一种重组中华田园犬α干扰素的制备方法

专利名称：一种重组中华田园犬α干扰素的制备方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组犬α干扰素的制备方法。
背景技术：
随着经济发展和人民生活水平的提高，犬作为伴侣动物已成为人们生活中不可缺少的一部分。犬瘟热、犬细小病毒病等犬类疾病严重危害犬的健康和养犬业的发展。α干扰素(Interferon-a，IFN-a)是由动物白细胞或成纤维细胞产生的一类分蛋白，具有广谱抗病毒和增强免疫作用，可用于犬病毒病的治疗。利用原核表达系统体外表达某些特定的蛋白是常用的蛋白生产手段之一，其最大的优点为蛋白产量高、操作相对简便，目前已有不少成熟的原核表达系统。传统的重组蛋白表达与纯化通常是在目的蛋白前或后加上特定的标签(如GST tag、His tag等)，形成的融合蛋白可借助蛋白标签进行亲和层析，层析柱价格昂贵，使得蛋白纯化成本较高，且纯化的融合蛋白往往需进行体外裂解去除蛋白标签后才能获得很好生物学活性的目的蛋白，常用的裂解方法主要有化学裂解法(如溴化氰、羟胺、BNPS-3-甲基吲哚等)和酶解法(如fe 因子、凝血酶、肠激酶、胶原酶、凝乳酶等)。化学裂解虽价廉、有效，但由于裂解位点特异性低，还可能对目的蛋白产生不必要的修饰，该方法逐渐被酶解法代替，而酶解去除标签，所用的裂解酶价格不但高，还不可避免地混入目的蛋白中，造成新的污染，使得蛋白纯化更加复杂。有些原核表达系统在表达外源蛋白时，虽然不需要借助蛋白标签来进行纯化，但要想分离出表达的蛋白，往往还是离不开价格昂贵的层析柱(王艳，任启生等人在制备重组犬干扰素时就碰到相关问题)，由于上述原因，最终获得均一的目的蛋白成本高、周期长，成为制约体外规模化生产目的蛋白的瓶颈性问题。弹性蛋白样多肽(Elastin-likepolypeptide, ELP)是一 VPGXG (X 可为任何氨基酸)五肽组成重复序列，当孵育温度高于相变温度(Phase transition temperature, Tt) 时，可自发地从溶液中沉淀析出，而低于八时则呈现可溶状态，当与其他蛋白融合在一起时，仍具有该特性。弹力样多肽(Elastin-like polyp印tide，ELP)-蛋白内含肽(intein) 介导的新型大肠杆菌表达系统PELP-I相对其他原核表达系统在制备重组蛋白时，能有效避免昂贵的层析技术。具体方法是将外源基因插入载体PELP-I ELP-intein基因的下游， 在大肠杆菌工程菌中低温诱导融合蛋白ELP-Intein-重组蛋白融合体的表达。根据ELP 在1.5mol/L NaCl溶液中和高于Tt温度析出的特性，常规的离心法获得了较纯的融合蛋白 ELP-Intein重组蛋白；再利用htein自身切割作用释放出不含融合标签的重组蛋白，经再次离心去除ELP-Intein，获得了纯化的重组蛋白。此重组蛋白的分离纯化过程简单，不需专门设备，获得的重组蛋白无需用蛋白酶裂解去除融合标签，且纯度高和成本低，特别适合规模化生产和兽医临床使用，目前mi已用该方法纯化出绿色荧光蛋白，但在犬干扰素尤其是抗病性较强的中华田园犬重组CaIFNa的制备上未见应用
发明内容
为了解决现有的重组CaIFNa制备成本高问题，本发明构建了一新的CaIFN α重组原核表达载体，该载体便于CaIFNa重组蛋白的表达、纯化，且操作简便、纯化成本低，表达的重组CaIFN α不带有其他任何外源蛋白，经Tritonl 14处理，可去除其中的内毒素，这在重组犬α干扰素的规模化生产上有着很好的应用前景。本发明所述的重组中华田园犬α干扰素的制备方法，是将PCR扩增出的无信号肽中华田园犬α干扰素基因插入载体PELP-I-GFP限制性内切酶汉srG I、历idIII酶切位点之间，构建得到原核表达载体pELP-I-CaIFN-α ；再用pELP-I_CaIFN-α转化感受态宿主细胞，经温度诱导表达、纯化后，用TritonlH去除其中的内毒素得到重组中华田园犬α干扰素。
本发明方法包括如下步骤
1)中华田园犬α干扰素无信号肽基因的扩增
a.以P1、P2为引物，以中华田园犬总RNA为模板RT-PCR扩增出无信号肽的犬α干扰
素基因；
Pl gatgtacacaac^t^tgccacctgcccgacac3，，P2 ggaagctttcatttcctcctcctg3，； 其中Pl的5’端引入iferG I限制性核酸内切酶酶切位点，在无信号肽犬α干扰素基因前面添加起始密码子ATG，为了防止阅读框发生移码，iferG I限制性核酸内切酶酶切位点与ATG之间加上脱氧核糖核苷酸5’ caac3' ；P2的5’端引入历idIII限制性核酸内切酶酶切位点，为构建重组载体提供连接端；
2)将扩增的中华田园犬α干扰素基因经iferGI、历idIII限制性内切酶酶切后连入载体pELP-1-GFP相应的位点(ferG I,Hindlll限制性内切酶切除GFP基因后所得的大DNA 片段)，构建载体PELP-I-CaIFN- α ；
3)将载体pELP-1-CaIFN-α转化感受态的大肠杆菌宿主菌五coli BLR(DE3)，培养重组菌，20°C诱导宿主菌表达ELP-intein-CalFNa，4°C 4000rpm离心细菌裂解物10分钟，弃沉淀。上清中加入终浓度为1. 5mol/L的氯化钠溶液，37°C摇床上IOOrpm轻轻摇动15min 后，5000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用含0. 05%Tween 20的3mol/L的氯化钠溶液重悬， 5000rpm离心lOmin，重复2次。沉淀物种再加Iml裂解缓冲液(Cleaving buffer =PBS加 Λ 40mM Bis-Tris,pH6. 2,2mM EDTA) 37°C作用 4 小时以上。裂解结束后，加入 Iml 的 3mol/ L的氯化钠溶液，37°C摇床上IOOrpm摇15分钟以上，5000rpm离心lOmin，上清即为纯化的 CaIFN α。本发明所述的重组中华田园犬α干扰素的制备方法，还可以包括步骤4)纯化的重组CaIFN α中加入体积浓度为1% Tritonll4，37°C作用lh，5000rpm离心5min，吸出上层含CaIFN-α的水相溶液，去除在裂解细菌时残留的少量内毒素。上述方法中步骤2)连接时所用的DNA连接酶为Τ4 DNA连接酶。本发明利用基因工程技术，将编码中华田园犬α干扰素基因、内含肽基因以及 ELP基因串联，构建的原核表达载体，在大肠杆菌宿主菌中诱导表达三联融合蛋白，超声波破碎菌体后，低温离心，去除菌体碎片及不溶性蛋白，通过升温、添加氯化钠，促进ELP-内含肽-目的蛋白析出，离心去除可溶性的菌体杂蛋白，重复此过程可获得较纯净的重组融合蛋白。再利用内含肽在特定条件下的自我剪切活性及ELP融合蛋白的生物特性，经温控离心可将目的蛋白和ELP-内含肽融合蛋白分离，从而获得纯化的目的蛋白。残留的少量内毒素用低浓度的TritonlH去除，该过程操作简单，不需要昂贵的亲和层析柱和裂解酶，有效避免去除蛋白标签时酶蛋白的污染，大大降低了中华田园犬α干扰素生产成本，尤其是规模化生产成本。


图1. RT-PCR扩增中华田园犬无信号肽α干扰素基因片段
M =Lambda DNA/Ecol301 {Sty I )分子质量标准；1 :RT_PCR 扩增出的 CaIFNa。图2.重组载体pELP-1-CaIFNa酶切鉴定
M1 =Lambda DNA/Ecol301 (Sty I )分子质量标准；M2 低分子量DNA分子质量标准；1 BsrQ I、历bdIII酶切鉴定。图3. SDS-PAGE电泳分析CaIFNa表达、纯化
M 低分子量蛋白质标准；1 未诱导重组菌；2:低温诱导的重组菌；3:离心沉淀的ELP-intein-CalFN α前体蛋白；4 切割后的前体蛋白沉淀；5 切割后的离心上清 (CaIFNa )。图4.纯化的CaIFN α对MDCK细胞毒性试验
1 =CaIFNa作IO4倍稀释；2 =CaIFNa作IO5倍稀释；3 =CaIFNa作IO6倍稀释；4 空白对照。图5在MDCK细胞上CaIFN α抑制⑶V空斑形成
1 实验I组；2 实验II组；3 实验III组；4 对照I组；5 对照II组。
具体实施例方式本发明中所涉及的载体pELP-1-GFP为已公开的材料美国胁Wanyi博士惠赠 (B. A. Fong, W. Y. ffu, D. W. Wood. Optimization of ELP-intein mediated protein purification by salt substitution. Protein Expression and Purification, 2009, 66(2) :198-202.)。
实施例一中华田园犬α干扰素制备
1.用限制性核酸内切酶汉srGI,Hindlll酶切载体pELP_I_GFP，0. 8%琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物，胶中DNA回收试剂盒回收酶切大片段；
2.采集中华田园犬全血，分离出白细胞，ConA刺激白细胞后提取总RNA；
3.根据Genbank中发表的CaIFNα基因(Access NO. IC8624)设计一对正反向引物Pl 和P2，
Pl 5' gatgtacacaacai^tgccacctgcccgacac3‘ (SEQ ID NO. 1) P2 :5，ggaagctttcatttcctcctcctg3' (SEQ ID Ν0· 2)。在P1、P2的作用下，以提取的总RNA为模板RT-PCR扩增无信号肽的犬α干扰素基因，RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果扩增出预期大小的目的条带(图1)，凝胶中DNA 回收试剂盒回收该核酸，对其进行核酸序列测定序列SEQ ID而.3所示，其中16-51(^ 片段为不带信号肽的中华田园犬CaIFN-α基因。4.限制性内切酶^srG I、历idIII对3.中PCR产物进行酶切，乙醇溶液沉淀核酸，定量后与1.中回收的载体以摩尔比6 1的比例，在T4 DNA连接酶作用下16°C过夜连接，连接产物转化感受态的五coli BLR(DE3)，涂布LA固体培养基。1 后挑取长出的菌落，接种LA液体培养基继续培养12h，碱裂解法小规模提取质粒，以限制性内切酶iferG I、 Hindlll再次酶切质粒(图2)，鉴定构建的重组载体pELP-I-CaIFN-α。5.载体pELP-I-CaIFN-α转化感受态的大肠杆菌宿主菌五co/i BLR(DE3)，将重组菌1 100接种200mL TB液体培养基，37°C 300 r/min培养4小时(菌液OD值为 0. 5-0. 7)，培养温度降至20°C，150 r/min诱导表达M小时，同时设立未诱导的对照组。 40C 4000rpm离心诱导的细菌裂解物10分钟，弃沉淀。上清中加入终浓度为1. 5mol/L的氯化钠溶液，37°C摇床上IOOrpm轻轻摇动15min后，5000rpm离心lOmin，弃上清，沉淀用含 0. 05%Tween 20的3mol/L的氯化钠溶液重悬，5000rpm离心lOmin，重复2次。沉淀物种再加 Iml 裂解缓冲液(Cleaving buffer :PBS 加入 40mM Bis-Tris, pH6. 2,2mM EDTA) 37°C 作用4小时以上。裂解结束后，加入Iml的3mol/L的氯化钠溶液，37°C摇床上IOOrpm摇15 分钟以上，5000rpm离心lOmin，收集上清(纯化的CaIFN α )，SDS-PAGE分析上述每步骤中的产物，(图3)。6.在纯化的CaIFNa溶液中，加入1%的Tritonll4，37°C作用lh，去除其中的内毒素，再5000r/min离心5min，吸出上层的CaIFNa溶液，弃去沉在管底的Tritonll4。实施例二 制备的中华田园犬α干扰素生物活性分析
1.将去制备的CaIFNa定量成lmg/mL，用细胞维持液(含0.洲小牛血清的DMEM)分别作104、IO5UO6倍稀释后，分别用来维持M孔培养板中的MDCK细胞(细胞约铺满孔底80%) 生长，5% CO2培养箱37°C培养48h，同时设立空白对照，观察不同稀释度下细胞生长情况，检测CaIFN α溶液对细胞是否有毒性作用，结果表明制备的CaIFN α对MDCK细胞无任何毒性 (图 4)。2.将⑶V用DMEM培养液稀释后，感染M孔板中的MDCK细胞，感染病毒时，MDCK 细胞约铺满细胞板底部85%，感染病毒剂量为100个TCID50/孔。病毒吸附细胞Ih后，弃去病毒液；将lmg/mL的CaIFNa用细胞维持液稀释，加入感染⑶V的MDCK细胞，同时设立对照，具体操作见表l，72h时观察MDCK细胞空斑形成情况，结果制备的中华田园犬CaIFNa 稀释IO6后，仍能完全抑制病毒空斑形成，表明其具有较好的抗病毒效果(图5)。表1制备的中环田园犬CaIFNa对⑶V复制影响试验
权利要求
1.一种重组中华田园犬α干扰素的制备方法，是将PCR扩增出的无信号肽中华田园犬 α干扰素基因插入载体pELP-I-GFP限制性内切酶汉srG I、#i/ dIII酶切位点之间，构建得到原核表达载体pELP-I-CaIFN-α ；再用pELP-I_CaIFN-α转化感受态宿主细胞，经温度诱导表达、纯化后，用TritonlH去除其中的内毒素得到重组中华田园犬α干扰素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤1)以Ρ1、Ρ2为引物，以中华田园犬总RNA为模板RT-PCR扩增出无信号肽的犬α干扰素基因；Pl 5' gatgtacacaaGai^tgccacctgcccgacacS', P2 5' ggaagctttcatttcctcctcctg3'；2)将扩增的中华田园犬α干扰素基因、载体pELP-I-GFP都经汉srGΙ,Η η ΙΙΙ限制性内切酶酶切后，连接酶切片段，构建载体PELP-I-CaIFN-α ；3)将载体pELP-1-CaIFN-α转化感受态的大肠杆菌宿主菌五coli BLR(DE3)，培养重组菌，诱导表达CaIFN α，纯化表达的重组犬α干扰素。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于将步骤3)得到的纯化的重组CaIFNα用体积浓度1%的TritonlH处理，去除在裂解细菌时残留的内毒素。
全文摘要
本发明涉及一种重组犬α干扰素(CaIFNα)的制备方法。该方法将PCR扩增出的无信号肽中华田园犬α干扰素基因插入载体pELP-I限制性内切酶BsrGI、HindIII酶切位点之间，转化感受态宿主细胞，诱导表达后，利用弹性蛋白样多肽(ELP)生物学特性及内含肽(Intein)能自我切割特点，从而分离、纯化出表达的外源蛋白。利用该系统制备的重组犬α干扰素与其他表达系统相比，具有不带任何蛋白标签、纯化成本低、操作简便的特点，适用于重组干扰素的批量生产。
文档编号C12N15/70GK102492714SQ201110415960
公开日2012年6月13日 申请日期2011年12月10日 优先权日2011年12月10日
发明者刘文俊, 孙怀昌, 巢亦成, 张鑫宇, 朱善元, 王健 申请人:江苏畜牧兽医职业技术学院