3)中配制的样品每组分别取2. 5mL于试管中，然后往试管中加入 2. 5mL步骤（a)中配制的试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，在室温放置1〇分钟后，向其加 入0.3mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在 750nm处的吸光度值Ai，利用Minitab响应面法拟合得到吸光度Ai与BSA和HS浓度关系的 线性方程1 A = h+n^C^+ndC^，其中k^nii和ηι是二元线性回归方程系数，CBSA和CHS分 别代表BSA和HS的浓度；
[0016] (5)将步骤（3)中配制的样品每组分别取2. 5mL于试管中，然后往试管中加入 2. 5mL步骤（a)中配制的试剂丙，在旋涡混合器上迅速混合，于室温放置1〇分钟后加入 0.3mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在 750nm处的吸光度值A2，利用Minitab响应面法拟合得到吸光度A2与BSA和HS浓度关系的 线性方程2 :A2二k2+m2*CBSA+n2*C HS，其中k2、m2和n2是二元线性回归方程系数，C BSA和CHS分 别代表BSA和HS的浓度；
[0017] (6)由步骤⑷中得到的线性方程1和步骤（5)中得到的线性方程2可以计算得到 BSA 浓度与吸光度值 Ai 和 A2 之间的关系为：CBSA = (k^nfk^i^+iv^-ndAd / ;
[0018] (c)预处理样品：将污水厂二级出水依次用滤膜和透析袋进行预处理去除污水中 的悬浮物和杂质离子；
[0019] (d)测定蛋白质浓度：取2. 5mL经过步骤（c)预处理得到的水样于两只试管中，一 只试管中加入2. 5mL步骤（a)中配制的试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温放置10 分钟后加入0.3mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后， 测定其在750nm处的吸光度值，另一只试管中加入2. 5mL步骤（a)中配制的试剂丙，在旋涡 混合器上迅速混合，于室温放置10分钟后加入0. 3mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立 即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在750nm处的吸光度值，根据测得的吸光度值利用 步骤（b)中建立的数学模型计算出该水样的蛋白质浓度。
[0020] 优选地，所述的步骤（a)中制备试剂甲的Na2C03质量为10g，Na0H质量为2g，蒸馏 水500mL ;制备试剂乙的CuS04 · 5H20质量为0. 781g，酒石酸锑钾质量为lg，蒸馏水lOOmL。
[0021] 优选地，所述的步骤（a)中的试剂丙由49mL试剂甲和2mL试剂乙混合得到。
[0022] 优选地，所述的步骤（1)中BSA标准液和HS标准液的浓度均为62. 5mg/L。
[0023] 优选地，所述的步骤（c)中的滤膜孔径为0. 45 μ m。
[0024] 优选地，所述的步骤（c)中的透析袋为悬浮式，材质为纤维素，截留分子量为100， 透析时间为2. 5-4. 5h。
[0025] 3.有益效果
[0026] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：
[0027] (1)本发明综合了不同蛋白质的测定方法，基于Lowry法和改良Lowry法，采用响 应面法分析蛋白质含量，能有效降低由于二级出水蛋白质组成复杂、种类繁多带来的测定 误差，步骤简便、易于操作；
[0028] (2)本发明利用Minitab软件建立测定低浓度蛋白的数学模型，能降低污水中腐 殖酸、碳水化合物和Ca2+、Mg2+等离子的干扰，测定方法准确度高；
[0029] (3)本发明中的测定蛋白质方法灵敏度高，适用于低浓度蛋白质含量的测定，且能 同时测定出二级出水腐殖酸的浓度，适用范围广；
[0030] (4)本发明中的测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，步骤简洁，操作方 便，适用性强。
【专利附图】
【附图说明】
[0031] 图1为本发明中测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法的步骤示意图；
[0032] 图2为蛋白质、腐殖酸溶液在750mn处的吸光度Ai与浓度之间的关系图；
[0033] 图3为蛋白质、腐殖酸溶液在750mn处的吸光度A2与浓度之间的关系图；
[0034]图4为用本发明的测定方法测得的四个不同污水处理厂二级出水的蛋白质浓度 图。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
[0036] 实施例1
[0037] 一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其步骤为：
[0038] (a)制备试剂：将l〇g Na2C03和2g NaOH溶解于500mL蒸馏水中得到试剂甲，将 0· 781gCuS04 · 5H20和lg酒石酸锑钾溶解于lOOmL蒸馏水中得到试剂乙，试剂丙由49mL试 剂甲和2mL试剂乙混合得到，现配现用，将福林酚与蒸馏水按体积比为3:1配制得到福林酚 使用液；
[0039] (b)建立数学模型：利用Minitab响应面法建立牛血清蛋白BSA、腐殖酸HS的浓度 与对应吸光度值之间的数学模型，具体步骤为 ：
[0040] (1)用蒸馏水分别配制浓度均为62. 5mg/L的BSA标准液和HS标准液，备用；
[0041] (2)利用Minitab设计17组含有不同浓度BSA和HS的样品，如表1所示，其中牛 血清蛋白的浓度范围为〇. 5-25mg/L，腐殖酸的浓度范围为2-25mg/L ;
[0042] 表1利用Minitab设计的17组含有不同浓度BSA和HS的样品表
[0043]
【权利要求】
1. 一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其步骤为： (a) 制备试剂：将Na2C03和NaOH溶解于蒸馏水中得到试剂甲，将CuS04 ·5Η20和酒石酸 锑钾溶解于蒸馏水中得到试剂乙，试剂甲和试剂乙混合得到试剂丙，将福林酚与蒸馏水按 体积比为3:1配制得到福林酚使用液； (b) 建立数学模型：利用Minitab响应面法建立牛血清蛋白BSA和腐殖酸HS的浓度与 对应吸光度值之间的数学模型，具体步骤为： (1) 用蒸馏水分别配制BSA标准液和HS标准液，备用； (2) 利用Minitab设计至少12组含有不同浓度BSA和HS的样品，其中BSA的浓度范围 为 0· 5-25 mg/L，HS 的浓度范围为 2-25 mg/L ; (3) 用步骤（1)中配制的BSA标准液和HS标准液按照步骤（2)中设计的浓度配制样 品； (4) 将步骤（3)中配制的样品每组分别取2.5 mL于试管中，然后往试管中加入2. 5 mL步骤（a)中配制的试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，在室温放置10分钟后，向其加入 0.3mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在750 nm处的吸光度值Ai，利用Minitab响应面法拟合得到吸光度Ai与BSA和HS浓度关系的线 性方程1 A = h+m^Cg+ndC^，其中和ηι是二元线性回归方程系数，CBSA和CHS分别 代表BSA和HS的浓度； (5) 将步骤（3)中配制的样品每组分别取2.5 mL于试管中，然后往试管中加入2.5 mL 步骤（a)中配制的试剂丙，在旋涡混合器上迅速混合，于室温放置10分钟后加入0.3 mL步 骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在750 nm处的 吸光度值A2，利用Minitab响应面法拟合得到吸光度A2与BSA和HS浓度关系的线性方程 2 :A2 = k2+m2*CBSA+n2*CHS，其中k 2、m2和n2是二元线性回归方程系数，CBSA和C HS分别代表BSA 和HS的浓度； (6) 由步骤⑷中得到的线性方程1和步骤（5)中得到的线性方程2可以计算得到BSA 浓度与吸光度值八1和A2之间的关系为：CBSA = G^r^-kfr^+ndAfndAj; (c) 预处理样品：将污水厂二级出水依次用滤膜和透析袋进行预处理去除污水中的悬 浮物和杂质离子； (d) 测定蛋白质浓度：取2. 5 mL经过步骤（c)预处理得到的水样于两只试管中，一只 试管中加入2.5 mL步骤（a)中配制的试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温放置10分 钟后加入0.3 mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并立即混匀，在室温下放置45分钟后，测 定其在750 nm处的吸光度值，另一只试管中加入2.5 mL步骤（a)中配制的试剂丙，在旋涡 混合器上迅速混合，于室温放置10分钟后加入0. 3 mL步骤（a)中配制的福林酚使用液并 立即混匀，在室温下放置45分钟后，测定其在750 nm处的吸光度值，根据测得的吸光度值 利用步骤（b)中建立的数学模型计算出该水样的蛋白质浓度。
2. 根据权利要求1所述的一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其特征在 于：所述的步骤（a)中制备试剂甲的Na2C0 3质量为10 g，NaOH质量为2 g，蒸馏水500 mL ; 制备试剂乙的CuS04 · 5H20质量为0. 781 g，酒石酸锑钾质量为1 g，蒸馏水100 mL。
3. 根据权利要求1所述的一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其特征在 于：所述的步骤（a)中的试剂丙由49 mL试剂甲和2 mL试剂乙混合得到。
4. 根据权利要求1所述的一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其特征在 于：所述的步骤（1)中BSA标准液和HS标准液的浓度均为62. 5 mg/L。
5. 根据权利要求1所述的一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其特征在 于：所述的步骤（c)中的滤膜孔径为0. 45 μ m。
6. 根据权利要求1所述的一种测定污水厂二级出水中低浓度蛋白质的方法，其特征在 于：所述的步骤（c)中的透析袋为悬浮式，材质为纤维素，截留分子量为100,透析时间为 2. 5~4. 5h〇
【文档编号】G06F19/00GK104297182SQ201410561753
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】任洪强, 胡海冬, 丁丽丽, 耿金菊, 许柯, 张宴 申请人:南京大学