促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域中的一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法。
【背景技术】
[0002]骨组织缺损是因外伤、感染、肿瘤等因素使机体丧失一些骨质从而形成较大间隙，这一问题在临床较为常见并且较难处理。如何促进骨组织缺损的修复，一直是该领域研究人员研究的重点。近年来，随着骨组织工程技术的发展，这一问题得到了一定程度的解决。在骨组织工程中需要支架材料和种子细胞的相互结合才能发挥其应有的作用，而种子细胞的选择尤为重要，早期研究人员选用骨细胞和骨髓基质细胞，但是这些种子细胞取材困难，容易对患者造成二次伤害。因此，研究人员将种子细胞的目标锁定在了间充质干细胞。间充质干细胞有着低免疫原性的特性，并且具有多向分化的潜能，在一定的条件下可分化为成骨细胞、成脂肪细胞和成软骨细胞等成熟的细胞。骨髓间充质干细胞(BMSCs)是间充质干细胞的一种，具有多向分化的潜能，并且植入体内后能进继续产生成骨活动。在这一过程中决定骨再生的关键转录因子RUNX和Osterix的基因表达均上调，以及骨再生早期的典型代表因子-骨桥蛋白基因(0ΡΝ)和碱性磷酸酶(ALP)亦会表达上调，但是要充分发挥骨髓间充质干细胞的成骨能力，首先在体外需要有成骨诱导液诱导的情况下其才能向成骨细胞方向分化，并且细胞诱导这一过程需要至少14天的时间。因此，如何缩短成骨诱导时间或避免成骨诱导这一步骤，显的尤为重要，本发明采用的一种新的培养体系，在骨髓间充质干细胞正常培养时使用本发明的培养体系，骨髓间充质干细胞在维持其原有干性的同时，决定成骨再生的相关因子的基因表达上调，为应用骨组织工程治疗骨缺损提供了必要的种子细胞，也为骨组织工程治疗骨缺损缩短了时间。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生相关基因表达上调的培养体系，采用本发明的培养体系培养骨髓间充质干细胞，骨髓间充质干细胞不仅保持较高的干性，而且促进骨髓间充质干细胞内成骨再生关键转录因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表达。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:
[0005]—种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，步骤如下:
[000?]⑴骨髓间充质干细胞的分离:获取无菌的骨髓，无菌条件下1500rpm离心5min;弃去上清液，使用无菌磷酸缓冲液反复冲洗，1500rpm离心5min，弃上清;磷酸缓冲液等倍稀释混勾沉淀，缓慢添加到淋巴分离液上，2000rpm离心20min ；收集白膜层单核细胞于新的无菌的离心管内，磷酸缓冲液清洗，1500rpm离心5min;弃上清，用培养液重悬沉淀，计数，以1 XlOVcm2接种至培养瓶中培养，培养液分别采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ；
[0007]⑵骨髓间充质干细胞的消化、传代，待骨髓间充质干细胞长至80%时，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化，以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中。
[0008]而且，取两种培养体系培养的第三代骨髓间充质干细胞进行流式鉴定，两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞阳性率均高于95%，阴性率均低于5% ;
[0009]而且，取第三代骨髓间充质干细胞，提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR，比较两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞成骨再生相关的转录因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0ΡΝ和ALP的表达量。
[0010]一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达体系，a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。
[0011]本发明的有益效果是:
[0012]⑴本发明采用一种新的培养体系，从骨髓间充质干细胞原代开始用该培养体系进行培养，与传统的培养体系相比较，本发明采用的培养体系培养出的骨髓间充质干细胞内决定成骨再生的关键转录因子(0SteriX、RUNX)的基因以及骨再生早期代表性因子的基因-骨桥蛋白(0ΡΝ)和碱性磷酸酶(ALP)明显高表达。
[0013]⑵应用本发明的培养体系培养骨髓间充质干细胞不仅骨髓间充质仍然保持较高的干性，而且其可以促进骨髓间充质干细胞成骨再生的关键转录因子(0SteriX、RUNX)和骨再生早期典型代表因子(0PN、ALP)的基因高表达，这为临床应用骨组织工程治疗骨缺损提供了理想的种子细胞。
[0014]⑶采用本发明的培养体系培养的骨髓间充质干细胞作为种子细胞用于骨组织工程治疗骨缺损，避免了骨髓间充质干细胞体外成骨诱导的步骤，为临床应用骨组织工程治疗骨缺损缩短了至少14天的时间。
【附图说明】
[0015]图1为Osterix的mRNA表达水平(相对荧光强度)；
[0016]图2为RUNX的mRNA表达水平(相对荧光强度)；
[0017]图3为0ΡΝ的mRNA表达水平(相对荧光强度)；
[0018]图4为ALP的的mRNA表达水平(相对荧光强度)；
【具体实施方式】
[0019]下面结合附图并通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。
[0020]—种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，步骤如下:
[°021 ]⑴骨髓间充质干细胞的分离:获取无菌的骨髓，无菌条件下1500rpm离心5min;弃去上清液，使用无菌磷酸缓冲液反复冲洗，1500rpm离心5min，弃上清;磷酸缓冲液等倍稀释混勾沉淀，缓慢添加到淋巴分离液上，2000rpm离心20min ；收集白膜层单核细胞于新的无菌的离心管内，磷酸缓冲液清洗，1500rpm离心5min;弃上清，用培养液重悬沉淀，计数，以1 X106/cm2接种至培养瓶中培养，培养液分别采用a-MEM+10%FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ；
[0022]⑵骨髓间充质干细胞的消化、传代，待骨髓间充质干细胞长至80%时，采用0.05%的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化，以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中；
[0023]⑶取两种培养体系培养的第三代骨髓间充质干细胞进行流式鉴定，两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞阳性率均高于95%，阴性率均低于5% ;
[0024]⑷取第三代骨髓间充质干细胞，提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR，比较两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞成骨再生相关的转录因子(Osterix、RUNX)基因和骨再生早期典型代表因子基因(0PN、ALP)的表达量。
【主权项】
1.一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，其特征在于:步骤如下: ⑴骨髓间充质干细胞的分离:获取无菌的骨髓，无菌条件下1500rpm离心5min;弃去上清液，使用无菌磷酸缓冲液反复冲洗，1500rpm离心5min，弃上清;磷酸缓冲液等倍稀释混勾沉淀，缓慢添加到淋巴分离液上，2000rpm离心20min ；收集白膜层单核细胞于新的无菌的离心管内，磷酸缓冲液清洗，1500rpm离心5min;弃上清，用培养液重悬沉淀，计数，以1 X 106/cm2接种至培养瓶中培养，培养液分别采用a-MEM+10 %FBS和a-MEM+5 %血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1 ； ⑵骨髓间充质干细胞的消化、传代，待骨髓间充质干细胞长至80 %时，采用0.05 %的胰蛋白酶+0.02%的EDTA对其进行消化，以1 X 104cells/cm2传至新的培养瓶中。2.根据权利要求1所述的促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，其特征在于:取两种培养体系培养的第三代骨髓间充质干细胞进行流式鉴定，两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞阳性率均高于95%，阴性率均低于5%。3.根据权利要求1所述的促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，其特征在于:取第三代骨髓间充质干细胞，提取RNA-反转录获得cDNA-进行Q-PCR，比较两种培养体系培养的骨髓间充质干细胞成骨再生相关的转录因子Oster ix和RUNX基因和骨再生早期典型代表因子基因0PN和ALP的表达量。4.一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达体系，其特征在于: a-MEM+5%血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。
【专利摘要】本发明涉及一种促进骨髓间充质干细胞成骨再生关键基因高表达的方法，步骤如下：骨髓间充质干细胞的分离：获取无菌的骨髓，经过前处理用培养液重悬沉淀，计数，以1×106/cm2接种至培养瓶中培养，培养液分别采用a-MEM+10％FBS和a-MEM+5％血小板裂解物+50mg/ml抗坏血酸+10nmol/L胰高血糖素样肽-1。采用本发明的培养体系培养的骨髓间充质干细胞作为种子细胞用于骨组织工程治疗骨缺损，避免了骨髓间充质干细胞体外成骨诱导的步骤，为临床应用骨组织工程治疗骨缺损缩短了至少14天的时间。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105441389
【申请号】CN201510934333
【发明人】赵刚, 马洁, 刘微微, 高伟玮
【申请人】天津市康婷生物工程有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月15日