一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法
【技术领域】
[0001]本发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，尤其涉及采用酶消化法来进行小鼠阴道上皮的原代培养方法。
【背景技术】
[0002]对小鼠阴道上皮细胞的体外培养，国内外有研究采用组织块法培养阴道上皮细胞，虽然操作简单，但耗时长，传代周期长。
[0003]近年来用酶消化法分离出小鼠阴道上皮层，继续用酶消化法消化上皮层为单细胞悬液，成功培养后用于组织工程化阴道研究，但由于在小鼠阴道上皮原代培养过程中，获取细胞数量少、不能贴壁以及传代能力差等问题，目前还没有在较短时间内获得大量、高纯度种子细胞，用于对阴道上皮的生理、病理变化，癌变过程的观察和组织工程的构建。因此如何克服现有技术的不足是目前细胞培养技术领域亟需解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，该方法不仅操作方便，而且获取的细胞数量大，纯度高，活力多，且能稳定的传代4-5代，能对阴道上皮的生理、病理变化，癌变过程及组织工程化阴道的构建提供种子细胞。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下:
一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，包括如下步骤:
步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成(0.9-1.l)cmX (0.4-0.6)cm大小，然后用4°〇含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:1.9-2.1的体积比混合，4°C冰箱过夜；
步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:1.9-2.1的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织9.5-10.5min，然后用无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散，再于37°C消化阴道上皮组织9.5-10.5min后，再次无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；
步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液离心，弃上清，然后再加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-1.5倍的重悬细胞，再次离心，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105-1*106个/ml，放于培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，换液时，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1_2倍的PBS以洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的6-7倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
[0006]进一步，优选的是步骤(3)所述的离心速度为900_1100r/min，离心时间为4_6min。
[0007]进一步，优选的是步骤(3)所述的离心速度为1000r/min，离心时间为5min。
[0008]进一步，优选的是所述的小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，包括如下步骤:
步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成lcm X 0.5cm大小，然后用4°C含双抗的作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型(Dispase Π )按照1:2的体积比混合，4°C冰箱过夜；
步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1: 2的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织lOmin，然后无菌抢头轻轻吹打上皮层30s，再于37°C消化阴道上皮组织lOmin后，再次轻轻吹打上皮层30s后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；
步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液于1000r/min的速度下离心5min，弃上清，然后再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-1.5倍的?83重悬细胞，再次1000r/min的速度下离心5min后，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105_1*106个/ml，放于25cm2的培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-2倍的PBS轻轻摇晃瓶子，洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的6-7倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
[0009]本发明与现有技术相比，其有益效果为:
本发明采用酶分步消化法进行培养细胞，不仅操作方便，而且获取的细胞数量是组织消化法的2-3倍，纯度可达90%以上，活力达90%以上，且能稳定的传代4-5代，能对阴道上皮的生理、病理变化，癌变过程及组织工程化阴道的构建提供种子细胞。
【附图说明】
[0010]图1为光镜下(10X)原代细胞培养至第二天的生长情况；
图2为光镜下(10 X)原代细胞培养至第四天的生长情况；
图3为光镜下(10 X)原代细胞培养至第六天的生长情况；
图4为光镜下(10 X)原代细胞培养至第八天的生长情况；
图5为光镜下(40 X)的HE染色图；
图6为光镜下(20 X)的HE染色图；
图7为光镜下(10 X)的HE染色图；
图8为光镜下(4 X)的HE染色图；
图9为电镜下(X 2.0k)原代细胞培养至第二天的生长情况；
图10为电镜下(X 1.0k)原代细胞培养至第四天的生长情况；
图11为电镜下(X 1.0k)原代细胞培养至第六天的生长情况；
图12为电镜下(X 300)原代细胞培养至第八天的生长情况；
图13为光谱抗角蛋白(P-CK，40X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图；
图14为光谱抗角蛋白(P-CK，20X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图； 图15为光谱抗角蛋白(P-CK，10X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图；
图16为细胞角蛋白5/6(CK5/6，40X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图；
图17为细胞角蛋白5/6(CK5/6，20X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图；
图18为细胞角蛋白5/6(CK5/6，10X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图；
图19为细胞角蛋白5/6(CK5/6，4X)免疫组织化学染色培养至第四天的原代细胞图。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0012]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规广品。
[0013]含双抗的PBS:含青霉素100U/mL，链霉素100U/mL，购自于Solar 1 ；
EPILIFE:含0.02 mM氯化|丐(Gali2)，膜岛素生长因子-l(Insulin_Growth Factor-1)5yg/ml，氢化可的松(Hydrocortisone)0.18mg/mL，牛转铁蛋白(Bovine Transferrin) 2.5mg/mL ,庆大霉素/两性霉素B(Gentamicin/AmphotericinB) lmL，表皮生长因子(epidemal growth factor ,EGF) 200ng/mL，牛脑垂体提取物(bovine pituitaryextract,ΒΡΕ) 24 mg protein/mL，购自于GIBIC0;
含10%胎牛血清(v/v)的DMEM/F12:购自于GIBIC0;
0.25% 胰酶-0.02%EDTA，购自于 GIBIC0 ；
胎牛血清(FBS)，购自于sigma;
中性蛋白酶Π型(Dispase Π)，购自于sigma。
[0014]实施例1
一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤:
步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成0.9cmX0.6cm大小，然后用4°C含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:1.9的体积比混合，4°C冰箱过夜；
步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:1.9的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织9.5min，然后用无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散，再于37°C消化阴道上皮组织9.5min后，再次无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；
步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液于1100r/min的速度下离心4min，弃上清，然后再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1倍的PBS重悬细胞，再次1100r/min的速度下离心4min后，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105_1*106个/ml，放于培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，换液时，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1倍的PBS以洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的6倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
[0015]实施例2
一种