小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤:
步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成l.lcmX0.4cm大小，然后用4°C含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:2.1的体积比混合，4°C冰箱过夜；
步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:2.1的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织10.5min，然后用无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散，再于37°C消化阴道上皮组织10.5min后，再次无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；
步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液于900r/min的速度下离心6min，弃上清，然后再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1.5倍的PBS重悬细胞，再次900r/min的速度下离心6min后，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105_1*106个/ml，放于培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，换液时，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的2倍的roS以洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去roS后，再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-
0.02%EDTA体积的7倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
[0016]实施例3
一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，包括如下步骤:
步骤(1)，取1只小鼠离体的阴道组织，将其剪成lcmx0.5cm大小置于6孔板内，然后用4°〇含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，直至最后一次清洗的PBS不浑浊，共lOmin，将阴道组织转移至新的6孔板内，加入lml 2U/ml的Dispase Π 2m 1 4°C冰箱过夜；
步骤(2)，在超净台上，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织用眼科镊进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，往6孔板内加入0.25%胰酶-0.02%EDTA lml，于37°C消化阴道上皮层组织lOmin，然后无菌抢头轻轻吹打上皮层30s，再于37°C消化阴道上皮组织lOmin后，再次轻轻吹打上皮层30s后，加入lml含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液；
步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液于1000r/min的速度下离心5min，弃上清，然后再加入1.3ml的roS重悬细胞，再次1000r/min的速度下离心5min后，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105-1*106个/ml，放于25cm2的培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，用无菌枪头弃去旧培养基，加入1.5ml的PBS轻轻摇晃瓶子，洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入6.7ml的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的⑶2培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
[0017]图1-图4记录了光镜下原代细胞培养的生长情况。随着时间的增长，酶消化的原代阴道上皮细胞24h后大部分贴壁并逐渐伸展，培养7-8d汇合度达80-90%，具有上皮细胞特性，呈多角形，轮廓清晰，折光性强，呈铺路石样生长。
[0018]图5至图8，从不同光镜倍数下的HE染色图中可以看出，细胞核呈蓝色圆形，胞浆红色，均质，细胞呈成片铺路石状平铺，具有上皮细胞的形态学。
[0019]图9-图12记录了电镜下原代细胞培养的生长情况。从图中可以看出，随着时间的增长，细胞密度变大，细胞形态从刚开始贴壁的圆形到展开触角平铺在瓶底多角形样子，扫描电镜下上皮细胞呈镶嵌排列，细胞间界限清楚，表面布满质膜皱褶微绒毛，呈不规则疏网状，称为微绒毛嵴。细胞边缘因对接而增厚，微绒毛嵴则变密变短，形成清楚的分界线。细胞核呈圆形或椭圆形
图13-图19为上皮细胞免疫化学染色;光谱抗角蛋白(P-CK)染色的细胞，胞浆呈棕黄色，均为广谱角蛋白阳性细胞，表明细胞均为上皮细胞，无成纤维细胞污染。CK5/6染色的细胞，胞浆成棕黄色，均为CK5/6阳性细胞，表明细胞均为鳞状上皮细胞。
[0020]本发明小鼠离体的阴道组织的制备方法可以为:取小鼠，称重记录后，断颈处死，提尾巴泡于含有75%酒精150ml的烧杯20s，避免将酒精浸入阴道。将烧杯外壁，预先高压灭菌的解剖器材盒，PBS，Dispase Π，6孔板*2个喷酒精后置于超净工作台中。取饭盒盖作小鼠解剖平台，其上铺无菌纱布，小鼠取仰卧位，用固定夹固定小鼠四肢，止血钳提取腹中线皮肤，剪刀由腹中线剪开，暴露腹部肌肉，换取新的两把止血钳和剪刀由腹中线剪开肌肉，充分暴露腹腔，将无菌纱布剪成半径lcm洞巾，只露出腹腔，边缘超出小鼠头，四肢。沿着双角子宫下端找到阴道，充分剥离周围结缔组织，取新剪刀分别从宫颈口和阴道口处向上5mm处剪断，取阴道组织，即为本发明小鼠离体的阴道组织。
[0021]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成(0.9-1.l)cmX (0.4-0.6)cm大小，然后用4°〇含双抗的PBS作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:1.9-2.1的体积比混合，4°C冰箱过夜； 步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1:1.9-2.1的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织9.5-10.5min，然后用无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散，再于37°C消化阴道上皮组织9.5-10.5min后，再次无菌枪头吹打上皮层至消化的阴道上皮层组织细胞吹散后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液； 步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液离心，弃上清，然后再加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-1.5倍的重悬细胞，再次离心，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105-1*106个/ml，放于培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，换液时，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1_2倍的PBS以洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的6-7倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。2.根据权利要求1所述的小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心速度为900-1100r/min，离心时间为4_6min。3.根据权利要求1所述的小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，步骤(3)所述的离心速度为1000r/min，离心时间为5min。4.根据权利要求1所述的小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，其特征在于，包括如下步骤: 步骤(1)，取小鼠离体的阴道组织，将其剪成lcm X 0.5cm大小，然后用4°C含双抗的作为清洗液进行清洗，清洗至清洗液澄清后，将阴道组织与2U/ml的中性蛋白酶Π型按照1:2的体积比混合，4°C冰箱过夜； 步骤(2)，将经步骤(1)过夜培养的阴道组织进行分离，分离出上皮层组织和固有层组织，弃固有层组织，然后将上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA按照1: 2的体积比混合，于37°C消化阴道上皮层组织lOmin，然后无菌抢头轻轻吹打上皮层30s，再于37°C消化阴道上皮组织lOmin后，再次轻轻吹打上皮层30s后，加入与0.25%胰酶-0.02%EDTA同体积的含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到细胞悬液； 步骤(3)，将步骤(2)得到的细胞悬液通过200目尼龙滤膜过滤，取滤液，然后将滤液于1000r/min的速度下离心5min，弃上清，然后再加入是步骤(1 )0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-1.5倍的?83重悬细胞，再次1000r/min的速度下离心5min后，弃上清，加入EPILIFE重悬，使细胞密度达到1*105_1*106个/ml，放于25cm2的培养瓶内，然后置于37°C、5%C02培养箱培养，第2天后首次换液，用无菌枪头弃去旧培养基，加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的1-2倍的PBS轻轻摇晃瓶子，洗去漂浮的细胞和残留的旧培养基，弃去PBS后，再加入是步骤(1)0.25%胰酶-0.02%EDTA体积的6-7倍的新的EPILIFE，继续放入37°C、5%C02的C02培养箱培养，以后每两天换液1次;到第7-9天细胞的融合度达到80%-90%，就可传代。
【专利摘要】本发明涉及一种小鼠阴道上皮细胞体外培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明将小鼠离体的阴道组织剪成1cm×0.5cm大小后进行清洗，然后用Dispase？Ⅱ过夜培养，再将过夜培养的阴道组织进行分离，弃固有层组织，上皮层组织与0.25%胰酶-0.02%EDTA混合后进行消化，最后采用含10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，得到的细胞悬液经过滤、离心后，依次采用PBS、EPILIFE重悬，然后置于37℃、5%CO2培养箱培养，2天后首次换液，以后每两天换液1次。该方法不仅操作方便，而且获取的细胞数量大，纯度高，活力多，且能稳定的传代4-5代，能对阴道上皮的生理、病理变化，癌变过程及组织工程化阴道的构建提供种子细胞。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105441380
【申请号】CN201511020525
【发明人】祁文瑾, 刘燕燕
【申请人】祁文瑾
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月30日